Name: sequential salt extractions for the analysis of bulk chromatin binding properties of chromatin modifying complexes
Uploaded: 2017-10-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes at JoVE.com

وأيد هذا العمل على جائزة باحث الخامس (V2014-004) وباحث الخامس بالإضافة إلى جائزة (D2016-030) من مؤسسة الخامس "بحوث السرطان"، وأمريكا سرطان المجتمع المؤسسية منحة بحثية (ACS سيبحث المنحة 58-006-53) إلى مركز جامعة بوردو عن السرطان البحث. أ وأيد "منح الهبات بورتش الدراسات العليا" إلى إدارة الصيدلة الجزيئية والكيمياء الدوائية جامعة بوردو ب. غ..

1-الاستعدادات السكروز <ol><li>تحضير 100 مل من محلول ناقص التوتر "المخزن المؤقت ج:" 0.3 متر، 60 ملم بوكل، 60 ملم تريس pH 8.0، 2 مم يدتا، و 0.5% NP-40. تخزين في درجة مئوية 4- 
	ملاحظة: بعض خطوط الخلايا، مثل HEK293T، تتطلب الظروف ليسينج أقل صرامة. إذا نوى بسهولة، استخدام تعديل المخزن المؤقت ج: 25 مم هيبيس درجة الحموض...

<ol>
	<li>Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+structure+and+the+organization+of+the+nucleosome.">Histone structure and the organization of the nucleosome.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 83-112 (1997).</li><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications.">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Rese. 21 (3), 381-395 (2011).</li><li>Musselman, C. A., Lalonde, M. -. E., C&#244;t&#233;, J., Kutateladze, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perceiving+the+epigenetic+landscape+through+histone+readers.">Perceiving the epigenetic landscape through histone readers.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).</li><li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+and+beyond:+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions.">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Wu, S. Y., Lee, A. Y., Lai, H. T., Zhang, H., Chiang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospho+switch+triggers+brd4+chromatin+binding+and+activator+recruitment+for+gene-specific+targeting.">Phospho switch triggers brd4 chromatin binding and activator recruitment for gene-specific targeting.</a> Mol Cell. 49 (5), 843-857 (2013).</li><li>Porter, E. G., Dykhuizen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+bromodomains+of+Polybromo-1+contribute+to+chromatin+association+and+tumor+suppression+in+clear+cell+renal+carcinoma.">Individual bromodomains of Polybromo-1 contribute to chromatin association and tumor suppression in clear cell renal carcinoma.</a> J Biol Chem. 292 (7), 2601-2610 (2017).</li><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+group+complexes--many+combinations,+many+functions.">Polycomb group complexes--many combinations, many functions.</a> Trends cell biol. 19 (12), 692-704 (2009).</li><li>Filippakopoulos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+BET+bromodomains.">Selective inhibition of BET bromodomains.</a> Nature. 468 (7327), 1067-1073 (2010).</li><li>Filippakopoulos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+recognition+and+large-scale+structural+analysis+of+the+human+bromodomain+family.">Histone recognition and large-scale structural analysis of the human bromodomain family.</a> Cell. 149 (1), 214-231 (2012).</li><li>Sanchez, R., Zhou, M. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+human+bromodomains+in+chromatin+biology+and+gene+transcription.">The role of human bromodomains in chromatin biology and gene transcription.</a> Curr opin drug disc dev. 12 (5), 659-665 (2009).</li><li>Yang, F., Teves, S. S., Kemp, C. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin,+DNA+torsion,+and+chromatin+dynamics.">Doxorubicin, DNA torsion, and chromatin dynamics.</a> Biochim. Biophys. Acta - Rev Cancer. 1845 (1), 84-89 (2014).</li><li>Kakarougkas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+PBAF+in+Transcriptional+Repression+and+Repair+at+DNA+Breaks+in+Actively+Transcribed+Regions+of+Chromatin.">Requirement for PBAF in Transcriptional Repression and Repair at DNA Breaks in Actively Transcribed Regions of Chromatin.</a> Mol Cell. 55 (5), 723-732 (2014).</li><li>Lee, S. Y., Park, J. -. H., Kim, S., Park, E. -. J., Yun, Y., Kwon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomics+approach+for+the+identification+of+nucleophosmin+and+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+C1/C2+as+chromatin-binding+proteins+in+response+to+DNA+double-strand+breaks.">A proteomics approach for the identification of nucleophosmin and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C1/C2 as chromatin-binding proteins in response to DNA double-strand breaks.</a> Biochem J. 388 (Pt 1), (2005).</li><li>Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopBP1+Regulates+Human+Papillomavirus+Type+16+E2+Interaction+with+Chromatin.">TopBP1 Regulates Human Papillomavirus Type 16 E2 Interaction with Chromatin.</a> J Virol. 81 (8), 4338-4342 (2007).</li></ol>

وصف التفاعلات بين البروتينات والكروماتين من خلال عمليات استخراج الملح هو أسلوب شائع التي استخدمت لعقود14،15؛ بيد أنه قد لا تم بشكل منهجي الأمثل قبل الكشف عن فائدته بالكامل. علينا أن نظهر كيف يوفر هذا الأسلوب المتسلسل بطريقة سريعة وغير مكلفة لتمييز التغييرات...

تنظيم الحمض النووي في الخلايا حقيقية النواة هو نظام معقد ومتطورة هو رقابة مشددة من جانب مجموعة متنوعة بروتينات بتنسيق الاستجابات للمثيرات داخل الخلية وخارج الخلية. الحمض النووي هو الملتفة حول هيستون أوكتاميرس للنموذج نوكليوسوميس، الذي يمكن توزيعها على طول الحمض النووي فضفاضة أو ضغط في اللفات ضيقة1. ويعرف هذا الترتيب الهيكلي للحمض النووي و histones الكروماتين، الذي تنظمه شبكة بروتينات بالقراءة والكتابة، ومحو التعديلات متعدية الجنسيات (PTM) وظيفة في هيستونيس2. تغيير بعض هيستون بتمس، مثل أسيتيلاتيون، المسؤول عن الحمض الأميني تودع، تغيير التفاعلات بين هيستونيس والحمض النووي2. هيستون بتمس تخدم أيضا تجنيد المنظمين النسخي، remodelers الكروماتين، وآلية إصلاح تلف الحمض النووي، وآلات النسخ المتماثل الحمض النووي لمناطق محددة من الجينوم3.
معظم طرق لدراسة التفاعلات بين لونين أما التحقيق التفاعلات صغيرة الحجم أو تنطوي على تحليلات المجين على نطاق كبير. كثيرا ما تستخدم في المختبر ملزمة الدراسات الفردية المجالات المؤتلف مع الببتيدات هيستون أو الحمض النووي في فحوصات مثل الببتيد بولدوونس والاستقطاب الأسفار، التفريد التنقل shift فحوصات (أمسا) والقياس المعايرة متحاور. لأن هذه الاختبارات عادة التركيز على مجال البروتينات فردية، تيسير فهم قطعة صغيرة من اللغز، ولكنها لا تسمح لنا بفهم الطبيعة التعاونية للبروتينات متعددة المجالات، ناهيك عن دورها في البروتين المتعددة المجمعات. تتم إضافة طبقة أخرى من المعضلة بتشكيل مجمعات الكروماتين--تعديل معظم الثدييات غير متجانسة. هذا التغاير البروتين، في تركيبة مع الطبيعة الدينامية للمناظر الطبيعية الكروماتين، يجعل من تحدي بإيجاز في فيفو ملزمة تفاعلات البروتينات الكروماتين على الكروماتين في المختبر.
في فيفو الأساليب تقدما كبيرا؛ ومع ذلك، أنها غالباً مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً، وتحديا من الناحية التقنية. إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين متبوعاً بالتسلسل (الرقائق-seq) مفيد جداً لتحديد التعريب من البروتينات والتعديلات هيستون عبر الجينوم، إلا أن ذلك يتطلب التحسين الكبير4. غالباً ما تكون البروتينات كروسلينكيد بلونين للحفاظ على التفاعلات؛ ومع ذلك، هذا يمكن أن تنتج التفاعلات مصطنعة، وقد يسبب حانمه إخفاء5. وعلاوة على ذلك، تتطلب إيمونوبريسيبيتيشنز (IP) أجسام مضادة محددة للغاية، والتحسين واسعة من قص الحمض النووي وشروط الملكية الفكرية برقاقة--قبكر استخدام موقع ربط معروفة، التي غالباً لا مسبقاًالمتوفرة. بعد تحسين ظروف رقاقة، تجهيز العينات مكلف ويتطلب عدة أسابيع إلى أشهر لتسلسل وتحليل. على الرغم من أن هذا الأسلوب لا تقدر بثمن لتحديد إضفاء الطابع المحلي على الكروماتين ملزمة البروتينات عبر الجينوم، التكلفة والالتزام بالوقت جعله الباهظة لاستخدام هذا الأسلوب لتوليد فرضيات حول كيفية تأثير التغييرات الصغيرة على خصائص الربط العالمي .
في هذه الورقة، ويصف لنا كيف يمكن استخدام مقايسة استخراج ملح متسلسلة (SSE) لفحص ملفات تعريف عالمي ملزم البروتينات المرتبطة الكروماتين وتميز كيف التغييرات في التشكيل جانبي PTM المعقدة، أو العالمية بروتين، يمكن أن يغير التفاعلات. وعلى الرغم من عمليات استخراج الملح تقنية تستخدم عادة، وعلى نطاق واسع، نظهر كيف هذا الأسلوب المتسلسل استنساخه للغاية وتنوعاً. SSE يسمح لنا بوصف كيفية إسهام وحدة فرعية مفردة معقدة أو حتى مجال مفرد إلى التقارب في المجمع العام لمعظم الكروماتين. SSE يمكن استخدامها أيضا لتحديد إذا كان الربط من البروتين تتأثر بالتغيرات في المشهد الكروماتين، وتقديم فرضيات مثيرة للاهتمام لاستهداف مارك هيستون التي يمكن تأكيدها باستخدام رقاقة seq وغيرها من الدراسات على نطاق واسع الجينوم.
ونحن أصلاً تكييف هذا الأسلوب من وو وآخرون، دراسة لوظيفة Polybromo1 (PBRM1) في ربط6،ريموديلير الكروماتين بباف7. باستخدام هذا الأسلوب، تحدد دور PBRM1 لربط الكروماتين داخل الكروماتين بباف يعيد البناء المعقدة وثم تحديد المساهمة النسبية برومودومينس الفردية الستة لهذه الدالة7.
هنا ونحن تصف كيفية تحسين هذه الطريقة لاستكشاف ملزمة الكروماتين في أنواع الخلايا المختلفة، لتقييم تقارب ملزم النسبية من الكروماتين مماثلة تعديل المجمعات، وأن ينظر في تشريد البروتين من الكروماتين مثبط كيميائية، و لتحديد آثار ملزمة الكروماتين بعد التعديلات للمناظر الطبيعية الكروماتين.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>7581-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, Crystal 500 G AR&#168; (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>8360-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride, Granular 500 G AR&#168; (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>6858-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, &#62;=99.9% (titration), crystalline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>4931-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E109-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR&#168; (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>5958-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLYCEROL, 1L</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0854-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0613-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-690-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary mouse IgG HRP-linked</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary rabbit IgG HRP-linked</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>7074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMI-1 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBRM1 antibody</td>
			<td>Bethyl</td>
			<td>A301-591A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARID1a antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-32761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRD4 antibody</td>
			<td>Bethyl</td>
			<td>A301-9852a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+) JQ1</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>11187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAHA</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>10009929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin</td>
			<td>AK Scientific</td>
			<td>25316-40-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Macron</td>
			<td>4948-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Gel Tank</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine (BSA)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0332-100g</td>
			<td>Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>B0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>B0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl Alcohol, Anhydrous</td>
			<td>Macron</td>
			<td>3041-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin kEDTA, 1X</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SODIUM AZIDE, 250g UN1687</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0639-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0227-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine,for electrophoresis, &#62;=99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NW04125BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin Hemisulfate, 5 MG</td>
			<td>RPI Research Products</td>
			<td>22035-0.005</td>
			<td>Used for Protease inhibitor solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APROTININ, 10 MG</td>
			<td>RPI Research Products</td>
			<td>20550-0.01</td>
			<td>Used for Protease inhibitor solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEPSTATIN A, 5 MG</td>
			<td>RPI Research Products</td>
			<td>30100-0.005</td>
			<td>Used for Protease inhibitor solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVCA429 cells</td>
			<td>Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A media</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>10-050-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM), Powder</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>50-011-PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA (100X) non-essential amino acid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Power Source</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13-690-032</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequential salt extractions for the analysis of bulk chromatin binding properties of chromatin modifying complexes

توضيح خصائص ربط الكروماتين استهداف البروتينات يمكن أن تكون صعبة للغاية بسبب الطبيعة المعقدة الكروماتين والطابع غير المتجانس لمجمعات الكروماتين--تعديل معظم الثدييات. وللتغلب على هذه العقبات، نحن قد تكيفت مقايسة استخراج ملح متسلسلة (SSE) لتقييم الانتماءات ملزم النسبية لمجمعات الكروماتين زمنياً. هذا التحليل سهلة ومباشرة يمكن أن يستخدمها غير الخبراء لتقييم الفرق النسبي في ملزمة تقارب من مجمعين ذات الصلة، والتغييرات في تقارب مجمع عند وحدة فرعية يتم فقدان أو يتم إلغاء تنشيطه مجال فردية، والتغيير في ملزمة تقارب بعد التعديلات للمناظر الطبيعية الكروماتين. بشكل تسلسلي إعادة تعليق الكروماتين الأكبر في زيادة كميات من الملح، نحن قادرون على الشخصية شطف بروتين معين من الكروماتين. استخدام ملفات التعريف هذه، نحن قادرون على تحديد كيف تؤثر التعديلات في مجمع الكروماتين--تعديل أو تعديلات على البيئة الكروماتين على التفاعلات ملزمة. اقتران SSE مع غيرها من فحوصات في المختبر و في فيفو ، يمكننا تحديد أدوار المجالات الفردية والبروتينات في وظائف معقدة في مجموعة متنوعة من البيئات الكروماتين.

في هذه الورقة، ونظهر بمزايا وتطبيقات أسلوب استخراج الملح متسلسلة استخداماً (SSE) التي كنا قد تكيفت من الأدب6. في الشكل 1، قارنا إمكانية تكرار نتائج لمشاريع الأعمال الصغيرة لاستخراج البروتينات غير التتابع عن طريق الكشف عن أنماط شطف ARID1a و PBRM1. ونل...

Watch this Scientific Journal Video about Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes at JoVE.com

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

استخراج الملح متسلسلة من البروتينات الكروماتين ملزمة أداة مفيدة لتحديد خصائص ربط مجمعات كبيرة من البروتين. ويمكن استخدام هذا الأسلوب لتقييم دور مفارز الفردية أو المجالات في تقارب شامل بروتين معقدة لمعظم الكروماتين.

عمليات الاستخراج الملح متسلسلة لتحليل الكروماتين الأكبر ربط خصائص لتعديل مجمعات الكروماتين

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

The overall goal of the Sequential Salt Extraction procedure is to characterize protein binding profiles to bulk chromatin and to valuate how the binding is altered when the protein, or its environment, is manipulated. This method measures the relative affinity of epigenetic regulators to chromatin, and can be used to evaluate how those interactions change upon genetic, chemical, and environmental manipulation. The main advantage of this technique is that it is a quick and inexpensive way to evaluate the binding profiles of chromatin-binding proteins.Individuals new to the chromatin field often struggle with chromatin immunoprecipitation, or ChIP. Sequential Salt Extraction is an old technique that even inexperienced scientists can use to answer many of the same questions. To begin the procedure, harvest 8, 000, 000 cells from each cell line of interest.Wash each cell sample with five milliliters of ice cold PBS twice. Resuspend each sample and one milliliter of a hypotonic buffer with protease inhibitors. Transfer the cell suspensions to 1.5 milliliter microcentrifuge tubes.Rotate the suspensions, top over bottom, for 10 minutes at four-degree Celsius, and then centrifuge the suspension for five minutes at this same temperature at 6, 000 G's. Discard the supernatant. Equip a micro pipette with a one milliliter tip.Add to the pellet 200 microliters of salt-free modified ripa buffer with protease inhibitors. Tap the pipette tip against the bottom of the microcentrifuge tube to draw the pellet into the tip. Pipette the pellet up and down 15 times.The sample should become thick and sticky as the pellet breaks up. Homogenize each sample in this way and incubate the samples on ice for three minutes. Then centrifuge the samples at 6500 G's in four-degree Celsius for three minutes.Transfer the supernatants to clean 1.5 milliliter microcentrifuge tubes. To each pellet, add 200 milliliters of modified ripa buffer with 100 millimolar sodium chloride and with protease inhibitors. Pipette the pellet up and down 15 times.If the pellet is initially difficult to draw into the pipette tip, tap the tip on the bottom of the tube. Repeat this process for each sample and incubate the samples on ice for three minutes. Centrifuge the samples at 6500 G's in four-degree Celsius for three minutes.Transfer the supernatants to new 1.5 milliliter microcentrifuge tubes. Continue extracting samples into modified ripa buffer solutions with increasing sodium chloride concentrations. When the pellet no longer stays at the bottom of the tube, place the pellet in the centrifuge tube cap before decanting the supernatant.After the serial salt extraction, for each sample, add 70 milliliters of four times protein loading dye to each of the five supernatant fractions. Load 30 microliters of each fraction onto an SDS acrylamide gel. Perform a standard western blot by transferring the proteins to a membrane and staining with the appropriate primary antibodies.Incubate the blot in secondary antibodies labeled with an infrared dye and image the blot. Use image analysis software to calculate the band intensity of each salt concentration. Plot the band intensity against the salt concentration to determine the elution pattern of the protein of interest.Sequential Salt Extraction of the proteins ARID1a and Polybromo 1 showed consistent elution with salt concentrations of 200 and 300 millimolar, respectively. Non-sequential salt extraction of the same proteins showed less consistent results. The incubation time must be optimized for each protein being examined.Thus, SSE was used to examine elution profiles after varying incubation lengths. A transcriptional activator, Polybromo 1, showed similar elution profiles when incubated for three minutes and 10 minutes. The transcriptional repressor, Polycomb Repressive Complex 1, indicated by BMI1, needed more than three minutes to be released from chromatin.Protein-protein interactions were investigated by examining the change in elution profiles. In the presence of an inhibitor, bromodomain containing protein four alluded at lower salt concentrations than without the inhibitor. Differences in the histone patters were observed when cells were treated with a histone deacetylase inhibitor, altering the landscape of the chromatin.Changes in protein binding when cells experienced genomic stress were also reflected in elution profiles. Here, the increase in salt concentration needed for elution, suggested that Polybromo 1 binds more tightly to chromatin following DNA damage with Doxorubicin. Once mastered, this technique can be done in two to three hours if it is performed properly.While attempting this procedure, remember to be as consistent as possible with your treatment of each sample. This procedure can be used in the initial steps of a study to elucidate the mechanism and regulation of a chromatin-binding protein. This saves time and money on unnecessary genome-wide studies.

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

تحليل ج- كيت يجند المروج باستخدام الكروماتين مناعي

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

جيل من الكروماتين الأصلية إيمونوبريسيبيتيشن تسلسل المكتبات لتحليل كثافة نوكليوسومي

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن (رقاقة) بروتوكول لعينات جنينية وفرة منخفضة

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

الكروماتين انتشار الأعمال التحضيرية لتحليل تطور البويضات الماوس من الطور الأول الطورية الثاني

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

جيل من الكروماتين على نطاق الجينوم تكيف التقاط المكتبات من الأجنة المورفولوجية محكم نظموا في وقت مبكر

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) من "التعديلات هستون" من Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

تكيف تهجين التقاط البروتينات المرتبطة بلونين للبروتينات في خلايا الثدييات

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

ساعد فورمالدهايد عزل العناصر التنظيمية لتدبير الكروماتين الوصول في خلايا الثدييات

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

كريسبر بوساطة إعادة تنظيم هيكل حلقة الكروماتين

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين للنسيج الدهني البنى موريني

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...