Name: imaging neurons within thick brain sections using the golgi-cox method
Uploaded: 2017-04-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי דיסקברי גרנט כדי CDCB מן למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC), מענק התשתית המחקרית קרן מנהיגים ג&#39;ון ר אוונס כדי CDCB מקנדה קרן חדשנות (מספר הפרוייקט CFI 30,381), ועל ידי דיסקברי גרנט כדי NJM מן NSERC. ELL נתמכה על ידי מלגת בוגר אונטריו ידי מלגות OVC מהמכללה וטרינרית אונטריו באוניברסיטת Guelph. CDS נתמכה על ידי משרת אסיסטנט מחקר סטודנט לתואר ראשון מ NSERC. ALM נתמכה על ידי מלגת אלכסנדר גרהם בל מ NSERC ועל ידי מלגות OVC מהמכללה וטרינרית אונטריו באוניברסיטת Guelph.

עכברות CD1-זן למבוגרים שימשו במחקר זה. מכתים דומה ניתן להשיג באמצעות שני המינים בגילאים שונים. חיות ניסוי טופלו על פי העקרונות והקווים המנחים של המועצה הקנדית על טיפול בבעלי החיים, וכן את פרוטוקול הניסוי אושר על ידי האוניברסיטה של ​​ועדת Care Guelph Animal. <p class="jove_title" style=";...

<ol>
	<li>Golgi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulla+struttura+della+sostanza+grigia+del+cervello.">Sulla struttura della sostanza grigia del cervello.</a> Gazzetta Medica Italiana. Lombardia. 33, 244-246 (1873).</li><li>Cox, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impr&#228;gnation+des+centralen+Nervensystems+mit+Quecksilbersalzen.">Impr&#228;gnation des centralen Nervensystems mit Quecksilbersalzen.</a> Archiv f. mikrosk. Anat. 37, 16-21 (1891).</li><li>Zaqout, S., Kaindl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi-Cox+Staining+Step+by+Step.">Golgi-Cox Staining Step by Step.</a> Front Neuroanat. 10, 38 (2016).</li><li>Levine, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+thin+tissue+Golgi-Cox+impregnation:+fast,+reliable+methods+for+multi-assay+analyses+in+rodent+and+non-human+primate+brain.">Advances in thin tissue Golgi-Cox impregnation: fast, reliable methods for multi-assay analyses in rodent and non-human primate brain.</a> J Neurosci Methods. 213 (2), 214-227 (2013).</li><li>Ranjan, A., Mallick, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+method+for+consistent+and+reliable+Golgi-Cox+staining+in+significantly+reduced+time.">A modified method for consistent and reliable Golgi-Cox staining in significantly reduced time.</a> Front Neurosci. 1, 157 (2010).</li><li>Gibb, R., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+vibratome+sectioning+of+Golgi-Cox+stained+whole+rat+brain.">A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain.</a> J Neurosci Methods. 79 (1), 1-4 (1998).</li><li>Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+Golgi+staining+protocol+for+use+in+the+human+brain+stem+and+cerebellum.">A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum.</a> J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).</li><li>Narayanan, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appraisal+of+the+effect+of+brain+impregnation+duration+on+neuronal+staining+and+morphology+in+a+modified+Golgi-Cox+method.">Appraisal of the effect of brain impregnation duration on neuronal staining and morphology in a modified Golgi-Cox method.</a> J Neurosci Methods. 235, 193-207 (2014).</li><li>Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Golgi-Cox+method.">The Golgi-Cox method.</a> Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).</li><li>Sutherland, R., Gibb, R., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hippocampus+makes+a+significant+contribution+to+experience-dependent+neocortical+plasticity.">The hippocampus makes a significant contribution to experience-dependent neocortical plasticity.</a> Behav Brain Res. 214 (1), 121-124 (2010).</li><li>Hamilton, G. F., Whitcher, L. T., Klintsova, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+binge-like+alcohol+exposure+decreases+dendritic+complexity+while+increasing+the+density+of+mature+spines+in+mPFC+Layer+II/III+pyramidal+neurons.">Postnatal binge-like alcohol exposure decreases dendritic complexity while increasing the density of mature spines in mPFC Layer II/III pyramidal neurons.</a> Synapse. 64 (2), 127-135 (2010).</li><li>Nashed, M. G., Seidlitz, E. P., Frey, B. N., Singh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depressive-like+behaviours+and+decreased+dendritic+branching+in+the+medial+prefrontal+cortex+of+mice+with+tumors:+A+novel+validated+model+of+cancer-induced+depression.">Depressive-like behaviours and decreased dendritic branching in the medial prefrontal cortex of mice with tumors: A novel validated model of cancer-induced depression.</a> Behav Brain Res. 294, 25-35 (2015).</li><li>Frauenknecht, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+with+experimental+antiphospholipid+syndrome+display+hippocampal+dysfunction+and+a+reduction+of+dendritic+complexity+in+hippocampal+CA1+neurones.">Mice with experimental antiphospholipid syndrome display hippocampal dysfunction and a reduction of dendritic complexity in hippocampal CA1 neurones.</a> Neuropathol Appl Neurobiol. 41 (5), 657-671 (2015).</li><li>Camacho-Abrego, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearrangement+of+the+dendritic+morphology+of+the+neurons+from+prefrontal+cortex+and+hippocampus+after+subthalamic+lesion+in+Sprague-Dawley+rats.">Rearrangement of the dendritic morphology of the neurons from prefrontal cortex and hippocampus after subthalamic lesion in Sprague-Dawley rats.</a> Synapse. 68 (3), 114-126 (2014).</li><li>Redila, V. A., Christie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-induced+changes+in+dendritic+structure+and+complexity+in+the+adult+hippocampal+dentate+gyrus.">Exercise-induced changes in dendritic structure and complexity in the adult hippocampal dentate gyrus.</a> Neuroscience. 137 (4), 1299-1307 (2006).</li><li>Bailey, C. D., Alves, N. C., Nashmi, R., De Biasi, M., Lambe, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+alpha5+subunits+drive+developmental+changes+in+the+activation+and+morphology+of+prefrontal+cortex+layer+VI+neurons.">Nicotinic alpha5 subunits drive developmental changes in the activation and morphology of prefrontal cortex layer VI neurons.</a> Biol Psychiatry. 71 (2), 120-128 (2012).</li><li>Lytton, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> From computer to brain : foundations of computational neuroscience. , (2002).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).</li><li>Ha, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+Golgi-Cox+method+with+counterstain+for+the+study+of+synapses.">A modified Golgi-Cox method with counterstain for the study of synapses.</a> Anat Rec. 155 (1), 59-64 (1966).</li><li>Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+locus+coeruleus:+a+cytoarchitectonic,+Golgi+and+immunohistochemical+study+in+the+albino+rat.">The locus coeruleus: a cytoarchitectonic, Golgi and immunohistochemical study in the albino rat.</a> Brain Res. 110 (1), 39-56 (1976).</li><li>Pilati, N., Barker, M., Panteleimonitis, S., Donga, R., Hamann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+combining+Golgi+and+Nissl+staining+to+study+neuronal+morphology+and+cytoarchitecture.">A rapid method combining Golgi and Nissl staining to study neuronal morphology and cytoarchitecture.</a> J Histochem Cytochem. 56 (6), 539-550 (2008).</li></ol>

אנו מתארים כאן פרוטוקול מכתים גולגי-קוקס יחד עם שתי הגירסות שימושיות המאפשרים הדמיה נוירונים בתוך חלקים במוח עבים. כפי שניתן לראות תוצאות הנציג, השימוש מטרה ברזולוציה גבוהה כי יש מרחק 800 מיקרומטר עבודה ארוך מאפשר הדמיה של נוירונים אמינות כולו ברחבי העומק חלק במוח לח?...

הדמיה של נוירונים בודדים בתוך דגימות רקמה מאפשר לניתוח באתרו של מאפיינים מורפולוגיים נוירון, אשר באופן משמעותי קידם את ההבנה שלנו של המוח ואיך זה עלול להיות מושפע המחלה אנדוגניים או גורמים סביבתיים חיצוניים. השיטה המכתימה גולגי-קוקס היא אמצעי פשוט יחסית, חסכוני של מכתים מדגם אקראי של תאי עצב במוח. ראשון שפותח על ידי גולגי 1 ו שונה על ידי קוקס 2 בשנת 1800, חוקר מעודן יותר טכניקה זו לאורך השנים לייצר ברור, נוירונים גם בכתמי רטיבות, יכול לשמש כדי לחזות ולכמת הוא מורפולוגיה עץ הדנדריטים וצפיפות עמוד שדרת 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9. שיקול טכני עיקרי עבור להדמיה של נוירונים מוכתמים בתוך חלקים במוח הוא עובי הפרוסה המרבי, אשר מוגבל על ידי מרחק העבודה של מטרות מיקרוסקופ גבוהה הגדלה זמינות / ברזולוציה גבוהה. מטרות נפט טבילה נפוצות 60 - 100X טווחים מהוות ברזולוציה מעולה, אבל הם מוגבלות על ידי מרחקי העבודה שלהם, כי הם בדרך כלל לא יותר מ 200 מיקרומטר. חלקים במוח לחתוך בטווח 200 מיקרומטר יכול להיות מספיק כדי להמחיש סוגי נוירונים מסוימים שיכולים להיות בתוך עובי פרוסה זה, עבור עצב פירמידליים למשל בשכבות רדודות של קליפת המוח 10, 11, 12, עצב פירמידליים באזור CA1 של 13, 14 בהיפוקמפוס, וכן תאי גרגיר של gyrus המשוננת של ההיפוקמפוס 15. נוירונים עם יחסית יותרהעצים הדנדריטים, כגון עצב פירמידליים בתוך רבדים עמוקים של קליפת המוח כי לעכבר יכול להאריך יותר מ 800 מיקרומטר מגוף התא 16, מספקים אתגר גדול כי המוח היה צריך להיות מחולק בזווית מושלמת להכיל את העץ דנדריט כולו בתוך 200 מיקרומטר פרוסות. זה לא יכול אפילו להיות ריאלי אם דנדריט או כל ענפיו להאריך בכיוון המקורי או זנב. למרות זאת, ניתן להתייחס מגבלה זו על ידי התחקות נוירון בקטעים שונים במוח מרובים הסמוכים, גישה זו מציבה אתגר טכני משמעותי יישור הסעיפים במדויק עבור התחקות 17. גישה מעשית יותר תהיה לדמיין נוירונים כולו בתוך חלקים במוח כי נחתכים על עובי גדול יותר. אנו מדווחים כאן טכניקה להכתים נוירונים בתוך 400 - 500 מיקרומטר חלקים במוח עבה של עכברים באמצעות שיטת גולגי-קוקס, וכדי להמחיש mo שלהםrphology באמצעות טבילה אובייקטיבי שמן סיליקון ברזולוציה גבוהה כי יש מרחק עבודה 800 מיקרומטר. פרוטוקול גולגי-קוקס ההספגה ועיבוד שאנחנו מתארים משתנה מאחד הפרוטוקולים המודרניים ביותר המצוטטים בספרות 6. הגישה שלנו עם חלקים במוח עבים מספקת את היתרון של הגדלת ההסתברות של זיהוי נוירונים מכל סוג כלול במלואה בתוך הקטע. בנוסף הפרוטוקול העיקרי, אנו נוכחים גם שתי וריאציות המספקות יתרונות ייחודיים: (1) מכתים גולגי-קוקס עם counterstain הסגול cresyl על פני השטח של חלקים רכובים, על מנת להגדיר גבולות אזורים במוח כדי לזהות שכבות של קליפת המוח, ו (2) מכתים גולגי-קוקס עם צעד הקפאה ביניים עבור אחסון לטווח ארוך של המוח כולו ספוג לפני חתך ועיבוד סופי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="775">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">potassium dichromate</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">P188-100</td>
			<td style="width:167px;">Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">potassium chromate</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">P220-100</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">mercuric chloride</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">S25423</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Whatman grade 1 filter paper</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">1001-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">isoflurane</td>
			<td style="width:147px;">Pharmaceutical Partners of Canada</td>
			<td style="width:175px;">CP0406V2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">20 mL scintillation vial</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">03-337-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">sucrose</td>
			<td style="width:147px;">Bioshop Canada</td>
			<td style="width:175px;">SUC700.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">S5011-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">S9390-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">50 mL conical tube</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">12-565-271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">isopentane</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">AC126470010</td>
			<td>also known as 2-methylbutane. Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">agar</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">A1296-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">small weigh dish</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">02-202-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">vibratome</td>
			<td style="width:147px;">Leica</td>
			<td style="width:175px;">VT1000 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">6 well tissue culture plates</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">08-772-1b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">mesh bottom tissue culture inserts</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">07-200-214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:288px;">paraformadelhyde, 16%</td>
			<td style="width:147px;">Electron Microscope Sciences</td>
			<td style="width:175px;">15710-S</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">ammonium hydroxide</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">A669S-500</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Kodak Fixative A</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">P7542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">superfrost plus slides</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">CitroSolv clearing agent</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">22-143-975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">anhydrous ethyl alcohol</td>
			<td style="width:147px;">Commercial Alcohols</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">cresyl violet</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">C1791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">permount</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">SP15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">upright microscope</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:175px;">BX53 model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">colour camera, 12 bit</td>
			<td style="width:147px;">MBF Biosciences</td>
			<td style="width:175px;">DV-47d</td>
			<td style="width:167px;">QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:288px;">three-dimensional motorized microscope stage, controller and enoders</td>
			<td style="width:147px;">MBF Biosciences</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td>Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">4x microscope objective</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:175px;">4x 0.16 N.A. UplanSApo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">10x microscope objective</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:175px;">10x 0.3 N.A. UPlan FL N&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">30x microscope objective</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td>30x 1.05 N.A. UPlanSApo&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">60x microscope objective</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td>60x 1.42 N.A. PlanAPO N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">silicone immersion oil</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:175px;">Z-81114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Neurolucida software</td>
			<td style="width:147px;">MBF Biosciences</td>
			<td style="width:175px;">Version 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:147px;">U. S. National Institutes of Health</td>
			<td style="width:175px;">Current version</td>
			<td>With the OME Bio-Formats plugin installed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Photoshop software</td>
			<td style="width:147px;">Adobe</td>
			<td style="width:175px;">version CS6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging neurons within thick brain sections using the golgi-cox method

שיטת גולגי-קוקס של מכתים נוירון הועסקה במשך יותר ממאתיים שנים כדי לקדם את ההבנה שלנו של מורפולוגיה הנוירון בתוך דגימות מוח היסטולוגית. אמנם עדיף מנקודת מבט מעשי להכין חלקים במוח על העובי הרב ככל האפשר, על מנת להגדיל את ההסתברות לזיהוי נוירונים צבעונית כלולות מלאות בקטעים בודדים, גישה זו היא מוגבלת מבחינה טכנית על ידי מרחק העבודה של גבוה -magnification מטרות מיקרוסקופ. אנו מדווחים כאן פרוטוקול להכתים נוירונים בשיטת גולגי-קוקס בסעיפים המוח העכבר כי נחתכות על עובי 500 מיקרומטר, וכדי להמחיש נוירונים ברחבי עומק סעיפים אלה באמצעות מיקרוסקופ זקוף מצויד סיליקון 30X ברזולוציה גבוהה 1.05 NA מטרת נפט טבילה כי יש מרחק עבודת 800 מיקרומטר. בנוסף, אנו מדווחים שתי הגירסות שימושיות של פרוטוקול זה שעשוי להיות מועסק על מנת counterstain פני השטח שלרכוב חלקים במוח עם כתם Nissl סגול cresyl, או להקפיא את המוח כולו עבור אחסון לטווח ארוך לפני חתך ועיבוד סופי. הפרוטוקול העיקרי ושתי גרסותיה לייצר חלקים במוח עבים צבעוניים, ברחבי אשר עצי דנדריטים נוירון מלאים קוצי דנדריט ניתן דמיינו בצורה מהימנה לכמת.

פרוטוקול מכתים גולגי-קוקס זה והגירסות האופציונליות שניית תיאר שלה עשויים להיות מועסקים על מנת להמחיש נוירונים בודדים בתוך 400 - 500 מיקרומטר חלקים במוח עבה. מצרפי תמונה נציג תחזיות-Z דו ממדים שנתפסו באמצעות מטרת 10X ו 5 מיקרומטר שלבי ציר Z מוצגים באיו...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method at JoVE.com

Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method

אנו מציגים פרוטוקול בשיטת מכתים גולגי-קוקס בסעיפי מוח עבים, כדי להמחיש נוירונים עם עצי דנדריטים ארוכים בתוך דגימות רקמה אחת. שתי גרסאות של פרוטוקול זה גם מוצגים שכוללות counterstaining סגול cresyl, והקפאת המוח מעובד עבור אחסון לטווח ארוך.

נוירונים הדמיה בתוך חלקים במוח עבים שימוש בשיטת גולגי-קוקס

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within ...

The overall goal of this procedure is to determine the effective treatment on the morphology of neurons within the rodent brain. This method can help answer key questions in the neuroscience field, such as the normal and experimentally manipulated morphology of neurons within various regions of the rodent brain. This technique has the main advantage of increasing the probability of identifying and visualizing labeled neurons that are fully contained within single histological samples.Begin Golgi-Cox staining by placing a fresh mouse brain into a 20 milliliter glass scintillation vial containing 17 milliliters of Golgi-Cox solution. Protect from light and incubate at room temperature for 25 days. Once the incubation period has elapsed, Cryo protect the brain by placing it into 40 milliliters of sucrose cryoprotectant, and incubate in the dark at 4 degrees celsius for 24 hours.After the incubation in sucrose, the brain can be frozen for long term storage, or immediately blocked for sectioning as shown in the next section of the video. If freezing, immerse the whole brain in 200 milliliters of isopentane that has been precooled on dry ice. Then place the frozen brain into a 50 milliliter conical tube and store in the dark at minus 80 degrees celsius.To begin, remove the brain from the sucrose. And use a razor blade to block it for sectioning by cutting off the cerebellum, leaving a flat edge at the remaining caudal end of the brain. The brain must be blocked at a precise angle to ensure that neurons of interest are fully contained within the resulting sections.For example, we use a coronal plane that is perfectly perpendicular to the rostral caudal axis for cerebral cortex pyramidal neurons. Next, heat agar until it is melted. And let it cool until it is slightly above it's melting point.Then place the brain in a small disposable weigh dish with the caudal end face down. Add melted agar to cover the brain. Once the agar has solidified, trim the excess leaving approximately two to four milliliters surrounding the brain.Then use a small amount of ethyl cyanoacrylate to glue the brain to the stage of a vibratome with it's caudal end face down. Fill the stage area of the vibratome with enough sucrose cryoprotectant to cover the brain. Then section the brain at a slice thickness of 400 to 500 microns depending on the brain region to be examined.Using a small paintbrush, place brain sections into wells of a six well tissue culture plate containing mesh bottom inserts and pre filled with sucrose M phosphate buffer. Protect from light during sectioning. When finished sectioning, incubate sections in the dark at four degrees celsius overnight.Using the mesh bottom inserts, transfer the brain sections into a new well containing five milliliters of paraformaldehyde in phosphate buffer. Incubate on a rocker moving at slow speed at room temperature in the dark for 15 minutes. Wash the sections twice by transferring them to new wells containing five milliliters of water.Protect from light and wash at moderate speed at room temperature for five minutes. Next, transfer the sections into a new well containing five milliliters of ammonium hydroxide. Rock slowly in the dark at room temperature for 15 minutes.Wash the sections twice by transferring them to new wells containing five milliliters of water. Wash on a rocker moving at moderate speed in the dark at room temperature for five minutes. Transfer the sections into a new well containing five milliliters of diluted fixative A.Incubate on a rocker moving at slow speed in the dark at room temperature for 25 minutes.Wash sections in water twice as before. Use a small paintbrush to place the sections onto a microscope slide, then use tweezers and a small tissue to remove excess water and agar. Ensure that all agar is removed before proceeding with the dehydration steps.Allow the sections to air dry at room temperature protected from light. The appropriate drying time is critical, and should be determined for each laboratory. Too short of a time may result in sections falling off of slides during dehydration steps, and too long of a time may result in sections cracking.After drying, first place the slides in clearing agent for five minutes. Place the slides in 100%ethanol for five minutes. Then move through a series of decreasing ethanol concentrations for two minutes each.After the alcohol series, place the slides in water for five minutes. Then stain in 0.5%cresyl violet in water for seven minutes. Following the cresyl violet stain, place the slides in water for two minutes.Then dehydrate the sections through a series of increasing alcohol concentrations for two minutes each. Then two washes in 100%ethanol for five minutes. Place in clearing agent for five minutes.Finally add an anhydrous mounting medium and place a cover slip over the sections. Allow slides to dry horizontally in the dark at room temperature for at least five days. To capture high resolution image stacks of the area containing the neuron of interest, first select a 30X 1.05 NA silicone oil immersion objective on the microscope.Then apply three to four drops of silicone immersion oil to the slide. Place the objective over the slide, ensuring contact between the objective and oil. Focus the image and adjust the camera settings including the exposure and white balance in the imaging software.Next set the upper and lower boundaries for the image stack by focusing to the top of the section, and then selecting set next to top of stack within the image acquisition window. Then focus to the bottom of the section, and select set next to bottom of stack. Set the step distance to one micron by entering one micron next to distance between images within the image acquisition window.Lastly capture the image stack by selecting acquire image stack within the image acquisition window. Repeat the previous steps to capture the entire area of interest making sure that all image stacks overlap by at least 10%in the X and Y axes. This image of the cerebral cortex is a merged Z projection of image stacks acquired from a 500 micron thick section using a 10X objective.The tissue in this image was processed using the main all fresh protocol. The area indicated by the red square was imaged using a 30X silicon oil immersion objective and a higher resolution merged Z projection image stack was acquired. The red arrow shows the two dimensional Z projection of a neuron that was traced from the high resolution 30X image stack.Here the fresh protocol variant with cresyl violet staining was used. This higher resolution image shows the cresyl violet stained section. And this is the neuron tracing obtained.Finally this tissue was processed using the protocol variant in which brains are frozen following Golgi-Cox impregnation. Here the previously frozen tissue is seen at higher resolution. And once again a high quality two dimensional Z projection of the neuron tracing is obtained.This technique can be completed within one month with the processing and imaging steps completed within the final week. Brains can alternatively be frozen following Golgi-Cox impregnation allowing for the processing and imaging to be completed at a later date. Following this procedure, neuroscientists can use the captured images to perform detailed morphological analyses such as dendrite complexity or spine density in order to determine how an experimental manipulation can alter the structure of neurons within the brain.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

גישה מהירה הדמיה ברזולוציה גבוהה הקרינה חצי עבה פרוסות המוח

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

ניתוח Morphometric סעיפים רשתית

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

תגובות סידן הדמיה בנוירונים GFP-tagged של פרוסות מוח עכבר ההיפותלמוס

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

לדמיין את ההשפעות של ניסיון מוקדם חיובי, מישוש גירוי, על דנדריטים מורפולוגיה וSynaptic קישוריות עם Golgi-קוקס מכתים

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restrained Rats

ניטור Juxtacellular והלוקליזציה של Single נוירונים בתוך מבנים מוחיים תת-קליפת המוח של התראה, חולדות-מרוסן ראש

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

הדמית סיבי serotonergic בחוט שדרת עכבר שימוש CLARITY / טכניקה מעוקבת

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

הכנת פרוסות המוח חריפה באמצעות אופטימיזציה N-מתיל-D-שיטת שחזור מגן glucamine

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

הערכת המורכבות בהיפוקמפוס דנדריטי בעכברים בגילאים בשיטת Golgi-Cox

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Determining the Functional Status of the Corticospinal Tract Within One Week of Stroke

קביעת הסטטוס הפונקציונלי של בדרכי Corticospinal בתוך שבוע של שבץ

High interindividual variability in the recovery of upper limb (UL) function after stroke means it is difficult to predict an individual&#39;s potential ...

Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

חקירת אינטראקציה מרחבית בין אסטרוציטים לנוירונים במוחות מנוקים

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...