Name: sequential salt extractions for the analysis of bulk chromatin binding properties of chromatin modifying complexes
Uploaded: 2017-10-02T13:00:00
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이 작품은 암에 대 한 V 학자 상 (V2014-004)와 V 학자 플러스 퍼듀 대학 센터에서 암 연구를 위한 V 재단과 미국의 암 사회 제도적 연구 그랜트 (ACS IRG 그랜트 58-006-53) 수상 (D2016-030)에 의해 지원 되었다 연구입니다. E. G. P. Borch 대학원 기금 상을 퍼듀 대학 약 화학 및 분자 약리학 부에 의해 지원 되었다.

1. 준비 <ol><li>소형 솔루션 버퍼 a: 0.3 M의 준비 100 mL 자당, 60 m m KCl, 60 mM Tris pH 8.0, 2 mM EDTA, 그리고 0.5 %NP-40. 스토어 4 º C. 
	참고: 일부 셀 라인, HEK293T, 등 덜 엄격한 lysing 조건 필요합니다. 핵 lyse 쉽게를 사용 하 여 수정 버퍼 a: 25 mM HEPES pH 7.6, 25 m m KCl, 5 mM MgCl 2, 0.05 m m EDTA, 0.1 %NP-40, 및 10% 글리세롤.</li>
	<li>2 x mRIPA 솔루션의 250 mL 재고 솔루션을 준비: 100 mM Tris pH 8.0, 2 %NP-40, 그리고 0.5% 나?...

<ol>
	<li>Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+structure+and+the+organization+of+the+nucleosome.">Histone structure and the organization of the nucleosome.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 83-112 (1997).</li><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications.">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Rese. 21 (3), 381-395 (2011).</li><li>Musselman, C. A., Lalonde, M. -. E., C&#244;t&#233;, J., Kutateladze, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perceiving+the+epigenetic+landscape+through+histone+readers.">Perceiving the epigenetic landscape through histone readers.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).</li><li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+and+beyond:+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions.">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Wu, S. Y., Lee, A. Y., Lai, H. T., Zhang, H., Chiang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospho+switch+triggers+brd4+chromatin+binding+and+activator+recruitment+for+gene-specific+targeting.">Phospho switch triggers brd4 chromatin binding and activator recruitment for gene-specific targeting.</a> Mol Cell. 49 (5), 843-857 (2013).</li><li>Porter, E. G., Dykhuizen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+bromodomains+of+Polybromo-1+contribute+to+chromatin+association+and+tumor+suppression+in+clear+cell+renal+carcinoma.">Individual bromodomains of Polybromo-1 contribute to chromatin association and tumor suppression in clear cell renal carcinoma.</a> J Biol Chem. 292 (7), 2601-2610 (2017).</li><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+group+complexes--many+combinations,+many+functions.">Polycomb group complexes--many combinations, many functions.</a> Trends cell biol. 19 (12), 692-704 (2009).</li><li>Filippakopoulos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+BET+bromodomains.">Selective inhibition of BET bromodomains.</a> Nature. 468 (7327), 1067-1073 (2010).</li><li>Filippakopoulos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+recognition+and+large-scale+structural+analysis+of+the+human+bromodomain+family.">Histone recognition and large-scale structural analysis of the human bromodomain family.</a> Cell. 149 (1), 214-231 (2012).</li><li>Sanchez, R., Zhou, M. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+human+bromodomains+in+chromatin+biology+and+gene+transcription.">The role of human bromodomains in chromatin biology and gene transcription.</a> Curr opin drug disc dev. 12 (5), 659-665 (2009).</li><li>Yang, F., Teves, S. S., Kemp, C. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin,+DNA+torsion,+and+chromatin+dynamics.">Doxorubicin, DNA torsion, and chromatin dynamics.</a> Biochim. Biophys. Acta - Rev Cancer. 1845 (1), 84-89 (2014).</li><li>Kakarougkas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+PBAF+in+Transcriptional+Repression+and+Repair+at+DNA+Breaks+in+Actively+Transcribed+Regions+of+Chromatin.">Requirement for PBAF in Transcriptional Repression and Repair at DNA Breaks in Actively Transcribed Regions of Chromatin.</a> Mol Cell. 55 (5), 723-732 (2014).</li><li>Lee, S. Y., Park, J. -. H., Kim, S., Park, E. -. J., Yun, Y., Kwon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomics+approach+for+the+identification+of+nucleophosmin+and+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+C1/C2+as+chromatin-binding+proteins+in+response+to+DNA+double-strand+breaks.">A proteomics approach for the identification of nucleophosmin and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C1/C2 as chromatin-binding proteins in response to DNA double-strand breaks.</a> Biochem J. 388 (Pt 1), (2005).</li><li>Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopBP1+Regulates+Human+Papillomavirus+Type+16+E2+Interaction+with+Chromatin.">TopBP1 Regulates Human Papillomavirus Type 16 E2 Interaction with Chromatin.</a> J Virol. 81 (8), 4338-4342 (2007).</li></ol>

소금 기사를 통해 chromatin와 단백질 상호 작용의 일반적인 고용 되어 수십 년14,15; 그러나, 이것은 하지 되어 체계적으로 최적화 하기 전에 그것의 전체 유틸리티를 공개. 이 순차 방법 단백질 또는 환경을 변경 하는 때 chromatin 바인딩에 변화를 구별 하는 신속 하 고 저렴 한 방법을 제공 하는 방법을 보여 줍니다. SSE 매우 적응 하 고, 최적화할 수 이며 중?...

진 핵 세포에서 DNA 규칙은 세포내와 세포 외 자극에 응답을 협조 하는 단백질의 구색에 의해 엄격 하 게 제어 하는 복잡 하 고 정교한 시스템 이다. DNA는 히스톤 octamers 느슨하게 DNA 따라 분포 하거나 꽉 코일1로 압축 될 수 있는 형태로 nucleosomes 주변 감 쌌 다. DNA와 히스톤의이 구조 배열 읽기, 쓰기 및 지우기 히스톤2포스트 번역 상 수정 (PTM)는 단백질의 네트워크에 의해 통제 된다 chromatin로 알려져 있다. 일부 히스톤 PTMs, acetylation, 등 그들은 히스톤과 DNA2사이 상호 작용을 변경, 입금은 아미노산의 변경. 히스톤 PTMs 모집 transcriptional 레 귤 레이 터, chromatin remodelers, DNA 손상 복구 기계, 및 게놈3의 특정 지역에 DNA 복제 기계를 또한 제공 합니다.
대부분 방법 chromatin 상호 작용을 공부 하 고 작은 규모의 상호 작용을 조사 하거나 큰 게놈 넓은 분석을 포함 합니다. 바인딩 연구 생체 외에서 종종 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (EMSA), 등온선 적정 열 량 측정, 형광 편광, 펩 티 드 pulldowns 등 분석 실험에서 히스톤 펩 티 드 또는 DNA 재조합 개별 도메인을 사용합니다. 이 분석 실험 일반적으로 개별 단백질 도메인에 초점을, 때문에 그들은 퍼즐의 작은 조각의 이해를 촉진 하지만 다중 단백질에서 협력 성격의 다중 도메인 단백질, 혼자 그들의 역할을 이해 하 고 우리를 허용 하지 않습니다. 단지입니다. 필연적인의 또 다른 레이어는 대부분 포유류 chromatin 수정 복합물의 이기종 구성에 의해 추가 됩니다. 이 단백질이 질 chromatin 프리의 동적 특성을 함께에서 하면 도전 하는 비보에 바인딩 chromatin 단백질의 상호 작용 chromatin 시험관을 정리 있습니다.
Vivo에서 방법을 만든 중요 한 발전; 그러나, 그들은 종종 비싼, 시간이 소모 및 기술적으로 도전입니다. 그러나 그것 요구 한다 상당한 최적화4chromatin immunoprecipitation 시퀀싱 (칩 seq) 이어서 전체 게놈, 단백질 및 히스톤 수정 현지화를 결정 하는 데 매우 유용 하다. 단백질 상호 작용; 보존 하는 chromatin 가교 화 들은 그러나,이 인공 상호 작용을 일으켜서 고5마스킹 epitope를 발생할 수 있습니다. 또한, immunoprecipitations (IP) 매우 특정 항 체와 DNA 전단 및 칩-정량은 종종 사용할 수의 선험적으로알려진된 바인딩 사이트를 사용 하 여 IP 조건의 광범위 한 최적화를 필요로 합니다. 칩 조건의 최적화, 후 샘플의 처리 비용이 많이 드는 고 시퀀싱 분석을 개월에 몇 주를 요구 한다. 이 방법은 유용 하지만 게놈, 비용에서 단백질 바인딩된 chromatin의 지역화를 식별 및 약속 시간을 작은 변화 글로벌 바인딩 속성에 영향을 미칠 수 있습니다 방법에 대 한 가설을 생성 하려면이 메서드를 사용 하 여 금지 .
이 문서에서 우리는 chromatin-바인딩 단백질의 글로벌 바인딩 프로필을 검토 하 고 단백질, 복잡 한, 또는 글로벌 PTM 프로필에 변경 상호 작용을 변경할 수 있습니다 어떻게 구별 하는 순차적 소금 추출 (SSE) 분석 결과 사용 하는 방법을 설명 합니다. 소금 기사는 일반적으로 광범위 하 게 사용된 하는 기술, 어떻게이 순차적 방법은 매우 재현 가능 하 고 다양 한 설명 합니다. SSE 특성을 어떻게 복잡 한 또는 심지어 단일 도메인의 단일 소 단위 대량 chromatin에 대 한 복잡 한의 전반적인 선호도에 기여 수 있습니다. SSE 경우 단백질의 바인딩을 영향을 변화 chromatin 풍경에 의해 칩 seq와 다른 게놈 넓은 연구를 사용 하 여 확인 될 수 있는 히스톤 마크 대상에 대 한 흥미로운 가설을 제공 하는 결정을 하기 위해 사용할 수 있습니다.
우리는 원래 적응이 방법에서 우 외., Polybromo1의 기능 검사 (PBRM1) PBAF chromatin remodeler6,7의 바인딩에. 이 기술을 사용 하 여, 우리는 PBAF chromatin 개장 하는 복잡 한 내에서 chromatin 바인딩에 대 한 PBRM1의 역할을 결정 하 고이 함수7에 6 개의 개별 bromodomains의 상대적 기여도 결정.
여기 우리가 화학 억제 물에 의해 단백질 chromatin에서의 변위를 검사를 다른 세포 유형, 단지, 수정 하는 비슷한 chromatin의 상대적 바인딩 선호도 평가에서 chromatin 바인딩 탐험이 방법을 최적화 하는 방법에 설명 하 고 chromatin 바인딩 chromatin 풍경에 변경 후의 효과 결정 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>7581-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, Crystal 500 G AR&#168; (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>8360-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride, Granular 500 G AR&#168; (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>6858-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, &#62;=99.9% (titration), crystalline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>4931-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E109-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR&#168; (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>5958-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLYCEROL, 1L</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0854-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0613-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-690-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary mouse IgG HRP-linked</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary rabbit IgG HRP-linked</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>7074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMI-1 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBRM1 antibody</td>
			<td>Bethyl</td>
			<td>A301-591A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARID1a antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-32761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRD4 antibody</td>
			<td>Bethyl</td>
			<td>A301-9852a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+) JQ1</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>11187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAHA</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>10009929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin</td>
			<td>AK Scientific</td>
			<td>25316-40-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Macron</td>
			<td>4948-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Gel Tank</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine (BSA)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0332-100g</td>
			<td>Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>B0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>B0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl Alcohol, Anhydrous</td>
			<td>Macron</td>
			<td>3041-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin kEDTA, 1X</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SODIUM AZIDE, 250g UN1687</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0639-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0227-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine,for electrophoresis, &#62;=99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NW04125BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin Hemisulfate, 5 MG</td>
			<td>RPI Research Products</td>
			<td>22035-0.005</td>
			<td>Used for Protease inhibitor solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APROTININ, 10 MG</td>
			<td>RPI Research Products</td>
			<td>20550-0.01</td>
			<td>Used for Protease inhibitor solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEPSTATIN A, 5 MG</td>
			<td>RPI Research Products</td>
			<td>30100-0.005</td>
			<td>Used for Protease inhibitor solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVCA429 cells</td>
			<td>Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A media</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>10-050-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM), Powder</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>50-011-PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA (100X) non-essential amino acid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Power Source</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13-690-032</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequential salt extractions for the analysis of bulk chromatin binding properties of chromatin modifying complexes

Chromatin 대상으로 단백질의 바인딩 속성의 매우 chromatin의 복잡 한 본질 및 가장 포유류 chromatin 수정 복합물의 다른 유형의 자연 전하실 수 있습니다. 이러한 장애물을 극복 하기 위해 우리 chromatin 바인딩된 단지의 상대적 바인딩 선호도 평가 하기 위한 순차적 소금 추출 (SSE) 분석 결과 적응 시켰다. 이 쉽고 간단 분석 결과 비 전문가 바인딩 두 관련된 복합물, 복잡 한 소 단위는 손실 또는 개별 도메인 비활성화의 선호도 변화 및 변화에의 선호도에 상대적 차이 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. chromatin 가로로 변경 후 바인딩 선호도입니다. 순차적으로 다시 소금의 양을 증가에 대량 chromatin 중단, 우리 chromatin에서 특정 단백질의 차입을 프로 파일링 할 수 있습니다. 이러한 프로필을 사용 하 여, 우리 chromatin 수정 복잡 한 변경 또는 변경 chromatin 환경에 미치는 바인딩 상호 작용을 확인할 수 있습니다. 다른 생체 외에서 그리고 vivo에서 분석 실험에 SSE 결합해, 개별 도메인 및 다양 한 염색 질 환경에서에서 복잡 한 기능에 단백질의 역할을 확인할 수 있습니다 우리.

이 논문에서는, 장점과 우리 문학6에서 적응 하는 일반적으로 사용 되 순차적 소금 추출 (SSE) 메서드의 응용 프로그램을 설명 합니다. 그림 1, 우리는 비-순차적으로 ARID1a와 PBRM1의 차입 패턴을 감지 하 여 단백질을 추출에 SSE의 재현성을 비교 합니다. 우리는 지속적으로 ARID1a, BAF 소 단위 NaCl 및 PBRM1, 독점적인 PBAF 소 단위 200mm에서 주?...

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Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Chromatin 바인딩 단백질의 순차적 소금 추출 큰 단백질 복합물의 바인딩 속성을 결정 하기 위한 유용한 도구입니다. 개별 하위 단위 또는 단백질 복잡 한 대량 chromatin의 전반적인 선호도에 도메인의 역할을 평가 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다.

바인딩 속성 수정 복합물 Chromatin의 대량 Chromatin의 분석에 대 한 순차적 소금 기사

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

The overall goal of the Sequential Salt Extraction procedure is to characterize protein binding profiles to bulk chromatin and to valuate how the binding is altered when the protein, or its environment, is manipulated. This method measures the relative affinity of epigenetic regulators to chromatin, and can be used to evaluate how those interactions change upon genetic, chemical, and environmental manipulation. The main advantage of this technique is that it is a quick and inexpensive way to evaluate the binding profiles of chromatin-binding proteins.Individuals new to the chromatin field often struggle with chromatin immunoprecipitation, or ChIP. Sequential Salt Extraction is an old technique that even inexperienced scientists can use to answer many of the same questions. To begin the procedure, harvest 8, 000, 000 cells from each cell line of interest.Wash each cell sample with five milliliters of ice cold PBS twice. Resuspend each sample and one milliliter of a hypotonic buffer with protease inhibitors. Transfer the cell suspensions to 1.5 milliliter microcentrifuge tubes.Rotate the suspensions, top over bottom, for 10 minutes at four-degree Celsius, and then centrifuge the suspension for five minutes at this same temperature at 6, 000 G's. Discard the supernatant. Equip a micro pipette with a one milliliter tip.Add to the pellet 200 microliters of salt-free modified ripa buffer with protease inhibitors. Tap the pipette tip against the bottom of the microcentrifuge tube to draw the pellet into the tip. Pipette the pellet up and down 15 times.The sample should become thick and sticky as the pellet breaks up. Homogenize each sample in this way and incubate the samples on ice for three minutes. Then centrifuge the samples at 6500 G's in four-degree Celsius for three minutes.Transfer the supernatants to clean 1.5 milliliter microcentrifuge tubes. To each pellet, add 200 milliliters of modified ripa buffer with 100 millimolar sodium chloride and with protease inhibitors. Pipette the pellet up and down 15 times.If the pellet is initially difficult to draw into the pipette tip, tap the tip on the bottom of the tube. Repeat this process for each sample and incubate the samples on ice for three minutes. Centrifuge the samples at 6500 G's in four-degree Celsius for three minutes.Transfer the supernatants to new 1.5 milliliter microcentrifuge tubes. Continue extracting samples into modified ripa buffer solutions with increasing sodium chloride concentrations. When the pellet no longer stays at the bottom of the tube, place the pellet in the centrifuge tube cap before decanting the supernatant.After the serial salt extraction, for each sample, add 70 milliliters of four times protein loading dye to each of the five supernatant fractions. Load 30 microliters of each fraction onto an SDS acrylamide gel. Perform a standard western blot by transferring the proteins to a membrane and staining with the appropriate primary antibodies.Incubate the blot in secondary antibodies labeled with an infrared dye and image the blot. Use image analysis software to calculate the band intensity of each salt concentration. Plot the band intensity against the salt concentration to determine the elution pattern of the protein of interest.Sequential Salt Extraction of the proteins ARID1a and Polybromo 1 showed consistent elution with salt concentrations of 200 and 300 millimolar, respectively. Non-sequential salt extraction of the same proteins showed less consistent results. The incubation time must be optimized for each protein being examined.Thus, SSE was used to examine elution profiles after varying incubation lengths. A transcriptional activator, Polybromo 1, showed similar elution profiles when incubated for three minutes and 10 minutes. The transcriptional repressor, Polycomb Repressive Complex 1, indicated by BMI1, needed more than three minutes to be released from chromatin.Protein-protein interactions were investigated by examining the change in elution profiles. In the presence of an inhibitor, bromodomain containing protein four alluded at lower salt concentrations than without the inhibitor. Differences in the histone patters were observed when cells were treated with a histone deacetylase inhibitor, altering the landscape of the chromatin.Changes in protein binding when cells experienced genomic stress were also reflected in elution profiles. Here, the increase in salt concentration needed for elution, suggested that Polybromo 1 binds more tightly to chromatin following DNA damage with Doxorubicin. Once mastered, this technique can be done in two to three hours if it is performed properly.While attempting this procedure, remember to be as consistent as possible with your treatment of each sample. This procedure can be used in the initial steps of a study to elucidate the mechanism and regulation of a chromatin-binding protein. This saves time and money on unnecessary genome-wide studies.

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Chromatin Immunoprecipitation을 이용한 c-KIT 리간드 프로모터 분석

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

연구

유전학

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

네이티브 Chromatin Immunoprecipitation Nucleosome 밀도 분석을 위한 라이브러리를 시퀀싱의 세대

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

낮은 풍부 배아 샘플 chromatin Immunoprecipitation (칩) 프로토콜

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin 확산 마우스 Oocyte 진행 의향에서 분열 II의 분석에 대 한 준비

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

단단히 준비 초기 초파리 배아에서 게놈 넓은 Chromatin 구조 캡처 라이브러리의 생성

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

히스톤 수정 Saccharomyces cerevisiae 에서 chromatin Immunoprecipitation (칩)

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

교 잡의 적응 포유류 세포 단백질 Chromatin 관련 단백질의 캡처

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

포유류 세포에 측정 Chromatin 접근 규제 요소의 포 름 알 데히드 기반 격리

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Murine 갈색 지방이 많은 직물의 염색 질 Immunoprecipitation

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...