Name: rapid and refined cd11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility
Uploaded: 2017-04-13T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility at JoVE.com

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) المنح: NS088206 وES026892. وW. يوجين ولليندا لويد هبوا الرئيس على AGK وعمداء الأستاذية إلى AK واعترف أيضا.

تمت الموافقة على استخدام الحيوانات وإجراءات البروتوكول وتشرف عليها لجنة الحيوان الرعاية المؤسسية والاستخدام (IACUC) في جامعة ولاية ايوا (أميس، IA، الولايات المتحدة الأمريكية) 1. زراعة الثقافات الدبقية المختلطة <ol style=";text-align:right;directi...

<ol>
	<li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells.">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li><li>Prinz, M., Priller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+brain+macrophages+in+the+molecular+age:+from+origin+to+neuropsychiatric+disease.">Microglia and brain macrophages in the molecular age: from origin to neuropsychiatric disease.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (5), 300-312 (2014).</li><li>Alliot, F., Godin, I., Pessac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+derive+from+progenitors,+originating+from+the+yolk+sac,+and+which+proliferate+in+the+brain.">Microglia derive from progenitors, originating from the yolk sac, and which proliferate in the brain.</a> Brain Res Dev Brain Res. 117 (2), 145-152 (1999).</li><li>Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myeloid+cells+of+the+central+nervous+system+parenchyma.">The myeloid cells of the central nervous system parenchyma.</a> Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).</li><li>Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+new+roles+for+the+synaptic+stripper.">Microglia: new roles for the synaptic stripper.</a> Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synuclein+activates+microglia+in+a+model+of+Parkinson's+disease.">Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Aging. 29 (11), 1690-1701 (2008).</li><li>Dzamko, N., Geczy, C. L., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+is+genetically+implicated+in+Parkinson's+disease.">Inflammation is genetically implicated in Parkinson's disease.</a> Neuroscience. 302, 89-102 (2015).</li><li>Xing, B., Bachstetter, A. D., Van Eldik, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+p38alpha+MAPK+is+critical+for+LPS-induced+neuron+degeneration,+through+a+mechanism+involving+TNFalpha.">Microglial p38alpha MAPK is critical for LPS-induced neuron degeneration, through a mechanism involving TNFalpha.</a> Mol Neurodegener. 6, 84 (2011).</li><li>Panicker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fyn+Kinase+Regulates+Microglial+Neuroinflammatory+Responses+in+Cell+Culture+and+Animal+Models+of+Parkinson's+Disease.">Fyn Kinase Regulates Microglial Neuroinflammatory Responses in Cell Culture and Animal Models of Parkinson's Disease.</a> J Neurosci. 35 (27), 10058-10077 (2015).</li><li>Moehle, M. S., West, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M1+and+M2+immune+activation+in+Parkinson's+Disease:+Foe+and+ally?.">M1 and M2 immune activation in Parkinson's Disease: Foe and ally?.</a> Neuroscience. 302, 59-73 (2015).</li><li>Saijo, K., Glass, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+cell+origin+and+phenotypes+in+health+and+disease.">Microglial cell origin and phenotypes in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 11 (11), 775-787 (2011).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Floden, A. M., Combs, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+repetitively+isolated+from+in+vitro+mixed+glial+cultures+retain+their+initial+phenotype.">Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype.</a> J Neurosci Methods. 164 (2), 218-224 (2007).</li><li>Saura, J., Tusell, J. M., Serratosa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+isolation+of+murine+microglia+by+mild+trypsinization.">High-yield isolation of murine microglia by mild trypsinization.</a> Glia. 44 (3), 183-189 (2003).</li><li>Gordon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia.">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> J Neurosci Methods. 194 (2), 287-296 (2011).</li><li>Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+CNS+myeloid+cells+and+their+roles+in+neurodegeneration.">Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration.</a> Nat Neurosci. 14 (10), 1227-1235 (2011).</li><li>Marek, R., Caruso, M., Rostami, A., Grinspan, J. B., Das Sarma, ., J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+cell+sorting:+a+fast+and+effective+method+of+concurrent+isolation+of+high+purity+viable+astrocytes+and+microglia+from+neonatal+mouse+brain+tissue.">Magnetic cell sorting: a fast and effective method of concurrent isolation of high purity viable astrocytes and microglia from neonatal mouse brain tissue.</a> J Neurosci Methods. 175 (1), 108-118 (2008).</li><li>Hasko, G., Pacher, P., Vizi, E. S., Illes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+receptor+signaling+in+the+brain+immune+system.">Adenosine receptor signaling in the brain immune system.</a> Trends Pharmacol Sci. 26 (10), 511-516 (2005).</li><li>Radulovic, M., Yoon, H., Wu, J., Mustafa, K., Scarisbrick, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+thrombin+receptor+modulates+inflammation+and+astrogliosis+to+improve+recovery+after+spinal+cord+injury.">Targeting the thrombin receptor modulates inflammation and astrogliosis to improve recovery after spinal cord injury.</a> Neurobiol Dis. 93, 226-242 (2016).</li><li>Ay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning,+epigenetic+regulation,+and+functional+characterization+of+Prkd1+gene+promoter+in+dopaminergic+cell+culture+models+of+Parkinson's+disease.">Molecular cloning, epigenetic regulation, and functional characterization of Prkd1 gene promoter in dopaminergic cell culture models of Parkinson's disease.</a> J Neurochem. 135 (2), 402-415 (2015).</li><li>Gordon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+Cdelta+upregulation+in+microglia+drives+neuroinflammatory+responses+and+dopaminergic+neurodegeneration+in+experimental+models+of+Parkinson's+disease.">Protein kinase Cdelta upregulation in microglia drives neuroinflammatory responses and dopaminergic neurodegeneration in experimental models of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Dis. 93, 96-114 (2016).</li></ol>

أقدم أساليب العزلة دبقية لها المستردة المحدودة التي ليست مناسبة للبروتين مختلف يحلل طخة غربية وRNA يحلل من قبل QRT-PCR. تمسك التفاضلية وأساليب trypsinization خفيفة نهجان المشتركة مع عوائد منخفضة دبقية 13 و 14 و 15. لديه نهج CD11b الق?...

الخلايا الدبقية الصغيرة هي الضامة المقيمين MYB مستقلة من أصل أرومية متوسطة، والتي تفرق من ج طقم + / CD45- erythromyeloid الأسلاف في الجزر الدم من الكيس المحي 1 و 2. مرة واحدة الخلايا الدبقية الصغيرة الجنينية قد استعمرت الجهاز العصبي المركزي (CNS)، والانتقال من أميبية إلى شكل متشعب 3. وتصنف هذه الخلايا الدبقية الصغيرة الكبار كما surveillant منذ تشعباتها ديناميكية التحقيق لحمة الدماغ صحية للإهانات المحتملة 4. على الرغم من أن الخلايا الدبقية الصغيرة تساهم فقط إلى ما يقرب من 10٪ من سكان الخلية CNS، وقدرتهم على البلاط بين بعضها البعض وتضمن المسح القصوى من لحمة 4 و 5. أنماط الخطر المصاحب الجزيئية (DAMPs)، مثل α-synuclein 6 و 7 و 8 اميلويد β، أو عathogen المصاحب أنماط الجزيئية (PAMPs) مثل lipopolysaccharide في (LPS) 9، وتفعيل كلاسيكي الخلايا الدبقية الصغيرة لتعزيز استجابة التهابية تتميز العودة إلى الدولة أميبية نشطة وإنتاج أكسيد النيتريك، عامل نخر الورم α (TNFα)، انترلوكين 1β (IL-1β)، IL-6، IL-12، وchemokine CC عزر يجند 2 9 و 10 و 11. في ظروف neuroinflammatory مثل مرض باركنسون، والتي تراكمت لديها الإمراض α-synuclein، يتم إنشاء دورة الاعصاب من موت الخلايا العصبية الدوبامين، التي تطلق أكثر مجمعة α-synuclein، زيادة تعزيز تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة الكلاسيكية من 7. على غرار الضامة الطرفية، قد يكون الخلايا الدبقية الصغيرة أيضا القدرة على تفعيل بدلا من ذلك في وجود السيتوكينات المضادة للالتهابات IL-4 و IL-10، مما يتيح لهم قويةالاتحاد العالمي للتعليم لتعزيز إصلاح العصبي وتخفيف التهاب 2، 11. وبصرف النظر عن الأدوار المناعية في الجهاز العصبي المركزي، وقد وصفت الخلايا الدبقية الصغيرة كمنظمات حيوية من الدوائر العصبية التي كتبها تشذيب نقاط الاشتباك العصبي خلال التنمية. على سبيل المثال، الفئران Cx3cr1- KO لها الخلايا الدبقية الصغيرة أقل كثافة وخفض التقليم متشابك، الأمر الذي يؤدي إلى فرط العمود الفقري شجيري، نقاط الاشتباك العصبي غير ناضجة، وأنماط الكهربية من متخلف CNS 12. فهم هذه التعقيدات الفسيولوجية والأدوار الوظيفية متنوعة من الخلايا الدبقية الصغيرة في التوازن للجهاز العصبي المركزي أمر بالغ الأهمية للبحث عن علاجات تستهدف الاضطرابات العصبية. في مجال علم المناعة العصبية، في التجارب المختبرية ومرغوب فيه للغاية بسبب إمكانية أكبر للدراسات الميكانيكية، وانخفاض تكاليف الصيانة، ولكونها أقل زمنيا وكثيفة العمالة. Furthermoإعادة، والقدرة على عزل السكان الخلية أمر بالغ الأهمية لتحديد وظائف هذه الخلايا المستهدفة تحت الشروط المنصوص عليها. توجد طرق عديدة العزلة دبقية صغيرة، لكنها محدودة بسبب قدرتها على الحصول على أعداد كبيرة نسبيا ونقاء للتجريب واسعة 13 و 14 و 15. على سبيل المثال، مجموعة من 11B التمايز (CD11b) هي علامة السطح مشتركة من وحيدات، الضامة، والخلايا الدبقية الصغيرة 16. من خلال استغلال CD11b، وصفت طريقة الفصل المغناطيسي أولا باعتباره النهج القائم على العمود الذي أسفرت ~ 99.5٪ النقاء و~ 1.6 × 10 6 الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ حديثي الولادة 17. وضعت مختبرنا مؤخرا CD11b طريقة الفصل المغناطيسي خالية من الأعمدة 15، والتي أجرينا في أنبوب البوليسترين عن طريق وضع علامات CD11b مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة مترافق إلى فيكوإيريترين (PE). A SECONDA bispecificراي أجسام مضادة لPE والمجمعات ديكستران مع PE. مرة واحدة ملزمة، يتم إدخال الجزيئات المغناطيسية المغلفة ديكستران، الذي ربط نهاية ديكستران من مجمع الأضداد. وأخيرا، يتم وضع أنبوب البوليسترين في جذب للعزلة دبقية صغيرة. تضاعف هذا النهج العائد إلى ~ 3.2 × 10 6 الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ حديثي الولادة ولكن على حساب الحد النقاء إلى ~ 97٪. هنا، علينا أن نظهر خالية من الأعمدة CD11b بروتوكول الفصل المغناطيسي السريع والمكرر (الشكل 1). لا تزال هذه الطريقة تحسن ممكنا كما لدينا وسيلة خالية من الأعمدة الأصلي لأن سعر الطقم الفصل المغناطيسي CD11b هو نفسه. يتم تقليل وقت الانتهاء منه في النصف، والتي يمكن أن تكون حاسمة لتعظيم بقاء الخلية والعائد. تجدر الإشارة إلى أن نقاء تحقق من هذا الأسلوب الأمثل هو ~&gt; 99٪، تحسنا ملحوظا على مدى نقاء يتحقق من طريقة خالية من الأعمدة الأصلية التي وضعتها مختبرنا 15. الأهم من ذلك، CD11b-PEلا يستخدم، مما يلغي الحاجة لاحتضان بعيدا عن الضوء والسماح باستخدام القناة الحمراء للفحص المجهري مضان. وأخيرا، كما هو الحال في طريقة CD11b الأصلي، ويتم الحصول على جزء نجمي الخلايا من ارتفاع العائد والنقاء مع هذا الأسلوب محسن. الخلايا النجمية هي الخلايا الدبقية الأكثر عددا في الجهاز العصبي المركزي، مما يؤدي إلى فكرة أن مهامهم التماثل الساكن لا غنى عنها في ما يتعلق الفيزيولوجيا المرضية 18. هذه الخلايا الدبقية يلعب دورا في الوظائف الفسيولوجية المختلفة مثل تشكيل حاجز الدم في الدماغ، وتقديم الدعم المغذيات، والحفاظ على ناقل عصبي التوازن، وتشكيل الندوب الدبقية ردا على إصابة، العصبية والتعلم والذاكرة، وneuroinflammation، لاثبات قدراتهم التحقيق في الدبقية علم الأحياء 19. وقد تم التأكد من التشكل وظائف الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر، غرب النشاف، الكمي في الوقت الحقيقي تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR-QRT)، Gفحص النتريت ريس، وLuminex متعدد خلوى الفحص. صقل المنصوص عليها في هذا البروتوكول يقدم زيادة الثقة المتعلقة نقاء دبقية أو نجمي الخلايا، وتطبيق أوسع المجهر مضان مع توافر القناة الحمراء، ويوفر الوقت، والتي تعتبر مهمة لفي المختبر التجريب.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>EasySep CD11b Separation Kit II</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (1:1) (1x)</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acids (100x)</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (100x)</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>13H469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid and refined cd11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility

الخلايا الدبقية الصغيرة هي المستجيبين الأولية للإهانات الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك، لا يزال هناك الكثير غير معروف حول دورهم في تنظيم neuroinflammation. الخلايا الدبقية الصغيرة هي خلايا أرومية متوسطة التي تعمل على نحو مماثل لالضامة في المسح الإجهاد التهابات. كما تم تمديد الكلاسيكية (M1 من نوع) والبديل (M2 من نوع) التنشيط الضامة إلى الخلايا الدبقية الصغيرة في محاولة لفهم أفضل للتفاعل الكامنة وراء هذه الظواهر لها في ظروف neuroinflammatory مثل الشلل الرعاش والزهايمر، وأمراض هنتنغتون. في التجارب في المختبر الاستفادة الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية العروض نتائج سريعة وموثوق بها التي يمكن أن تمتد إلى البيئة في الجسم الحي. ورغم أن هذا هو ميزة واضحة على الجسم الحي في التجريب، وعزل الخلايا الدبقية الصغيرة مع تحقيق عوائد كافية من النقاء الأمثل قد يشكل تحديا. الطرق الشائعة المستخدمة حاليا إما يعانون من الانتعاش، وانخفاض النقاء، أو كليهما. هنا، نحن ماركاonstrate صقل للCD11b طريقة الفصل المغناطيسي خالية من العمود الذي يحقق الانتعاش خلية عالية وتعزيز نقاء في نصف مقدار الوقت. ونحن نقترح هذا الأسلوب الأمثل نموذجا مفيدا للغاية من العزلة دبقية الأولية لأغراض دراسة neuroinflammation والتنكس العصبي.

الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة من خلال عدة CD11b اختيار إيجابي II ديك نقاء عالية تم عزل الخلايا الدبقية الصغيرة الماوس الأولية باستخدام البروتوكول المذكور أعلاه ومطلي coverslips على المغلفة بولي-D-يس...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility at JoVE.com

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

هنا، نقدم بروتوكول لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة من الجراء الماوس بعد الولادة (يوم 1) لسنة المختبر التجريب. هذه الطريقة المرتجلة من العزلة يولد على حد سواء عالية الغلة والنقاء، وهي ميزة كبيرة على الطرق البديلة التي تسمح التجريب نطاق واسع لأغراض توضيح البيولوجيا دبقية.

عزل المغناطيسي السريع والمكرر CD11b من الابتدائية الخلايا الدبقية الصغيرة مع الطهارة تعزيز وطلاقة

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

The overall goal of CD11b magnetic microglia isolation is to achieve a high purity end yield of postnatal microglia in a relatively short time period for the purposes of versatile in vitro experimentation. This method can help answer key questions in the field of neuroscience, such as the signaling mechanisms pertinent to neural inflammation. The main advantage of this technique over currently available methods is that the isolation takes approximately 30 minutes, with no sacrifices in purity, yield, or viability.Begin by transferring freshly decapitated heads from one-to two-day-old mouse pups to a laminar airflow hood. Then, use 4.5-inch straight micro-dissecting scissors to make a small incision in the skull and meninges by inserting the tips in the opening formed by the decapitation and cutting caudal to rostral. After making the incision, peel one of the hemisphere to the side.Then use a pair of curved or hooked tweezers to remove the entire brain. Transfer the brain to a 50-milliliter tube containing two milliliters of 0.25%trypsin EDTA, and incubate for 15 minutes in a 37-degree Celsius water bath. Wash the brain with fresh growth medium by adding and removing the medium.After completion of the washes, add two milliliters of growth medium per brain, and homogenize by triturating the brain. When the brain tissue does not get smaller, transition to a pipette with a smaller aperture. At the end of trituration, when the suspension is clear with no visible chunks, pass the suspension through a 70-micron cell strainer to create a single cell culture.Then pipette eight to nine milliliters of growth medium into T75 flasks, two flasks per brain, and add on milliliter of brain homogenate to each flask. Grow the cells until isolation on the sixteenth day. After sixteen days, transfer the growth medium from the flask to a fresh 50-milliliter tube.Add three milliliters of 0.25%trypsin EDTA to each T75 flask. Then shake the flasks for five minutes at room temperature on an orbital shaker. Centrifuge the growth medium at 0.4 times g for five minutes.After shaking for five minutes, add a minimum of four milliliters of the centrifuged culture medium to stop the trypsin EDTA reaction, and triturate to ensure that all the cells have been detached. Then pass the cells through a 70-micromolar cell strainer to create a single cell culture. Perform a cell count, and then spin down at 0.4 times g for five minutes.Next, take a five-milliliter polystyrene tube, add one milliliter of recommended medium, and mark the meniscus. Add recommended medium up to 2.5 milliliters, and mark this meniscus as well. Then, remove the medium, and re-suspend the pellet in 500 microliters of recommended medium.Transfer this mix into a five-milliliter polystyrene tube, and then dilute to the one milliliter mark. Then add 50 microliters of rat serum for every one milliliter of suspended cells, and incubate for five minutes at room temperature. During the incubation, prepare the selection cocktail by mixing 25 microliters of component A and 25 microliters of component B.Once the five minutes have elapsed, add 50 microliters of the selection cocktail to the cells, and incubate for a further five minutes at room temperature.Vortex the microspheres for 45 seconds. Then add 80 microliters of microspheres per one milliliter of sample, and incubate for three minutes at room temperature. Next, add recommended medium up to the 2.5 milliliter mark on the polystyrene tube.Put the tube in the magnetic holder for three minutes at room temperature. After the incubation, slowly pour out the medium into a 15-milliliter polystyrene tube still in the magnet. Repeat the magnetic separation three more times, each time adding recommended medium up to the 2.5 milliliter mark.After the last magnetic separation, add three milliliters of growth medium, and count the number of cells using a cell counter. Plate the cells in poly-D-lysine-coated plates for treatments. Plate the negative fraction from the 15-milliliter tube, which mostly contains astrocytes, in T75 flasks.After at least six hours of incubation in a 37-degree Celsius incubator, replace all the growth medium in the flasks containing the negative fraction before returning to the incubator. This image shows immunocytochemistry of an isolated microglial culture probed for IBA, a marker of microglia in the green channel, and GFAP, a marker of astrocytes, in the red channel. Hoechst staining reveals the presence of cell nuclei.The absence of GFAP-positive cells demonstrates that microglia isolated using the CD11b positive selection kit, too, have high purity. These immunoblotted proteins from an isolated microglial culture were probed for GFAP, which appears as an approximately 51-kilodalton band, and IBA1, which appears as an approximately 15-kilodalton band. Beta-actin was used as a loading control and appears at approximately 42-kilodaltons.A problem with the old isolation kit was that PE fluorescence could be observed in the red channel as seen here. The modified procedure does not produce any auto-fluorescence from the magnetic beads, as seen in the red channel here. The microglia isolated using this procedure can be used for signaling studies.Western blot analysis shows that Fyn and phospho-src tyrosine Y416 can be detected from microglia isolated with our newly-refined method. The negative fraction from the microglial separation contains astrocytes that can be used for signaling studies. Western blotting shows that the negative fraction contains GFAP-positive cells.Western blot analysis shows that Fyn and phospho-src tyrosine Y416 can be detected from the GFAP-positive cells. Following this procedure, other methods, like multi-channel fluorescence microscopy, western blotting, and quantitative PCR, can be performed to answer questions regarding gene expression and protein signaling. After watching this video, you should have a good understanding of how to utilize this rapid isolation technique for the purposes of microglial experimentation.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Use of Magnetic Resonance Spectroscopy as a Tool for the Measurement of Bi-hemispheric Transcranial Electric Stimulation Effects on Primary Motor Cortex Metabolism

استخدام التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي كأداة لقياس ثنائي نصف الكرة الغربي عبر الجمجمة التحفيز الكهربائي التأثيرات على الابتدائية موتور اللحاء الأيض

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a neuromodulation technique that has been increasingly used over the past decade in the treatment of ...

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

آثار Transcranial التحفيز التيار المتردد في القشرة الحركية الأولية بنهج موحد على الإنترنت مع التحفيز المغناطيسي Transcranial

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

توصيف والعزلة للماوس Microglia الأولية بكثافة التدرج الطرد المركزي

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

العزلة وثقافة Microglia القوارض تعزيز دينامية تتفرع مورفولوجيا في المتوسط خالية من المصل

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

العزلة واستخراج الحمض النووي الريبي للخلايا العصبية والضامة وميكروجليا من العقول الزرد اليرقات

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

عزل إيمونوماجنيتيك سريعة ومحددة من الماوس Oligodendrocytes الأولية

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

العزلة السريعة للضامة الجذرية الدجورة

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Isolation and Culture of Primary Neurons and Glia from Adult Rat Urinary Bladder

عزل وثقافة الخلايا العصبية الأولية وغليا من المثانة البولية الجرذ الكبار

The lower urinary tract has two main functions, namely, periodic urine storage and micturition; these functions are mediated through central and ...

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

العزل المغناطيسي للخلايا الدبقية الصغيرة من فأر حديث الولادة لمزارع الخلايا الأولية

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

الثقافات الأولية للخلايا النجمية للفئران والخلايا الدبقية الصغيرة واستخدامها في دراسة التصلب الجانبي الضموري

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...