Name: rapid and refined cd11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility
Uploaded: 2017-04-13T12:30:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (NIH) Sovvenzioni: NS088206 e ES026892. L&#39;W. Eugene e Linda Lloyd sedia dotata di AGK e Deans cattedra di AK sono anche riconosciuti.

L&#39;uso degli animali e delle procedure di protocollo è stato approvato e supervisionato dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso (IACUC) alla Iowa State University (Ames, IA, Stati Uniti d&#39;America) 1. Coltivazione di colture gliali miste <ol><li> Decapitare 1- 2 giorni di età cuccioli rapidamente con le forbici che operano 5.5 pollici, e posizionare le teste immediatamente in un tubo da 50 ml su ghiaccio. Si noti che questa decapitazione è la modalità di eutanasia. <...

<ol>
	<li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells.">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li><li>Prinz, M., Priller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+brain+macrophages+in+the+molecular+age:+from+origin+to+neuropsychiatric+disease.">Microglia and brain macrophages in the molecular age: from origin to neuropsychiatric disease.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (5), 300-312 (2014).</li><li>Alliot, F., Godin, I., Pessac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+derive+from+progenitors,+originating+from+the+yolk+sac,+and+which+proliferate+in+the+brain.">Microglia derive from progenitors, originating from the yolk sac, and which proliferate in the brain.</a> Brain Res Dev Brain Res. 117 (2), 145-152 (1999).</li><li>Ransohoff, R. 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Vecchi metodi di isolamento della microglia hanno recuperi limitate che non sono appropriati per varie proteine ​​analisi mediante Western blot e RNA analisi da qRT-PCR. L&#39;adesione differenziale e metodi tripsinizzazione miti sono due approcci comuni con basse rese microgliali 13, 14, 15. L&#39;approccio CD11b basata su colonne ha anche bassa recupero, ma raggiunge una maggiore purezza del seguire differenziale e tripsi...

Microglia sono macrofagi residenti Myb indipendenti di origine mesodermica che differenziano da c-kit + / CD45- progenitori nelle isole sanguigni del sacco vitellino 1, 2 erythromyeloid. Una volta microglia embriologici hanno colonizzato il sistema nervoso centrale (CNS), la fase di transizione da un ameboide ad una forma ramificata 3. Questi microglia adulti sono classificati come surveillant dal loro ramificazioni dinamiche sondare il parenchima cerebrale sano per i potenziali insulti 4. Sebbene microglia contribuiscono solo a circa il 10% della popolazione cellulare CNS, la loro capacità di piastrelle tra di loro assicura scansione massima del parenchima 4, 5. Modelli pericolo associati molecolari (smorza), come α-sinucleina 6, 7 e 8 β-amiloide, o ppattern molecolari athogen-associati (PAMPs) come lipopolisaccaride (LPS) 9, attivano classicamente microglia per promuovere una risposta infiammatoria caratterizzata da reversione allo stato attivo amoeboid e la produzione di ossido nitrico, fattore di necrosi tumorale-α (TNF), interleuchina 1β (iL-1β), iL-6, iL-12, e il motivo CC chemochina ligando 2 9, 10, 11. In condizioni neuroinfiammatorie come il morbo di Parkinson, in cui patogeni α-sinucleina ha accumulato, un ciclo neurodegenerativa è creato dalla morte dei neuroni dopaminergici, che rilasciano più aggregate α-sinucleina, promuovendo un&#39;ulteriore attivazione classica della microglia 7. Simile a macrofagi periferici, microglia può anche avere la capacità di attivare alternativamente in presenza di citochine antinfiammatorie IL-4 e IL-10, dando loro la potenteial di promuovere la riparazione neurale e attenuando l&#39;infiammazione 2, 11. A parte i loro ruoli immunologici nel SNC, microglia sono stati descritti come regolatori vitali della circuiteria neuronale potatura sinapsi durante lo sviluppo. Ad esempio, i topi hanno Cx3cr1- KO microglia meno dense e ridotta potatura sinaptica, che porta ad una sovrabbondanza di spine dendritiche immature, sinapsi, ei modelli elettrofisiologici di un sottosviluppato CNS 12. La comprensione di queste complessità fisiologici ei diversi ruoli funzionali della microglia nell&#39;omeostasi del sistema nervoso centrale è fondamentale per la ricerca di terapie rivolte malattie neurodegenerative. Nel settore della neuroimmunologia, esperimenti in vitro sono altamente desiderabile a causa della maggiore fattibilità per studi meccanicistici, i minori costi di manutenzione, e per essere meno tempo e laborioso. Furthermori, la possibilità di isolare popolazioni di cellule è fondamentale per delineare la funzionalità di tali cellule bersaglio nelle condizioni prescritte. Numerosi metodi di isolamento microgliali esistono, ma sono limitati dalla loro capacità di ottenere numeri relativamente elevati e purezza per un&#39;ampia sperimentazione 13, 14, 15. Ad esempio, un cluster di differenziazione 11b (CD11b) è un marcatore di superficie comune dei monociti, macrofagi e microglia 16. Sfruttando CD11b, un metodo di separazione magnetica è stata descritta come un approccio basato su colonne che ha dato ~ 99,5% di purezza e ~ 1,6 x 10 6 microglia per neonatale cervello 17. Il nostro laboratorio ha recentemente sviluppato un CD11b metodo di separazione magnetica senza colonne 15, che abbiamo eseguito in un tubo di polistirene mediante codifica CD11b con un anticorpo monoclonale coniugato con ficoeritrina (PE). Una Seconda bispecificoanticorpo ry a PE e complessi destrano con il PE. Una volta legato, particelle magnetiche destrano rivestite vengono introdotti, che si legano alla fine destrano del complesso anticorpo. Infine, il tubo polistirolo viene collocato in un magnete per l&#39;isolamento della microglia. Questo approccio raddoppiato il rendimento a ~ 3,2 x 10 6 microglia al cervello neonatale, ma a costo di ridurre purezza a ~ 97%. Qui, dimostriamo una rapida e raffinato privo di colonna CD11b magnetico protocollo di differenziazione (Figura 1). Questo metodo perfezionato rimane fattibile come nostro metodo libero-colonna originale poiché il prezzo del kit separazione magnetica CD11b è lo stesso. Il tempo di completamento è ridotta a metà, che può essere cruciale per massimizzare la sopravvivenza delle cellule e la resa. In particolare, la purezza ottenuto da questo metodo ottimizzato è ~&gt; 99%, un netto miglioramento rispetto alla purezza raggiunto dal metodo originale senza colonne sviluppato dal nostro laboratorio 15. Ancora più importante, CD11b-PEnon è utilizzata, eliminando la necessità di incubare lontano dalla luce e permettendo l&#39;utilizzo del canale rosso per microscopia a fluorescenza. Infine, come nel metodo originale CD11b, una frazione astrocitaria di elevata resa e purezza è ottenuto con questo procedimento perfezionato. Gli astrociti sono più numerose cellule gliali nel sistema nervoso centrale, che porta l&#39;idea che le loro funzioni omeostatiche sono indispensabili in relazione alla fisiopatologia 18. Queste cellule gliali svolgono un ruolo in diverse funzioni fisiologiche quali formano la barriera emato-encefalica, che fornisce il supporto di nutrienti, mantenendo neurotrasmettitore omeostasi, la formazione di cicatrici gliali in risposta al danno, neuroprotezione, l&#39;apprendimento e la memoria, e neuroinfiammazione, esemplificando il loro potenziale di indagine in gliale biologia 19. Morfologia e la funzionalità della microglia e astrociti sono state accertate tramite microscopia confocale, Western blotting, quantitativa Real-Time Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR), Gtest nitriti Riess, e il test multiplex citochina Luminex. La raffinatezza fornita da questo protocollo offre una maggiore fiducia di pertinenza di purezza microglia o astrociti, più ampia applicazione della microscopia a fluorescenza con la disponibilità del canale rosso, e fa risparmiare tempo, che sono tutti importanti per la sperimentazione in vitro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>EasySep CD11b Separation Kit II</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (1:1) (1x)</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acids (100x)</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (100x)</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>13H469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid and refined cd11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility

Microglia sono i responder primari a insulti del sistema nervoso centrale; Tuttavia, molto resta sconosciuto circa il loro ruolo nella regolazione neuroinfiammazione. La microglia sono cellule mesodermiche che funzionano in modo simile ai macrofagi nel rilevamento stress infiammatorio. La classica (M1-type) ed alternativa (M2-type) attivazioni dei macrofagi sono stati anche esteso ad microglia nel tentativo di meglio comprendere l&#39;interazione sottostante questi fenotipi hanno in condizioni neuroinfiammatori quali il Parkinson, morbo di Alzheimer e il morbo di Huntington. Nella sperimentazione vitro utilizzando microglia primaria offre risultati rapidi ed affidabili che possono essere estese per l&#39;ambiente in vivo. Anche se questo è un chiaro vantaggio rispetto sperimentazione in vivo, isolando microglia mentre raggiungere adeguati rese di purezza ottimale è stata una sfida. I metodi più comuni attualmente in uso o soffrono di bassa recupero, bassa purezza, o di entrambi. Qui, abbiamo DEMstrare un perfezionamento del metodo di separazione magnetica senza colonne CD11b che realizza un recupero delle cellule elevata e una maggiore purezza in metà tempo. Proponiamo questo metodo ottimizzato come modello altamente utile di isolamento microgliali primario ai fini di studio neuroinflammation e neurodegenerazione.

Microglia isolato utilizzando il kit CD11b selezione positiva II hanno elevata purezza microglia primarie di topo sono stati isolati utilizzando il protocollo sopra indicata e piastrate su vetrini poli-D-lisina rivestite controllare la purezza di isolamento. Diecimila cellule sono state piastrate per pozzetto e analisi immunocitochimica è stata effettuata utilizzando ionizzato adattatore molecola legante il calcio 1 (Iba1) come ...

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Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Qui, vi presentiamo un protocollo per isolare microglia da cuccioli di topo postnatale (giorno 1) per la sperimentazione in vitro. Questo metodo improvvisato di isolamento genera sia elevata resa e purezza, un vantaggio significativo rispetto ai metodi alternativi che consente un&#39;ampia gamma sperimentazione ai fini di chiarire biologia microglia.

Rapid e raffinato CD11b isolamento magnetico di primaria microglia con purezza migliorata e versatilità

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

The overall goal of CD11b magnetic microglia isolation is to achieve a high purity end yield of postnatal microglia in a relatively short time period for the purposes of versatile in vitro experimentation. This method can help answer key questions in the field of neuroscience, such as the signaling mechanisms pertinent to neural inflammation. The main advantage of this technique over currently available methods is that the isolation takes approximately 30 minutes, with no sacrifices in purity, yield, or viability.Begin by transferring freshly decapitated heads from one-to two-day-old mouse pups to a laminar airflow hood. Then, use 4.5-inch straight micro-dissecting scissors to make a small incision in the skull and meninges by inserting the tips in the opening formed by the decapitation and cutting caudal to rostral. After making the incision, peel one of the hemisphere to the side.Then use a pair of curved or hooked tweezers to remove the entire brain. Transfer the brain to a 50-milliliter tube containing two milliliters of 0.25%trypsin EDTA, and incubate for 15 minutes in a 37-degree Celsius water bath. Wash the brain with fresh growth medium by adding and removing the medium.After completion of the washes, add two milliliters of growth medium per brain, and homogenize by triturating the brain. When the brain tissue does not get smaller, transition to a pipette with a smaller aperture. At the end of trituration, when the suspension is clear with no visible chunks, pass the suspension through a 70-micron cell strainer to create a single cell culture.Then pipette eight to nine milliliters of growth medium into T75 flasks, two flasks per brain, and add on milliliter of brain homogenate to each flask. Grow the cells until isolation on the sixteenth day. After sixteen days, transfer the growth medium from the flask to a fresh 50-milliliter tube.Add three milliliters of 0.25%trypsin EDTA to each T75 flask. Then shake the flasks for five minutes at room temperature on an orbital shaker. Centrifuge the growth medium at 0.4 times g for five minutes.After shaking for five minutes, add a minimum of four milliliters of the centrifuged culture medium to stop the trypsin EDTA reaction, and triturate to ensure that all the cells have been detached. Then pass the cells through a 70-micromolar cell strainer to create a single cell culture. Perform a cell count, and then spin down at 0.4 times g for five minutes.Next, take a five-milliliter polystyrene tube, add one milliliter of recommended medium, and mark the meniscus. Add recommended medium up to 2.5 milliliters, and mark this meniscus as well. Then, remove the medium, and re-suspend the pellet in 500 microliters of recommended medium.Transfer this mix into a five-milliliter polystyrene tube, and then dilute to the one milliliter mark. Then add 50 microliters of rat serum for every one milliliter of suspended cells, and incubate for five minutes at room temperature. During the incubation, prepare the selection cocktail by mixing 25 microliters of component A and 25 microliters of component B.Once the five minutes have elapsed, add 50 microliters of the selection cocktail to the cells, and incubate for a further five minutes at room temperature.Vortex the microspheres for 45 seconds. Then add 80 microliters of microspheres per one milliliter of sample, and incubate for three minutes at room temperature. Next, add recommended medium up to the 2.5 milliliter mark on the polystyrene tube.Put the tube in the magnetic holder for three minutes at room temperature. After the incubation, slowly pour out the medium into a 15-milliliter polystyrene tube still in the magnet. Repeat the magnetic separation three more times, each time adding recommended medium up to the 2.5 milliliter mark.After the last magnetic separation, add three milliliters of growth medium, and count the number of cells using a cell counter. Plate the cells in poly-D-lysine-coated plates for treatments. Plate the negative fraction from the 15-milliliter tube, which mostly contains astrocytes, in T75 flasks.After at least six hours of incubation in a 37-degree Celsius incubator, replace all the growth medium in the flasks containing the negative fraction before returning to the incubator. This image shows immunocytochemistry of an isolated microglial culture probed for IBA, a marker of microglia in the green channel, and GFAP, a marker of astrocytes, in the red channel. Hoechst staining reveals the presence of cell nuclei.The absence of GFAP-positive cells demonstrates that microglia isolated using the CD11b positive selection kit, too, have high purity. These immunoblotted proteins from an isolated microglial culture were probed for GFAP, which appears as an approximately 51-kilodalton band, and IBA1, which appears as an approximately 15-kilodalton band. Beta-actin was used as a loading control and appears at approximately 42-kilodaltons.A problem with the old isolation kit was that PE fluorescence could be observed in the red channel as seen here. The modified procedure does not produce any auto-fluorescence from the magnetic beads, as seen in the red channel here. The microglia isolated using this procedure can be used for signaling studies.Western blot analysis shows that Fyn and phospho-src tyrosine Y416 can be detected from microglia isolated with our newly-refined method. The negative fraction from the microglial separation contains astrocytes that can be used for signaling studies. Western blotting shows that the negative fraction contains GFAP-positive cells.Western blot analysis shows that Fyn and phospho-src tyrosine Y416 can be detected from the GFAP-positive cells. Following this procedure, other methods, like multi-channel fluorescence microscopy, western blotting, and quantitative PCR, can be performed to answer questions regarding gene expression and protein signaling. After watching this video, you should have a good understanding of how to utilize this rapid isolation technique for the purposes of microglial experimentation.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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L&#39;uso di Spettroscopia di Risonanza Magnetica come uno strumento per la misura della Bi-emisferici transcraniali elettrici effetti di stimolazione sul motore principale Cortex Metabolismo

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Neuroscienze

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

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Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...

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Isolation and Culture of Primary Neurons and Glia from Adult Rat Urinary Bladder

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Isolamento magnetico di cellule microgliali da topo neonato per colture cellulari primarie

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Colture primarie di astrociti e microglia di ratto e loro utilizzo nello studio della sclerosi laterale amiotrofica

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...