Name: sequential salt extractions for the analysis of bulk chromatin binding properties of chromatin modifying complexes
Uploaded: 2017-10-02T13:00:00
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Ce travail a été soutenu par une bourse de chercheur de V (V2014-004) et un érudit V plus award (D2016-030) de la Fondation de V pour la recherche sur le Cancer et un American Cancer Society institutionnels Research Grant (subvention de IRG ACS 58-006-53) vers le centre de l’Université de Purdue pour Cancer Recherche. E. G. P. était accompagnée d’une bourse de dotation supérieure Borch au département de pharmacologie moléculaire et chimie médicinale de la Purdue University.

1. préparations <ol><li>préparer 100 mL d’une solution hypotonique tampon AR. : 0,3 M saccharose, KCl 60 mM, 60 mM Tris pH 8,0, 2 mM EDTA et 0,5 % NP-40. Conserver à 4 ° c. 
	Remarque : Certaines lignées cellulaires, tels que HEK293T, nécessitent des conditions moins strictes de lyse. Si les noyaux lyse facilement, utiliser modification tampon A: 25 mM HEPES pH 7,6, 25 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 0,05 mM EDTA, 0,1 % NP-40 et 10 % de glycérol.</li>
	<li>Préparer une solution 250 mL de solution de 2...

<ol>
	<li>Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+structure+and+the+organization+of+the+nucleosome.">Histone structure and the organization of the nucleosome.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 83-112 (1997).</li><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications.">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Rese. 21 (3), 381-395 (2011).</li><li>Musselman, C. A., Lalonde, M. -. E., C&#244;t&#233;, J., Kutateladze, T. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+human+bromodomains+in+chromatin+biology+and+gene+transcription.">The role of human bromodomains in chromatin biology and gene transcription.</a> Curr opin drug disc dev. 12 (5), 659-665 (2009).</li><li>Yang, F., Teves, S. S., Kemp, C. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin,+DNA+torsion,+and+chromatin+dynamics.">Doxorubicin, DNA torsion, and chromatin dynamics.</a> Biochim. Biophys. Acta - Rev Cancer. 1845 (1), 84-89 (2014).</li><li>Kakarougkas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+PBAF+in+Transcriptional+Repression+and+Repair+at+DNA+Breaks+in+Actively+Transcribed+Regions+of+Chromatin.">Requirement for PBAF in Transcriptional Repression and Repair at DNA Breaks in Actively Transcribed Regions of Chromatin.</a> Mol Cell. 55 (5), 723-732 (2014).</li><li>Lee, S. Y., Park, J. -. H., Kim, S., Park, E. -. J., Yun, Y., Kwon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomics+approach+for+the+identification+of+nucleophosmin+and+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+C1/C2+as+chromatin-binding+proteins+in+response+to+DNA+double-strand+breaks.">A proteomics approach for the identification of nucleophosmin and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C1/C2 as chromatin-binding proteins in response to DNA double-strand breaks.</a> Biochem J. 388 (Pt 1), (2005).</li><li>Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopBP1+Regulates+Human+Papillomavirus+Type+16+E2+Interaction+with+Chromatin.">TopBP1 Regulates Human Papillomavirus Type 16 E2 Interaction with Chromatin.</a> J Virol. 81 (8), 4338-4342 (2007).</li></ol>

Caractérisation des interactions de protéine et la chromatine par extractions sels est une méthode commune qui a été employée pendant des décennies14,15; Toutefois, il n'a pas été systématiquement optimisée avant de révéler son utilité complète. Nous montrons comment cette méthode séquentielle fournit un moyen rapid et peu coûteux de distinguer les changements dans la liaison de la chromatine, lorsque la protéine ou l’environnement est modifi...

Règlement de l’ADN dans les cellules eucaryotes est un système complexe et sophistiqué qui est étroitement contrôlé par un assortiment de protéines que coordonner les réactions aux stimuli intracellulaires et extracellulaires. ADN est enroulé autour d’histone octamères aux nucléosomes forme, qui peuvent être plus ou moins répartis le long de l’ADN ou compactés en serpentins serré1. Cet arrangement structurels de l’ADN et les histones est connu comme la chromatine, qui est régulée par un réseau de protéines que lire, écrire et effacer les modifications post traductionnel (PTM) histones2. Certaines histones SPTM, tels que l’acétylation, changer la charge de l’acide aminé, ils sont déposés sur, modifier les interactions entre les histones et ADN2. Histone SPTM service aussi à recruter des régulateurs transcriptionnels, rénovateurs de la chromatine, machines de réparation des dommages ADN et machinerie de réplication de l’ADN à des régions spécifiques du génome3.
La plupart des méthodes pour étudier les interactions de la chromatine soit sonder les interactions à petite échelle ou impliquent de grandes analyses Génome-large. Études in vitro de liaison utilisent souvent des domaines individuels recombinants peptides histone ou ADN dans les essais comme les essais de déplacement de mobilité électrophorèse (EMSA), la calorimétrie isotherme de titration, polarisation de fluorescence et peptide pulldowns. Parce que ces tests se concentrent généralement sur un domaine de protéines individuelles, ils facilitent la compréhension d’un petit morceau du puzzle, mais ne nous permettent pas de comprendre la nature coopérative de protéines multi-domaine, sans parler de leur rôle en multi-protéines complexes. Une autre couche de complexité est ajoutée par la composition hétérogène de mammifères plus complexes modification de la chromatine. Cette hétérogénéité de protéine, en combinaison avec le caractère dynamique du paysage la chromatine, rend difficile de récapituler in vivo liant les interactions des protéines chromatiniennes à chromatine in vitro.
Méthodes in vivo ont fait des progrès considérables ; Cependant, ils sont souvent coûteux, chronophages et techniquement difficiles. Immunoprécipitation de la chromatine suivie par séquençage (ChIP-seq) est très utile pour déterminer la localisation des protéines et des modifications d’histone au sein du génome, mais il nécessite une optimisation importante4. Les protéines sont souvent réticulé à la chromatine de préserver des interactions ; Toutefois, cela peut produire des interactions artificielles et peut causer épitope masquant5. En outre, l’immunoprécipitation (IP) exige des anticorps hautement spécifiques et vaste optimisation des ADN cisaillement IP conditions par ChIP-qPCR en utilisant un site de liaison connue, ce qui n’est souvent pas disponible a priori. Après l’optimisation des conditions de la puce, traitement des échantillons est coûteuse et nécessite quelques semaines ou mois de séquencer et d’analyser. Bien que cette méthode est précieuse pour identifier la localisation de la chromatine lié protéines au sein du génome, le coût et engagement en temps rendre prohibitifs pour utiliser cette méthode pour générer des hypothèses sur comment les petits changements peuvent affecter des propriétés de liaison de global .
Dans cet article, nous décrivons comment un test d’extraction séquentielle du sel (SSE) peut être utilisé pour examiner les profils de liaison globale des protéines liées à la chromatine et distinguer comment des changements dans un profil PTM protéine complex ou global peuvent modifier les interactions. Bien que les extractions sels sont une technique couramment et largement utilisée, nous démontrons comment cette méthode séquentielle est hautement reproductible et polyvalent. SSE permet de caractériser la façon dont une seule sous-unité d’un immeuble ou même un seul domaine contribue à affinité globale du complexe de la chromatine globale. SSE permet également de déterminer si la liaison d’une protéine est influencée par les changements dans le paysage de la chromatine, fournissant des hypothèses intéressantes pour histone marque ciblant qui peuvent être confirmés à l’aide de ChIP-seq et autres études large de génome.
Nous avons initialement adapté cette méthode de Wu et al., d’examiner la fonction de Polybromo1 (PBRM1) dans la liaison de la PBAF la chromatine rénovateur6,7. En utilisant cette technique, nous avons déterminé le rôle de PBRM1 pour la liaison de la chromatine dans la chromatine PBAF complexe de remodelage et ensuite déterminer la contribution relative des six BROMODOMAINES individuels à cette fonction7.
Nous décrivons ici comment optimiser cette méthode pour explorer la liaison de la chromatine dans différents types de cellules, pour évaluer l’affinité relative de chromatine semblable modification complexes, afin d’examiner le déplacement d’une protéine de la chromatine par un inhibiteur chimique, et pour déterminer les effets de la liaison de la chromatine après modification du paysage de la chromatine.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>7581-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, Crystal 500 G AR&#168; (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>8360-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride, Granular 500 G AR&#168; (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>6858-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, &#62;=99.9% (titration), crystalline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>4931-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E109-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR&#168; (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>5958-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLYCEROL, 1L</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0854-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0613-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-690-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary mouse IgG HRP-linked</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary rabbit IgG HRP-linked</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>7074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMI-1 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBRM1 antibody</td>
			<td>Bethyl</td>
			<td>A301-591A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARID1a antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-32761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRD4 antibody</td>
			<td>Bethyl</td>
			<td>A301-9852a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+) JQ1</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>11187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAHA</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>10009929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin</td>
			<td>AK Scientific</td>
			<td>25316-40-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Macron</td>
			<td>4948-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Gel Tank</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine (BSA)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0332-100g</td>
			<td>Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>B0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>B0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl Alcohol, Anhydrous</td>
			<td>Macron</td>
			<td>3041-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin kEDTA, 1X</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SODIUM AZIDE, 250g UN1687</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0639-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0227-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine,for electrophoresis, &#62;=99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NW04125BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin Hemisulfate, 5 MG</td>
			<td>RPI Research Products</td>
			<td>22035-0.005</td>
			<td>Used for Protease inhibitor solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APROTININ, 10 MG</td>
			<td>RPI Research Products</td>
			<td>20550-0.01</td>
			<td>Used for Protease inhibitor solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEPSTATIN A, 5 MG</td>
			<td>RPI Research Products</td>
			<td>30100-0.005</td>
			<td>Used for Protease inhibitor solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVCA429 cells</td>
			<td>Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A media</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>10-050-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM), Powder</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>50-011-PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA (100X) non-essential amino acid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Power Source</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13-690-032</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequential salt extractions for the analysis of bulk chromatin binding properties of chromatin modifying complexes

Élucider les propriétés de liaison de ciblage de la chromatine des protéines peut être très difficile en raison de la nature complexe de la chromatine et l’hétérogénéité des mammifères plus complexes modification de la chromatine. Afin de surmonter ces obstacles, nous avons adapté un test d’extraction séquentielle du sel (SSE) permettant d’évaluer les affinités de liaison relative de la chromatine lié aux complexes. Ce dosage facile et simple peut être utilisé par des non-spécialistes pour évaluer la différence relative affinité de deux complexes apparentés, les changements dans l’affinité d’un complexe quand une sous-unité est perdue ou d’un domaine individuel est inactivé et le changement de affinité de liaison après modification du paysage de la chromatine. Séquentiellement, re-suspension en vrac la chromatine en augmentant les quantités de sel, nous sommes en mesure de profil l’élution d’une protéine particulière de la chromatine. À l’aide de ces profils, nous sommes en mesure de déterminer l’incidence des altérations dans un complexe de modification de la chromatine ou modifications de l’environnement de la chromatine sur des interactions de liaison. SSE de couplage avec d’autres dosages in vitro et in vivo , nous pouvons déterminer les rôles des domaines individuels et des protéines sur les fonctionnalités d’un complexe à une variété d’environnements de chromatine.

Dans cet article, nous montrons les avantages et les applications de la méthode d’extraction du sel séquentielle couramment utilisés (SSE) que nous nous sommes adaptés de la littérature6. Dans la Figure 1, on compare la reproductibilité du SSE pour extraire des protéines non séquentielle en détectant les profils d’élution des ARID1a et PBRM1. Nous observons constamment que ARID1a, une sous-unité de la BAF, élue surtout ...

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Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Sequential extraction du sel de protéines chromatiniennes lié est un outil utile pour déterminer les propriétés de liaison de complexes protéiques importantes. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer le rôle des sous-unités individuelles ou des domaines de l’affinité globale d’une protéine complexe en bloc de la chromatine.

Extractions séquentielles de sels pour l’analyse de la chromatine en vrac, lier des propriétés de la chromatine modification Complexes

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

The overall goal of the Sequential Salt Extraction procedure is to characterize protein binding profiles to bulk chromatin and to valuate how the binding is altered when the protein, or its environment, is manipulated. This method measures the relative affinity of epigenetic regulators to chromatin, and can be used to evaluate how those interactions change upon genetic, chemical, and environmental manipulation. The main advantage of this technique is that it is a quick and inexpensive way to evaluate the binding profiles of chromatin-binding proteins.Individuals new to the chromatin field often struggle with chromatin immunoprecipitation, or ChIP. Sequential Salt Extraction is an old technique that even inexperienced scientists can use to answer many of the same questions. To begin the procedure, harvest 8, 000, 000 cells from each cell line of interest.Wash each cell sample with five milliliters of ice cold PBS twice. Resuspend each sample and one milliliter of a hypotonic buffer with protease inhibitors. Transfer the cell suspensions to 1.5 milliliter microcentrifuge tubes.Rotate the suspensions, top over bottom, for 10 minutes at four-degree Celsius, and then centrifuge the suspension for five minutes at this same temperature at 6, 000 G's. Discard the supernatant. Equip a micro pipette with a one milliliter tip.Add to the pellet 200 microliters of salt-free modified ripa buffer with protease inhibitors. Tap the pipette tip against the bottom of the microcentrifuge tube to draw the pellet into the tip. Pipette the pellet up and down 15 times.The sample should become thick and sticky as the pellet breaks up. Homogenize each sample in this way and incubate the samples on ice for three minutes. Then centrifuge the samples at 6500 G's in four-degree Celsius for three minutes.Transfer the supernatants to clean 1.5 milliliter microcentrifuge tubes. To each pellet, add 200 milliliters of modified ripa buffer with 100 millimolar sodium chloride and with protease inhibitors. Pipette the pellet up and down 15 times.If the pellet is initially difficult to draw into the pipette tip, tap the tip on the bottom of the tube. Repeat this process for each sample and incubate the samples on ice for three minutes. Centrifuge the samples at 6500 G's in four-degree Celsius for three minutes.Transfer the supernatants to new 1.5 milliliter microcentrifuge tubes. Continue extracting samples into modified ripa buffer solutions with increasing sodium chloride concentrations. When the pellet no longer stays at the bottom of the tube, place the pellet in the centrifuge tube cap before decanting the supernatant.After the serial salt extraction, for each sample, add 70 milliliters of four times protein loading dye to each of the five supernatant fractions. Load 30 microliters of each fraction onto an SDS acrylamide gel. Perform a standard western blot by transferring the proteins to a membrane and staining with the appropriate primary antibodies.Incubate the blot in secondary antibodies labeled with an infrared dye and image the blot. Use image analysis software to calculate the band intensity of each salt concentration. Plot the band intensity against the salt concentration to determine the elution pattern of the protein of interest.Sequential Salt Extraction of the proteins ARID1a and Polybromo 1 showed consistent elution with salt concentrations of 200 and 300 millimolar, respectively. Non-sequential salt extraction of the same proteins showed less consistent results. The incubation time must be optimized for each protein being examined.Thus, SSE was used to examine elution profiles after varying incubation lengths. A transcriptional activator, Polybromo 1, showed similar elution profiles when incubated for three minutes and 10 minutes. The transcriptional repressor, Polycomb Repressive Complex 1, indicated by BMI1, needed more than three minutes to be released from chromatin.Protein-protein interactions were investigated by examining the change in elution profiles. In the presence of an inhibitor, bromodomain containing protein four alluded at lower salt concentrations than without the inhibitor. Differences in the histone patters were observed when cells were treated with a histone deacetylase inhibitor, altering the landscape of the chromatin.Changes in protein binding when cells experienced genomic stress were also reflected in elution profiles. Here, the increase in salt concentration needed for elution, suggested that Polybromo 1 binds more tightly to chromatin following DNA damage with Doxorubicin. Once mastered, this technique can be done in two to three hours if it is performed properly.While attempting this procedure, remember to be as consistent as possible with your treatment of each sample. This procedure can be used in the initial steps of a study to elucidate the mechanism and regulation of a chromatin-binding protein. This saves time and money on unnecessary genome-wide studies.

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Genetics

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Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatine protocole d’immunoprécipitation (puce) pour les échantillons embryonnaires de faible abondance

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

La chromatine propager des préparations pour l’analyse de Progression d’ovocyte de souris de la Prophase à la métaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Génération de chromatine Genome-wide Conformation Capture bibliothèques d’embryons de drosophile début étroitement mise en scène

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) des Modifications d’Histone de Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

Adaptation de l’hybridation prise de protéines associées à la chromatine pour la protéomique pour les cellules de mammifères

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

Formaldéhyde-assisted isolement des éléments régulateurs à mesure accessibilité de la chromatine dans les cellules de mammifères

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR induite par la réorganisation de la Structure de la chromatine boucle

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Immunoprécipitation de la chromatine du murin tissu adipeux brun

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...