Name: sequential salt extractions for the analysis of bulk chromatin binding properties of chromatin modifying complexes
Uploaded: 2017-10-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por um prêmio de estudioso de V (V2014-004) e um estudioso V plus award (D2016-030) da Fundação para pesquisa do câncer de V e um americano câncer sociedade institucional bolsa de investigação (ACS IRG Grant 58-006-53) para o centro da Universidade de Purdue para câncer Pesquisa. E. G. P. foi apoiado pelo prêmio Borch pós doação ao departamento de farmacologia Molecular e Química Medicinal de Universidade de Purdue.

1. preparações <ol><li>preparar 100 mL de solução hipotônica Buffer r.: 0,3 M de sacarose, o 60 mM KCl, 60 mM Tris pH 8.0, 2 mM EDTA e 0,5% NP-40. Loja a 4 ° c. 
	Nota: Algumas linhas celulares, tais como HEK293T, exigem condições menos rigorosas de Lise. Se núcleos lyse facilmente, utilize d. modificado Buffer r: 25 mM HEPES pH 7,6, 25 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 0,05 mM EDTA, 0,1% NP-40 e 10% de glicerol.</li>
	<li>Prepare uma solução stock de 250 mL de solução de x mRIPA 2: pH de Tris 100mm 8....

<ol>
	<li>Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+structure+and+the+organization+of+the+nucleosome.">Histone structure and the organization of the nucleosome.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 83-112 (1997).</li><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications.">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Rese. 21 (3), 381-395 (2011).</li><li>Musselman, C. A., Lalonde, M. -. E., C&#244;t&#233;, J., Kutateladze, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perceiving+the+epigenetic+landscape+through+histone+readers.">Perceiving the epigenetic landscape through histone readers.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).</li><li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+and+beyond:+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions.">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Wu, S. Y., Lee, A. Y., Lai, H. T., Zhang, H., Chiang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospho+switch+triggers+brd4+chromatin+binding+and+activator+recruitment+for+gene-specific+targeting.">Phospho switch triggers brd4 chromatin binding and activator recruitment for gene-specific targeting.</a> Mol Cell. 49 (5), 843-857 (2013).</li><li>Porter, E. G., Dykhuizen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+bromodomains+of+Polybromo-1+contribute+to+chromatin+association+and+tumor+suppression+in+clear+cell+renal+carcinoma.">Individual bromodomains of Polybromo-1 contribute to chromatin association and tumor suppression in clear cell renal carcinoma.</a> J Biol Chem. 292 (7), 2601-2610 (2017).</li><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+group+complexes--many+combinations,+many+functions.">Polycomb group complexes--many combinations, many functions.</a> Trends cell biol. 19 (12), 692-704 (2009).</li><li>Filippakopoulos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+BET+bromodomains.">Selective inhibition of BET bromodomains.</a> Nature. 468 (7327), 1067-1073 (2010).</li><li>Filippakopoulos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+recognition+and+large-scale+structural+analysis+of+the+human+bromodomain+family.">Histone recognition and large-scale structural analysis of the human bromodomain family.</a> Cell. 149 (1), 214-231 (2012).</li><li>Sanchez, R., Zhou, M. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+human+bromodomains+in+chromatin+biology+and+gene+transcription.">The role of human bromodomains in chromatin biology and gene transcription.</a> Curr opin drug disc dev. 12 (5), 659-665 (2009).</li><li>Yang, F., Teves, S. S., Kemp, C. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin,+DNA+torsion,+and+chromatin+dynamics.">Doxorubicin, DNA torsion, and chromatin dynamics.</a> Biochim. Biophys. Acta - Rev Cancer. 1845 (1), 84-89 (2014).</li><li>Kakarougkas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+PBAF+in+Transcriptional+Repression+and+Repair+at+DNA+Breaks+in+Actively+Transcribed+Regions+of+Chromatin.">Requirement for PBAF in Transcriptional Repression and Repair at DNA Breaks in Actively Transcribed Regions of Chromatin.</a> Mol Cell. 55 (5), 723-732 (2014).</li><li>Lee, S. Y., Park, J. -. H., Kim, S., Park, E. -. J., Yun, Y., Kwon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomics+approach+for+the+identification+of+nucleophosmin+and+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+C1/C2+as+chromatin-binding+proteins+in+response+to+DNA+double-strand+breaks.">A proteomics approach for the identification of nucleophosmin and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C1/C2 as chromatin-binding proteins in response to DNA double-strand breaks.</a> Biochem J. 388 (Pt 1), (2005).</li><li>Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopBP1+Regulates+Human+Papillomavirus+Type+16+E2+Interaction+with+Chromatin.">TopBP1 Regulates Human Papillomavirus Type 16 E2 Interaction with Chromatin.</a> J Virol. 81 (8), 4338-4342 (2007).</li></ol>

Caracterização das interações da proteína e cromatina através da extração de sal é um método comum que tem sido utilizado por décadas de14,15; no entanto, isso não foi sistematicamente otimizado antes de revelar sua utilidade completa. Vamos demonstrar como este método sequencial fornece uma maneira rápida e barata de distinguir entre alterações na ligação de cromatina quando a proteína ou o ambiente é alterado. SSE é altamente adaptável e o...

Regulamento de ADN em células eucarióticas é um sistema complexo e sofisticado que é rigidamente controlado por uma variedade de proteínas que coordenar as respostas aos estímulos intracelulares e extracelulares. DNA é acondicionada em torno do histone octamers para os nucleossomas formulário, que podem ser livremente distribuídos ao longo do DNA ou compactados em bobinas apertado1. Este arranjo estrutural do DNA e histonas é conhecido como cromatina, que é regulada por uma rede de proteínas que ler, escrever e apagar post modificações translacional (PTM) em histonas2. Alguns histona PTMs, tais como a acetilação, mudar a carga de aminoácidos que são depositados, alterando as interações entre histonas e DNA2. Histona PTMs servem também para recrutar reguladores transcricionais, empresas de reestruturação da cromatina, maquinaria de reparo de dano de DNA e maquinaria de replicação do DNA para regiões específicas do genoma3.
A maioria dos métodos para o estudo de interações de cromatina ou sonda interações de pequena escala ou envolvem grandes análises de todo o genoma. Estudos de ligação in vitro , frequentemente, utilizam domínios individuais recombinantes com peptídeos de histona ou DNA, em ensaios, tais como ensaios de turno electroforese mobilidade (EMSA), Calorimetria de Titulação Isotérmica, polarização de fluorescência e peptídeo pulldowns. Porque estes ensaios geralmente se concentram em um domínio de proteínas individuais, eles facilitam a compreensão de uma pequena peça do puzzle, mas não nos permitem compreender a natureza cooperativa de proteínas de vários domínios, muito menos seu papel em várias proteínas complexos. Outra camada de complexidade é adicionada pela composição heterogênea dos mamíferos mais complexos de cromatina-modificando. Esta heterogeneidade de proteína, em combinação com a natureza dinâmica da paisagem da cromatina, torna desafiador para recapitular o na vivo vinculando interações de proteínas da cromatina a cromatina em vitro.
Métodos in vivo têm feito avanços significativos; no entanto, eles são muitas vezes caro, demorado e tecnicamente desafiador. Imunoprecipitação da cromatina, seguida por sequenciamento (ChIP-seq) é muito útil para determinar a localização de proteínas e modificações do histone através do genoma, porém requer substancial otimização4. As proteínas são frequentemente quitosana a cromatina para preservar as interações; no entanto, isto pode produzir interações artificiais e pode causar o epítopo mascaramento5. Além disso, as moleculas (IP) requerem anticorpos altamente específicos e otimização extensiva de DNA cisalhamento e condições IP por ChIP-qPCR usando um sítio de ligação conhecida, que muitas vezes não é disponível a priori. Após a otimização das condições de ChIP, processamento das amostras é dispendioso e requer várias semanas ou meses para sequenciar e analisar. Embora este método é inestimável para identificar a localização da cromatina ligado proteínas através do genoma, o custo e compromisso de torná-lo proibitivo para usar esse método para gerar hipóteses sobre como pequenas mudanças podem afetar Propriedades de associação global .
Neste artigo, descrevemos como um ensaio de extração de sal sequencial (SSE) pode ser usado para examinar os perfis de ligação global de proteínas da cromatina-limite e distinguir como as alterações em uma proteína, complexo, ou global PTM perfil podem alterar interações. Apesar de extração de sal é uma técnica comum e amplamente utilizada, demonstraremos como esse método sequencial é altamente reprodutível e versátil. SSE nos permite caracterizar como uma única subunidade de um complexo ou até mesmo um único domínio contribui para afinidade geral do complexo da cromatina em massa. SSE pode também ser usado para determinar se a ligação de uma proteína é influenciada pelas alterações na paisagem de cromatina, fornecendo hipóteses interessantes para o direcionamento de marca de histona que podem ser confirmados usando ChIP-seq e outros estudos de ampla do genoma.
Adaptamos, originalmente, esse método de Wu et al., para examinar a função de Polybromo1 (PBRM1) na ligação do PBAF cromatina remodeler6,7. Usando esta técnica, determinou o papel de PBRM1 para ligação de cromatina dentro a cromatina PBAF remodelação complexa e determinado a contribuição relativa das seis bromodomains individuais para esta função7.
Aqui descrevemos como otimizar esse método para explorar a ligação da cromatina em diferentes tipos de células, para avaliar a afinidade obrigatória relativa da cromatina semelhante modificando complexos, para examinar o deslocamento de uma proteína de cromatina por um inibidor químico, e para determinar os efeitos da ligação de cromatina após alterações à paisagem da cromatina.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>7581-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, Crystal 500 G AR&#168; (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>8360-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride, Granular 500 G AR&#168; (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>6858-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, &#62;=99.9% (titration), crystalline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>4931-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E109-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR&#168; (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>5958-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLYCEROL, 1L</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0854-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0613-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-690-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary mouse IgG HRP-linked</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary rabbit IgG HRP-linked</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>7074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMI-1 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBRM1 antibody</td>
			<td>Bethyl</td>
			<td>A301-591A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARID1a antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-32761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRD4 antibody</td>
			<td>Bethyl</td>
			<td>A301-9852a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+) JQ1</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>11187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAHA</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>10009929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin</td>
			<td>AK Scientific</td>
			<td>25316-40-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Macron</td>
			<td>4948-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Gel Tank</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine (BSA)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0332-100g</td>
			<td>Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>B0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>B0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl Alcohol, Anhydrous</td>
			<td>Macron</td>
			<td>3041-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin kEDTA, 1X</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SODIUM AZIDE, 250g UN1687</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0639-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0227-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine,for electrophoresis, &#62;=99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NW04125BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin Hemisulfate, 5 MG</td>
			<td>RPI Research Products</td>
			<td>22035-0.005</td>
			<td>Used for Protease inhibitor solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APROTININ, 10 MG</td>
			<td>RPI Research Products</td>
			<td>20550-0.01</td>
			<td>Used for Protease inhibitor solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEPSTATIN A, 5 MG</td>
			<td>RPI Research Products</td>
			<td>30100-0.005</td>
			<td>Used for Protease inhibitor solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVCA429 cells</td>
			<td>Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A media</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>10-050-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM), Powder</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>50-011-PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA (100X) non-essential amino acid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Power Source</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13-690-032</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequential salt extractions for the analysis of bulk chromatin binding properties of chromatin modifying complexes

Elucidação das propriedades de ligação de proteínas da cromatina-direcionamento pode ser muito desafiador devido à natureza complexa da cromatina e a heterogeneidade dos mamíferos mais complexos de cromatina-modificando. Para superar estes obstáculos, adaptámos um ensaio de extração de sal sequencial (SSE) para avaliar as afinidades de ligação relativo dos complexos ligados a cromatina. Este ensaio fácil e simples pode ser usado por não-especialistas para avaliar a diferença relativa na vinculação afinidade de dois complexos relacionados as mudanças na afinidade de um complexo quando uma subunidade é perdida ou um domínio individuais é inativado e a mudança na afinidade de ligação após alterações à paisagem da cromatina. Suspendendo sequencialmente re-cromatina em massa no aumento da quantidade de sal,... somos capazes de perfil de eluição de uma proteína específica da cromatina. Usando esses perfis, somos capazes de determinar como as alterações em um complexo de cromatina-modificando ou alterações no ambiente de cromatina afetam as interações de ligação. SSE de acoplamento com outros ensaios in vitro e em vivo , podemos determinar os papéis de domínios individuais e proteínas sobre a funcionalidade de um complexo em uma variedade de ambientes de cromatina.

Neste artigo, vamos demonstrar as vantagens e aplicações do método comumente usados extração sequencial de sal (SSE) que nós adaptamos do literatura6. Na Figura 1, comparamos a reprodutibilidade do SSE para extrair proteínas não sequencial, detectando os padrões de eluição de ARID1a e PBRM1. Consistentemente, observamos que ARID1a, uma subunidade BAF, elutes principalmente em 200 mM NaCl e PBRM1, uma subunidade PBAF exclusiv...

Watch this Scientific Journal Video about Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes at JoVE.com

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Extração de sal sequencial das proteínas da cromatina vinculada é uma ferramenta útil para determinar as propriedades de vinculação de grandes complexos de proteínas. Esse método pode ser empregado para avaliar o papel das subunidades individuais ou domínios na afinidade total de uma proteína complexa em massa de cromatina.

Extrações de sal sequenciais para a análise da cromatina em massa vincular propriedades de cromatina modificando complexos

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

The overall goal of the Sequential Salt Extraction procedure is to characterize protein binding profiles to bulk chromatin and to valuate how the binding is altered when the protein, or its environment, is manipulated. This method measures the relative affinity of epigenetic regulators to chromatin, and can be used to evaluate how those interactions change upon genetic, chemical, and environmental manipulation. The main advantage of this technique is that it is a quick and inexpensive way to evaluate the binding profiles of chromatin-binding proteins.Individuals new to the chromatin field often struggle with chromatin immunoprecipitation, or ChIP. Sequential Salt Extraction is an old technique that even inexperienced scientists can use to answer many of the same questions. To begin the procedure, harvest 8, 000, 000 cells from each cell line of interest.Wash each cell sample with five milliliters of ice cold PBS twice. Resuspend each sample and one milliliter of a hypotonic buffer with protease inhibitors. Transfer the cell suspensions to 1.5 milliliter microcentrifuge tubes.Rotate the suspensions, top over bottom, for 10 minutes at four-degree Celsius, and then centrifuge the suspension for five minutes at this same temperature at 6, 000 G's. Discard the supernatant. Equip a micro pipette with a one milliliter tip.Add to the pellet 200 microliters of salt-free modified ripa buffer with protease inhibitors. Tap the pipette tip against the bottom of the microcentrifuge tube to draw the pellet into the tip. Pipette the pellet up and down 15 times.The sample should become thick and sticky as the pellet breaks up. Homogenize each sample in this way and incubate the samples on ice for three minutes. Then centrifuge the samples at 6500 G's in four-degree Celsius for three minutes.Transfer the supernatants to clean 1.5 milliliter microcentrifuge tubes. To each pellet, add 200 milliliters of modified ripa buffer with 100 millimolar sodium chloride and with protease inhibitors. Pipette the pellet up and down 15 times.If the pellet is initially difficult to draw into the pipette tip, tap the tip on the bottom of the tube. Repeat this process for each sample and incubate the samples on ice for three minutes. Centrifuge the samples at 6500 G's in four-degree Celsius for three minutes.Transfer the supernatants to new 1.5 milliliter microcentrifuge tubes. Continue extracting samples into modified ripa buffer solutions with increasing sodium chloride concentrations. When the pellet no longer stays at the bottom of the tube, place the pellet in the centrifuge tube cap before decanting the supernatant.After the serial salt extraction, for each sample, add 70 milliliters of four times protein loading dye to each of the five supernatant fractions. Load 30 microliters of each fraction onto an SDS acrylamide gel. Perform a standard western blot by transferring the proteins to a membrane and staining with the appropriate primary antibodies.Incubate the blot in secondary antibodies labeled with an infrared dye and image the blot. Use image analysis software to calculate the band intensity of each salt concentration. Plot the band intensity against the salt concentration to determine the elution pattern of the protein of interest.Sequential Salt Extraction of the proteins ARID1a and Polybromo 1 showed consistent elution with salt concentrations of 200 and 300 millimolar, respectively. Non-sequential salt extraction of the same proteins showed less consistent results. The incubation time must be optimized for each protein being examined.Thus, SSE was used to examine elution profiles after varying incubation lengths. A transcriptional activator, Polybromo 1, showed similar elution profiles when incubated for three minutes and 10 minutes. The transcriptional repressor, Polycomb Repressive Complex 1, indicated by BMI1, needed more than three minutes to be released from chromatin.Protein-protein interactions were investigated by examining the change in elution profiles. In the presence of an inhibitor, bromodomain containing protein four alluded at lower salt concentrations than without the inhibitor. Differences in the histone patters were observed when cells were treated with a histone deacetylase inhibitor, altering the landscape of the chromatin.Changes in protein binding when cells experienced genomic stress were also reflected in elution profiles. Here, the increase in salt concentration needed for elution, suggested that Polybromo 1 binds more tightly to chromatin following DNA damage with Doxorubicin. Once mastered, this technique can be done in two to three hours if it is performed properly.While attempting this procedure, remember to be as consistent as possible with your treatment of each sample. This procedure can be used in the initial steps of a study to elucidate the mechanism and regulation of a chromatin-binding protein. This saves time and money on unnecessary genome-wide studies.

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Análise do Promotor de Ligando C-KIT Usando Imunoprecipitação de Cromatina

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Genética

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Geração de imunoprecipitação da cromatina nativa sequenciamento de bibliotecas para análise da densidade nucleossoma

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Cromatina (ChIP) imunoprecipitação para baixo-abundância embrionárias amostras

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Preparações de espalhamento de cromatina para a análise da progressão de oócitos de camundongo da prófase para a metáfase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Geração de todo o genoma da cromatina conformação captura bibliotecas de firmemente encenado embriões adiantados da drosófila

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Imunoprecipitação de Cromatina (ChIP) de Modificações de Histonas de Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

Adaptação da hibridação capturar de proteínas da cromatina associada para proteômica para células de mamíferos

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

Formaldeído-assistida isolamento de elementos reguladores para acessibilidade de cromatina medida em células de mamíferos

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Mediada por CRISPR reorganização da estrutura de Loop de cromatina

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Imunoprecipitação da cromatina do tecido de adiposo marrom murino

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...