Name: rapid and refined cd11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility
Uploaded: 2017-04-13T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מענקים: NS088206 ו ES026892. &#39;בוש יוג&#39;ין ולינדה לויד נתרם היו&quot;ר אל AGK ו דיקני Professorship כדי AK הוא גם הודה.

השימוש בחיות והנהלים פרוטוקול אושרו ובפיקוח טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) באוניברסיטת איווה סטייט (איימס, IA, ארה&quot;ב) 1. גידול של תרבויות מעורבות גליה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף 1- 2 גורים בני...

<ol>
	<li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells.">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li><li>Prinz, M., Priller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+brain+macrophages+in+the+molecular+age:+from+origin+to+neuropsychiatric+disease.">Microglia and brain macrophages in the molecular age: from origin to neuropsychiatric disease.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (5), 300-312 (2014).</li><li>Alliot, F., Godin, I., Pessac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+derive+from+progenitors,+originating+from+the+yolk+sac,+and+which+proliferate+in+the+brain.">Microglia derive from progenitors, originating from the yolk sac, and which proliferate in the brain.</a> Brain Res Dev Brain Res. 117 (2), 145-152 (1999).</li><li>Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myeloid+cells+of+the+central+nervous+system+parenchyma.">The myeloid cells of the central nervous system parenchyma.</a> Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).</li><li>Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+new+roles+for+the+synaptic+stripper.">Microglia: new roles for the synaptic stripper.</a> Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synuclein+activates+microglia+in+a+model+of+Parkinson's+disease.">Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Aging. 29 (11), 1690-1701 (2008).</li><li>Dzamko, N., Geczy, C. L., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+is+genetically+implicated+in+Parkinson's+disease.">Inflammation is genetically implicated in Parkinson's disease.</a> Neuroscience. 302, 89-102 (2015).</li><li>Xing, B., Bachstetter, A. D., Van Eldik, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+p38alpha+MAPK+is+critical+for+LPS-induced+neuron+degeneration,+through+a+mechanism+involving+TNFalpha.">Microglial p38alpha MAPK is critical for LPS-induced neuron degeneration, through a mechanism involving TNFalpha.</a> Mol Neurodegener. 6, 84 (2011).</li><li>Panicker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fyn+Kinase+Regulates+Microglial+Neuroinflammatory+Responses+in+Cell+Culture+and+Animal+Models+of+Parkinson's+Disease.">Fyn Kinase Regulates Microglial Neuroinflammatory Responses in Cell Culture and Animal Models of Parkinson's Disease.</a> J Neurosci. 35 (27), 10058-10077 (2015).</li><li>Moehle, M. S., West, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M1+and+M2+immune+activation+in+Parkinson's+Disease:+Foe+and+ally?.">M1 and M2 immune activation in Parkinson's Disease: Foe and ally?.</a> Neuroscience. 302, 59-73 (2015).</li><li>Saijo, K., Glass, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+cell+origin+and+phenotypes+in+health+and+disease.">Microglial cell origin and phenotypes in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 11 (11), 775-787 (2011).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Floden, A. M., Combs, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+repetitively+isolated+from+in+vitro+mixed+glial+cultures+retain+their+initial+phenotype.">Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype.</a> J Neurosci Methods. 164 (2), 218-224 (2007).</li><li>Saura, J., Tusell, J. M., Serratosa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+isolation+of+murine+microglia+by+mild+trypsinization.">High-yield isolation of murine microglia by mild trypsinization.</a> Glia. 44 (3), 183-189 (2003).</li><li>Gordon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia.">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> J Neurosci Methods. 194 (2), 287-296 (2011).</li><li>Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+CNS+myeloid+cells+and+their+roles+in+neurodegeneration.">Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration.</a> Nat Neurosci. 14 (10), 1227-1235 (2011).</li><li>Marek, R., Caruso, M., Rostami, A., Grinspan, J. B., Das Sarma, ., J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+cell+sorting:+a+fast+and+effective+method+of+concurrent+isolation+of+high+purity+viable+astrocytes+and+microglia+from+neonatal+mouse+brain+tissue.">Magnetic cell sorting: a fast and effective method of concurrent isolation of high purity viable astrocytes and microglia from neonatal mouse brain tissue.</a> J Neurosci Methods. 175 (1), 108-118 (2008).</li><li>Hasko, G., Pacher, P., Vizi, E. S., Illes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+receptor+signaling+in+the+brain+immune+system.">Adenosine receptor signaling in the brain immune system.</a> Trends Pharmacol Sci. 26 (10), 511-516 (2005).</li><li>Radulovic, M., Yoon, H., Wu, J., Mustafa, K., Scarisbrick, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+thrombin+receptor+modulates+inflammation+and+astrogliosis+to+improve+recovery+after+spinal+cord+injury.">Targeting the thrombin receptor modulates inflammation and astrogliosis to improve recovery after spinal cord injury.</a> Neurobiol Dis. 93, 226-242 (2016).</li><li>Ay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning,+epigenetic+regulation,+and+functional+characterization+of+Prkd1+gene+promoter+in+dopaminergic+cell+culture+models+of+Parkinson's+disease.">Molecular cloning, epigenetic regulation, and functional characterization of Prkd1 gene promoter in dopaminergic cell culture models of Parkinson's disease.</a> J Neurochem. 135 (2), 402-415 (2015).</li><li>Gordon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+Cdelta+upregulation+in+microglia+drives+neuroinflammatory+responses+and+dopaminergic+neurodegeneration+in+experimental+models+of+Parkinson's+disease.">Protein kinase Cdelta upregulation in microglia drives neuroinflammatory responses and dopaminergic neurodegeneration in experimental models of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Dis. 93, 96-114 (2016).</li></ol>

מבוגרי שיטות בידוד microglial מחלים מוגבל שאינם מתאימים עבור חלבון שונה מנתח ידי כתם מערבי RNA מנתח ידי qRT-PCR. הקפדת ההפרש ושיטות trypsinization מתונות שתי גישות נפוצות עם תשואות microglial נמוכות 13, 14, 15. גישת CD11b מבוסס העמודה יש גם התאו...

Microglia הם מקרופאגים תושב Myb עצמאית ממוצא mesodermal, אשר להבדיל מן c-kit + / CD45- erythromyeloid אבות באיים הדם של שק חלמון 1, 2. לאחר microglia העוברית יש יישבה את מערכת העצבים המרכזית (CNS), כשהם עוברים מן אמבואידית לצורה מסועפת 3. Microglia הבוגר אלו מסווגים surveillant מאז ההשלכות הדינמיות שלהם לחקור את מוח parenchyma הבריא 4 עלבונות פוטנציאל. למרות microglia רק לתרום כ 10% מכלל אוכלוסיית תא CNS, יכל אריח בין זה לזה מבטיח סריקה מרבית של parenchyma 4, 5. Danger הקשורים דפוסים מולקולריים (damps), כגון α-synuclein 6, 7 ו עמילואיד-β 8, או pathogen הקשורים דפוסים מולקולריים (PAMPs) כגון lipopolysaccharide (LPS) 9, קלסיים להפעיל microglia לקדם תגובה דלקתית המאופיינת חזרה למצב הפעיל אמבואידית ואת הייצור של תחמוצת חנקנית, נימק גידול-α גורם (TNFα), 1β interleukin (IL-1β), IL-6, IL-12, והמוטיב CC chemokine ליגנד 2 9, 10, 11. בתנאי neuroinflammatory כגון מחלת פרקינסון, שבו-synuclein α פתוגניים צבר, מחזור ניווניות נוצר מן המוות של נוירונים דופאמינרגיים, אשר ישחררו-synuclein α מצטבר יותר, עוד יותר בקידום הפעלה קלסית של המיקרוגליה 7. בדומה מקרופאגים היקפי, microglia אולי גם יש את היכולת לחילופין להפעיל בנוכחות של ציטוקינים אנטי דלקתי IL-4 ו- IL-10, לתת להם את החזקיםial לקדם תיקון עצבי הפחתת דלקת 2, 11. מלבד התפקידים אימונולוגיים שלהם במערכת העצבים המרכזית, microglia תואר רגולטורים חיוניים של מעגלים עצביים על ידי גיזום סינפסות במהלך פיתוח. לדוגמה, עכברים KO Cx3cr1- יש פחות microglia צפופה וגיזום הסינפטי מופחת, אשר מוביל עודף של הקוצים הדנדריטים, סינפסות בשלה, ואת דפוסי אלקטרו של CNS מפותח 12. הבנת מורכבות הפיזיולוגיות אלה התפקידים התפקודיים המגוונים של המיקרוגליה של הומאוסטזיס של CNS היא קריטית בחיפוש אחר תרופות מיקוד הפרעות ניווניות. בתחום neuroimmunology, ניסויים במבחנה ב הם רצויים מאוד בגלל הכדאיות יותר עבור מחקרים מכניסטית, עלויות התחזוקה הנמוכות, וכן בשל היותו פחות הזמן- ועבודה אינטנסיבית. Furthermoמחדש, היכולת לבודד אוכלוסיות תאים הוא קריטי כדי להתוות את הפונקציונליות של אלה תאי היעד בתנאים שנקבעו. רבי שיטות בידוד microglial קיימות, אבל הם מוגבלים על ידי היכולת שלהם להשיג מספרים גבוהים יחסית וטוהר לניסויים רחבים 13, 14, 15. לדוגמה, מקבץ של 11b בידול (CD11b) הוא סמן משטח משותף של מונוציטים, מקרופאגים, ו microglia 16. על ידי ניצול CD11b, שיטה של הפרדה מגנטי תוארה לראשונה כגישה מבוססי עמודה שהניבה ~ 99.5% טוהר ~ 1.6 x 10 6 microglia לכל המוח בילוד 17. במעבדה שלנו לאחרונה פיתחה שיטה הפרדה מגנטי CD11b ללא עמודה 15, אשר ביצענו ב צינור פוליסטירן ידי תיוג CD11b עם נוגדנים חד שבטיים מצומדות Phycoerythrin (PE). Seconda bispecificנוגדנים ר&quot;י כדי PE ו מתחמי dextran עם PE. לאחר כבול, חלקיקים מגנטיים מצופה dextran מוצגים, אשר נקלטים על ידי תום dextran של הרכב הנוגדן. לבסוף, צינור הקלקר ממוקם מגנט עבור בידוד microglial. גישה זו הכפילה את התשואה ל ~ 3.2 x 10 6 microglia לכל המוח בילוד אך במחיר של צמצום טוהר אל ~ 97%. בזאת, אנו מדגימים פרוטוקול הפרדה מגנטי מהיר ומעודן טור נטול CD11b (איור 1). שיטה משופרת נשארת כפי ריאלית כשיטת הטור ללא המקורי שלנו מאז המחיר של ערכת ההפרדה מגנטית CD11b זהה. שעת ההשלמה מצטמצמת בחצי, מה שיכול להיות מכריע כדי למקסם הישרדות תא תשואה. יש לציין, כי הטוהר שהושג שיטת אופטימיזציה זה ~&gt; 99%, שיפור ניכר לעומת טוהר מושגת משיטת הטור-חינם המקורית שפותחה על ידי המעבדה שלנו 15. והכי חשוב, CD11b-PEלא מנוצל, ומבטל את הצורך לדגור הרחק אור ומאפשר את השימוש במסלול האדום עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לבסוף, כמו בשיטת CD11b המקורית, שבר astrocytic של תשואה וטוהרת גבוהות מתקבל עם שיטה משופרת. האסטרוציטים הם תאי גליה הרבים ביותר במערכת העצבים המרכזית, שמובילים את הרעיון כי הפונקציות ההומיאוסטטית שלהם הן הכרחיות ביחס פתופיזיולוגיה 18. תאי גליה אלה ממלאים תפקיד פונקציות פיסיולוגיות מגוונות כגון להרכיב את מחסום דם-המוח, מתן תמיכה מזינה, שמירת הומאוסטזיס הנוירוטרנסמיטר, ויוצר צלקות גליה בתגובה לפציעה, neuroprotection, למידה וזיכרון, וכן neuroinflammation, הממחיש את פוטנציאל החקירה שלהם גליה ביולוגיה 19. מורפולוגיה ופונקציונליות של המיקרוגליה האסטרוציטים כבר הוברר באמצעות מיקרוסקופיה confocal, סופג המערבי, תגובת שרשרת Real-Time פולימראז כמותיים (qRT-PCR), Gassay ניטריט ריס, ואת assay ציטוקינים זמנית Luminex. החידוד שמספק פרוטוקול זה מציע מוגברת ביטחון נוגעים טוהר microglial או astrocytic, יישום רחב יותר של מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם הזמינות של הערוץ האדום, חוסך זמן, שכולן חשוב ניסויים במבחנה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>EasySep CD11b Separation Kit II</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (1:1) (1x)</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acids (100x)</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (100x)</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>13H469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid and refined cd11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility

Microglia הם המגיבים העיקריים עלבונות מערכת עצבים מרכזיים; עם זאת, הרבה נותר עלום על תפקידם בוויסות neuroinflammation. Microglia הם תאי mesodermal המתפקדים בדומה מקרופאגים מדידות מתח דלקתי. הקלסי (M1-type) ואלטרנטיבי (M2-type) ההפעלות של מקרופאגים גם שהורחבו microglia במאמץ להבין טוב יותר את יחסי הגומלין הבסיסיים פנוטיפים אלה יש בתנאי neuroinflammatory כגון פרקינסון, אלצהיימר, ומחלות הנטינגטון. בניסויים במבחנת ניצול microglia העיקרי מציעה תוצאות מהירות ואמינות כי ניתן להאריך את סביבת vivo ב. אמנם זה יתרון ברור על פני ניסויי in vivo, לבודד microglia תוך השגת תשואות נאות של טוהר אופטימלית כבר אתגר. שיטות נפוצות כיום בשימוש משני סובלות התאוששות נמוכה, טוהר נמוך, או שניהם. בזאת, אנו שייכים להםלהדגמת פרות עידון של שיטת ההפרדה המגנטית CD11b ללא עמודה משיגה התאוששות תא גבוהה וטוהר משופרים במחצית את כמות הזמן. אנו מציעים שיטת אופטימיזציה זו כמודל שימושי מאוד של בידוד microglial העיקרי לצורכי לימוד neuroinflammation ניוון מוחיים.

Microglia מבודד באמצעות ערכת הסלקציה החיובית CD11b יש שנייה טוהרת גבוהה microglia העכבר הראשי בודד באמצעות הפרוטוקול הנ&quot;ל, מצופה על coverslips מצופה פולי- D- ליזין לבדוק את הטוהר של בידוד. עשרת אלפים תאים היו מ?...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility at JoVE.com

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד microglia מ גורי עכבר לאחר לידה (יום 1) עבור ניסויים במבחנה. שיטה מאולתרת זו של בידוד מייצר היא גבוהה תשואה וטוהרת, יתרון משמעותי על פני שיטות חלופיות המאפשר התנסות במגוון רחבה לצורך הבהרת ביולוגית microglial.

בידוד ראפיד ומעודן CD11b מגנטי של Microglia הראשי עם טוהר משופר רבגוני

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

The overall goal of CD11b magnetic microglia isolation is to achieve a high purity end yield of postnatal microglia in a relatively short time period for the purposes of versatile in vitro experimentation. This method can help answer key questions in the field of neuroscience, such as the signaling mechanisms pertinent to neural inflammation. The main advantage of this technique over currently available methods is that the isolation takes approximately 30 minutes, with no sacrifices in purity, yield, or viability.Begin by transferring freshly decapitated heads from one-to two-day-old mouse pups to a laminar airflow hood. Then, use 4.5-inch straight micro-dissecting scissors to make a small incision in the skull and meninges by inserting the tips in the opening formed by the decapitation and cutting caudal to rostral. After making the incision, peel one of the hemisphere to the side.Then use a pair of curved or hooked tweezers to remove the entire brain. Transfer the brain to a 50-milliliter tube containing two milliliters of 0.25%trypsin EDTA, and incubate for 15 minutes in a 37-degree Celsius water bath. Wash the brain with fresh growth medium by adding and removing the medium.After completion of the washes, add two milliliters of growth medium per brain, and homogenize by triturating the brain. When the brain tissue does not get smaller, transition to a pipette with a smaller aperture. At the end of trituration, when the suspension is clear with no visible chunks, pass the suspension through a 70-micron cell strainer to create a single cell culture.Then pipette eight to nine milliliters of growth medium into T75 flasks, two flasks per brain, and add on milliliter of brain homogenate to each flask. Grow the cells until isolation on the sixteenth day. After sixteen days, transfer the growth medium from the flask to a fresh 50-milliliter tube.Add three milliliters of 0.25%trypsin EDTA to each T75 flask. Then shake the flasks for five minutes at room temperature on an orbital shaker. Centrifuge the growth medium at 0.4 times g for five minutes.After shaking for five minutes, add a minimum of four milliliters of the centrifuged culture medium to stop the trypsin EDTA reaction, and triturate to ensure that all the cells have been detached. Then pass the cells through a 70-micromolar cell strainer to create a single cell culture. Perform a cell count, and then spin down at 0.4 times g for five minutes.Next, take a five-milliliter polystyrene tube, add one milliliter of recommended medium, and mark the meniscus. Add recommended medium up to 2.5 milliliters, and mark this meniscus as well. Then, remove the medium, and re-suspend the pellet in 500 microliters of recommended medium.Transfer this mix into a five-milliliter polystyrene tube, and then dilute to the one milliliter mark. Then add 50 microliters of rat serum for every one milliliter of suspended cells, and incubate for five minutes at room temperature. During the incubation, prepare the selection cocktail by mixing 25 microliters of component A and 25 microliters of component B.Once the five minutes have elapsed, add 50 microliters of the selection cocktail to the cells, and incubate for a further five minutes at room temperature.Vortex the microspheres for 45 seconds. Then add 80 microliters of microspheres per one milliliter of sample, and incubate for three minutes at room temperature. Next, add recommended medium up to the 2.5 milliliter mark on the polystyrene tube.Put the tube in the magnetic holder for three minutes at room temperature. After the incubation, slowly pour out the medium into a 15-milliliter polystyrene tube still in the magnet. Repeat the magnetic separation three more times, each time adding recommended medium up to the 2.5 milliliter mark.After the last magnetic separation, add three milliliters of growth medium, and count the number of cells using a cell counter. Plate the cells in poly-D-lysine-coated plates for treatments. Plate the negative fraction from the 15-milliliter tube, which mostly contains astrocytes, in T75 flasks.After at least six hours of incubation in a 37-degree Celsius incubator, replace all the growth medium in the flasks containing the negative fraction before returning to the incubator. This image shows immunocytochemistry of an isolated microglial culture probed for IBA, a marker of microglia in the green channel, and GFAP, a marker of astrocytes, in the red channel. Hoechst staining reveals the presence of cell nuclei.The absence of GFAP-positive cells demonstrates that microglia isolated using the CD11b positive selection kit, too, have high purity. These immunoblotted proteins from an isolated microglial culture were probed for GFAP, which appears as an approximately 51-kilodalton band, and IBA1, which appears as an approximately 15-kilodalton band. Beta-actin was used as a loading control and appears at approximately 42-kilodaltons.A problem with the old isolation kit was that PE fluorescence could be observed in the red channel as seen here. The modified procedure does not produce any auto-fluorescence from the magnetic beads, as seen in the red channel here. The microglia isolated using this procedure can be used for signaling studies.Western blot analysis shows that Fyn and phospho-src tyrosine Y416 can be detected from microglia isolated with our newly-refined method. The negative fraction from the microglial separation contains astrocytes that can be used for signaling studies. Western blotting shows that the negative fraction contains GFAP-positive cells.Western blot analysis shows that Fyn and phospho-src tyrosine Y416 can be detected from the GFAP-positive cells. Following this procedure, other methods, like multi-channel fluorescence microscopy, western blotting, and quantitative PCR, can be performed to answer questions regarding gene expression and protein signaling. After watching this video, you should have a good understanding of how to utilize this rapid isolation technique for the purposes of microglial experimentation.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Use of Magnetic Resonance Spectroscopy as a Tool for the Measurement of Bi-hemispheric Transcranial Electric Stimulation Effects on Primary Motor Cortex Metabolism

השימוש בספקטרוסקופיה בתהודה מגנטית ככלי למדידה של השפעות דו חצי מוח Transcranial חשמלי גירוי על יסודי Motor Cortex מטבוליזם

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a neuromodulation technique that has been increasingly used over the past decade in the treatment of ...

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

ההשפעות של גירוי זרם חילופין טראנס על קליפת המוח המוטורית הראשי על-ידי גישה משולבת מקוון עם גירוי מגנטי טראנס

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

אפיון ובידוד של העכבר מיקרוגלייה העיקרי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

בידוד והתרבות של מכרסמים מיקרוגלייה לקדם דינאמי כחוד מורפולוגיה במדיום נטול סרום

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

בידוד והפקת RNA של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח זחל דג זברה

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

בידוד Immunomagnetic מהירה, מדויקת של העכבר הראשי oligodendrocytes להפוך

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

הבידוד המהיר של הקרופאגים של השורש

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Isolation and Culture of Primary Neurons and Glia from Adult Rat Urinary Bladder

בידוד ותרבות של נוירונים ראשוניים גליה משלפוחית השתן של חולדה בוגרת

The lower urinary tract has two main functions, namely, periodic urine storage and micturition; these functions are mediated through central and ...

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

בידוד מגנטי של תאים מיקרוגליאליים מעכבר ניאונאט עבור תרביות תאים ראשוניים

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

תרביות ראשוניות של אסטרוציטים ומיקרוגליה של חולדות והשימוש בהן בחקר טרשת אמיוטרופית צידית

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...