Name: sequential salt extractions for the analysis of bulk chromatin binding properties of chromatin modifying complexes
Uploaded: 2017-10-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes at JoVE.com

Detta arbete stöds av en V scholar award (V2014-004) och en V scholar plus award (D2016-030) från V Stiftelsen för cancerforskning och en amerikansk institutionella forskningsbidrag för Cancer Society (ACS IRG Grant 58-006-53) till Purdue University Center för Cancer Forskning. E. G. P. stöddes av Borch Graduate Endowment tilldelning till Purdue University läkemedelskemi och Molekylär farmakologi institutionen.

1. preparat <ol><li>förbereda 100 mL hypoton lösning buffert A: 0,3 M sackaros, 60 mM KCl, 60 mM Tris pH 8,0, 2 mM EDTA, och 0,5% NP-40. Butik vid 4 °. 
	Obs: Vissa cellinjer, såsom HEK293T, kräver mindre stränga lyseringslösning villkor. Om kärnor lysera enkelt, använda modifierade buffert A: 25 mM HEPES pH 7,6, 25 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 0,05 mM EDTA, 0,1% NP-40, och 10% glycerol.</li>
	<li>Förbereda 250 mL stamlösning av 2 x mRIPA lösning: 100 mM Tris pH 8,0, 2% NP-40, och 0,5% natriumdeoxi...

<ol>
	<li>Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+structure+and+the+organization+of+the+nucleosome.">Histone structure and the organization of the nucleosome.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 83-112 (1997).</li><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications.">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Rese. 21 (3), 381-395 (2011).</li><li>Musselman, C. A., Lalonde, M. -. E., C&#244;t&#233;, J., Kutateladze, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perceiving+the+epigenetic+landscape+through+histone+readers.">Perceiving the epigenetic landscape through histone readers.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).</li><li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+and+beyond:+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions.">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Wu, S. Y., Lee, A. Y., Lai, H. T., Zhang, H., Chiang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospho+switch+triggers+brd4+chromatin+binding+and+activator+recruitment+for+gene-specific+targeting.">Phospho switch triggers brd4 chromatin binding and activator recruitment for gene-specific targeting.</a> Mol Cell. 49 (5), 843-857 (2013).</li><li>Porter, E. G., Dykhuizen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+bromodomains+of+Polybromo-1+contribute+to+chromatin+association+and+tumor+suppression+in+clear+cell+renal+carcinoma.">Individual bromodomains of Polybromo-1 contribute to chromatin association and tumor suppression in clear cell renal carcinoma.</a> J Biol Chem. 292 (7), 2601-2610 (2017).</li><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+group+complexes--many+combinations,+many+functions.">Polycomb group complexes--many combinations, many functions.</a> Trends cell biol. 19 (12), 692-704 (2009).</li><li>Filippakopoulos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+BET+bromodomains.">Selective inhibition of BET bromodomains.</a> Nature. 468 (7327), 1067-1073 (2010).</li><li>Filippakopoulos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+recognition+and+large-scale+structural+analysis+of+the+human+bromodomain+family.">Histone recognition and large-scale structural analysis of the human bromodomain family.</a> Cell. 149 (1), 214-231 (2012).</li><li>Sanchez, R., Zhou, M. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+human+bromodomains+in+chromatin+biology+and+gene+transcription.">The role of human bromodomains in chromatin biology and gene transcription.</a> Curr opin drug disc dev. 12 (5), 659-665 (2009).</li><li>Yang, F., Teves, S. S., Kemp, C. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin,+DNA+torsion,+and+chromatin+dynamics.">Doxorubicin, DNA torsion, and chromatin dynamics.</a> Biochim. Biophys. Acta - Rev Cancer. 1845 (1), 84-89 (2014).</li><li>Kakarougkas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+PBAF+in+Transcriptional+Repression+and+Repair+at+DNA+Breaks+in+Actively+Transcribed+Regions+of+Chromatin.">Requirement for PBAF in Transcriptional Repression and Repair at DNA Breaks in Actively Transcribed Regions of Chromatin.</a> Mol Cell. 55 (5), 723-732 (2014).</li><li>Lee, S. Y., Park, J. -. H., Kim, S., Park, E. -. J., Yun, Y., Kwon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomics+approach+for+the+identification+of+nucleophosmin+and+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+C1/C2+as+chromatin-binding+proteins+in+response+to+DNA+double-strand+breaks.">A proteomics approach for the identification of nucleophosmin and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C1/C2 as chromatin-binding proteins in response to DNA double-strand breaks.</a> Biochem J. 388 (Pt 1), (2005).</li><li>Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopBP1+Regulates+Human+Papillomavirus+Type+16+E2+Interaction+with+Chromatin.">TopBP1 Regulates Human Papillomavirus Type 16 E2 Interaction with Chromatin.</a> J Virol. 81 (8), 4338-4342 (2007).</li></ol>

Karaktärisering av protein och kromatin interaktioner genom salt extraktioner är en vanlig metod som har använts för årtionden14,15. men har det inte systematiskt optimerats innan för att avslöja dess full nytta. Vi visar hur sekventiella metoden ger en snabb och billig sätt att urskilja förändringar i kromatin bindande när proteinet eller miljön förändras. SSE är mycket anpassningsbar och optimerbart, och ännu viktigare, det är tekniskt enkel oc...

DNA förordning i eukaryota celler är en invecklad och sofistikerade system som styrs hårt av ett sortiment av proteiner som samordna Svaren till intracellulär och extracellulär stimuli. DNA är virad runt Histon octamers att bilda nucleosomes, som kan vara löst fördelade längs DNA eller packas in i snäva spolar1. Detta strukturella arrangemang av DNA och histoner som kallas kromatin, som regleras av ett nätverk av proteiner som läsa, skriva och radera inlägget translationella modifieringar (PTM) på histoner2. Vissa Histon PTMs, såsom acetylering, ändra avgiften av den amino syran de sätts på, att förändra samspelet mellan histoner och DNA2. Histon PTMs också fungera att rekrytera transkriptionell regulatorer, kromatin remodelers, DNA skador reparation maskiner och DNA-replikering maskiner till specifika regioner i genomet3.
De flesta metoder för att studera kromatin interaktioner antingen sond småskaliga interaktioner eller involvera stora genome-wide analyser. In vitro studier utnyttjar ofta enskilda rekombinant domäner med Histon peptider eller DNA analyser som elektrofores rörlighet Skift analyser (EMSA), isotermiska titrering calorimetry, fluorescence polarization och peptid pulldowns. Eftersom dessa analyser fokuserar oftast på en enskild protein domän, de underlätta förståelsen av en liten pusselbit, men tillåter inte oss att förstå den kooperativa typ av multi-domän proteiner, för att inte tala om deras roll i flera protein komplex. Ytterligare ett lager av krångliga läggs av den heterogena sammansättningen av mest däggdjur kromatin-ändra komplex. Detta protein heterogenitet, gör i kombination med den dynamiska karaktären av kromatin landskapet, det utmanande för att sammanfatta den i vivo bindande interaktioner av kromatin proteiner till kromatin in vitro.
In vivo -metoder har gjort betydande framsteg; men är de ofta dyrt, tidskrävande och tekniskt utmanande. Kromatin immunoprecipitation följt av sekvensering (ChIP-seq) är mycket användbart för att bestämma localizationen av proteiner och Histon ändringar hela genomet, men det kräver betydande optimering4. Proteiner är ofta tvärbundna till kromatin att bevara interaktioner; men detta kan producera konstgjorda interaktioner och kan orsaka epitop maskering5. Dessutom kräver immunoprecipitations (IP) mycket specifika antikroppar och omfattande optimering av DNA klippning och IP tillstånd av ChIP-qPCR med hjälp av en känd bindningsställe, vilket ofta inte tillgängliga förhand. Efter optimering av ChIP villkor, bearbetning av proverna är kostsamma och kräver flera veckor till månader för att sekvensera och analysera. Även denna metod är ovärderlig för att identifiera lokaliseringen av kromatin bundna proteiner hela genomet, kostnaden och tid engagemang gör det oöverkomliga att använda denna metod för att generera hypoteser om hur små förändringar kan påverka globala bindande boenden .
I den här artikeln beskriver vi hur en sekventiell salt extraktion (SSE) analysen kan användas för att undersöka globalt bindande profiler av kromatin-bundna proteiner och särskilja hur förändringar i en protein, komplexa eller global PTM profil kan ändra interaktioner. Även salt extraktioner är ett vanligt och allmänt använd teknik, visar vi hur denna sekventiell metod är mycket reproducerbara och mångsidig. SSE tillåter oss att karakterisera hur en enda del av ett komplex eller ens en enda domän bidrar till anläggningens totala affinitet för bulk kromatin. SSE kan också användas för att avgöra om bindningen av ett protein påverkas av förändringar i kromatin landskap, som ger intressanta hypoteser för Histon mark inriktning som kan bekräftas med hjälp av ChIP-seq och andra genome bred studier.
Vi ursprungligen anpassat denna metod från Wu et al., pröva funktionen av Polybromo1 (PBRM1) i bindningen av PBAF kromatin remodeler6,7. Med denna teknik, vi bestäms rollen av PBRM1 för kromatin bindande inom PBAF kromatinet remodeling complex och sedan bestäms de sex enskilda bromodomains till denna funktion7relativa bidrag.
Här beskriver vi hur man kan optimera denna metod för att utforska kromatin bindande i olika celltyper, att bedöma det relativa affinitet av liknande kromatin ändra komplex, för att undersöka förskjutningen av ett protein från kromatin genom en kemiska hämmare, och att fastställa effekterna av kromatin bindande efter ändringar av kromatin landskapet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>7581-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, Crystal 500 G AR&#168; (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>8360-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride, Granular 500 G AR&#168; (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>6858-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, &#62;=99.9% (titration), crystalline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>4931-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E109-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR&#168; (ACS)</td>
			<td>Avantor/Macron</td>
			<td>5958-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLYCEROL, 1L</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0854-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0613-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-690-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary mouse IgG HRP-linked</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary rabbit IgG HRP-linked</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>7074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMI-1 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBRM1 antibody</td>
			<td>Bethyl</td>
			<td>A301-591A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARID1a antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-32761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRD4 antibody</td>
			<td>Bethyl</td>
			<td>A301-9852a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+) JQ1</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>11187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAHA</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>10009929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin</td>
			<td>AK Scientific</td>
			<td>25316-40-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Macron</td>
			<td>4948-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Gel Tank</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine (BSA)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0332-100g</td>
			<td>Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>B0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>B0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl Alcohol, Anhydrous</td>
			<td>Macron</td>
			<td>3041-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin kEDTA, 1X</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SODIUM AZIDE, 250g UN1687</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0639-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0227-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine,for electrophoresis, &#62;=99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NW04125BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin Hemisulfate, 5 MG</td>
			<td>RPI Research Products</td>
			<td>22035-0.005</td>
			<td>Used for Protease inhibitor solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APROTININ, 10 MG</td>
			<td>RPI Research Products</td>
			<td>20550-0.01</td>
			<td>Used for Protease inhibitor solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEPSTATIN A, 5 MG</td>
			<td>RPI Research Products</td>
			<td>30100-0.005</td>
			<td>Used for Protease inhibitor solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVCA429 cells</td>
			<td>Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A media</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>10-050-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM), Powder</td>
			<td>Corning Mediatech</td>
			<td>50-011-PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA (100X) non-essential amino acid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Power Source</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13-690-032</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequential salt extractions for the analysis of bulk chromatin binding properties of chromatin modifying complexes

Förtydligandet av kromatin-targeting proteiners bindande egenskaper kan vara mycket utmanande på grund av den komplicerade karaktären av kromatin och mest däggdjur kromatin-ändra komplex heterogena karaktär. För att övervinna dessa hinder, har vi anpassat en sekventiell salt extraktion (SSE) analys för att utvärdera de relativa bindande tillhörighet av kromatin-bundet komplex. Denna enkelt och okomplicerat analys kan användas av icke-experter för att utvärdera den relativa skillnaden i bindande affinitet av två relaterade komplex, förändringar i affinitet av ett komplex när en subenhet går förlorad eller en enskild domän är inaktiverat och förändringen i bindningsaffinitet efter ändringar av kromatin landskapet. Genom att sekventiellt åter avbryta bulk kromatin i ökande mängder av salt, har vi möjlighet att profilera elueringen av ett visst protein från kromatin. Med hjälp av dessa profiler, har vi möjlighet att avgöra hur förändringar i ett kromatin-ändra komplex eller förändringar kromatin miljön påverka bindande interaktioner. Koppling SSE med andra in vitro och in-vivo -analyser, kan vi bestämma enskilda domäner och proteiner på funktionaliteten i ett komplex i en mängd olika kromatin miljöer roller.

I detta papper visar vi fördelar och tillämpningar av metoden ofta används sekventiell salt extraktion (SSE) som vi har anpassat från litteratur6. I figur 1jämför vi reproducerbarheten för SSE att utvinna proteiner icke-sekventiellt genom att upptäcka de eluering mönster av ARID1a och PBRM1. Konsekvent observerar vi att ARID1a, en BAF subenhet, eluerar primärt vid 200 mM NaCl och PBRM1, en exklusiv PBAF-subenhet, eluerar prim...

Watch this Scientific Journal Video about Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes at JoVE.com

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Sekventiell salt utvinning av kromatin bundna proteiner är ett användbart verktyg för att fastställa bindande egenskaper för stora proteinkomplex. Denna metod kan användas för att utvärdera enskilda subenheter eller domäner i den övergripande affinitet av ett proteinkomplex bulk kromatin roll.

Sekventiell Salt extraktioner för analys av Bulk kromatin bindande egenskaper av kromatin ändra komplex

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

The overall goal of the Sequential Salt Extraction procedure is to characterize protein binding profiles to bulk chromatin and to valuate how the binding is altered when the protein, or its environment, is manipulated. This method measures the relative affinity of epigenetic regulators to chromatin, and can be used to evaluate how those interactions change upon genetic, chemical, and environmental manipulation. The main advantage of this technique is that it is a quick and inexpensive way to evaluate the binding profiles of chromatin-binding proteins.Individuals new to the chromatin field often struggle with chromatin immunoprecipitation, or ChIP. Sequential Salt Extraction is an old technique that even inexperienced scientists can use to answer many of the same questions. To begin the procedure, harvest 8, 000, 000 cells from each cell line of interest.Wash each cell sample with five milliliters of ice cold PBS twice. Resuspend each sample and one milliliter of a hypotonic buffer with protease inhibitors. Transfer the cell suspensions to 1.5 milliliter microcentrifuge tubes.Rotate the suspensions, top over bottom, for 10 minutes at four-degree Celsius, and then centrifuge the suspension for five minutes at this same temperature at 6, 000 G's. Discard the supernatant. Equip a micro pipette with a one milliliter tip.Add to the pellet 200 microliters of salt-free modified ripa buffer with protease inhibitors. Tap the pipette tip against the bottom of the microcentrifuge tube to draw the pellet into the tip. Pipette the pellet up and down 15 times.The sample should become thick and sticky as the pellet breaks up. Homogenize each sample in this way and incubate the samples on ice for three minutes. Then centrifuge the samples at 6500 G's in four-degree Celsius for three minutes.Transfer the supernatants to clean 1.5 milliliter microcentrifuge tubes. To each pellet, add 200 milliliters of modified ripa buffer with 100 millimolar sodium chloride and with protease inhibitors. Pipette the pellet up and down 15 times.If the pellet is initially difficult to draw into the pipette tip, tap the tip on the bottom of the tube. Repeat this process for each sample and incubate the samples on ice for three minutes. Centrifuge the samples at 6500 G's in four-degree Celsius for three minutes.Transfer the supernatants to new 1.5 milliliter microcentrifuge tubes. Continue extracting samples into modified ripa buffer solutions with increasing sodium chloride concentrations. When the pellet no longer stays at the bottom of the tube, place the pellet in the centrifuge tube cap before decanting the supernatant.After the serial salt extraction, for each sample, add 70 milliliters of four times protein loading dye to each of the five supernatant fractions. Load 30 microliters of each fraction onto an SDS acrylamide gel. Perform a standard western blot by transferring the proteins to a membrane and staining with the appropriate primary antibodies.Incubate the blot in secondary antibodies labeled with an infrared dye and image the blot. Use image analysis software to calculate the band intensity of each salt concentration. Plot the band intensity against the salt concentration to determine the elution pattern of the protein of interest.Sequential Salt Extraction of the proteins ARID1a and Polybromo 1 showed consistent elution with salt concentrations of 200 and 300 millimolar, respectively. Non-sequential salt extraction of the same proteins showed less consistent results. The incubation time must be optimized for each protein being examined.Thus, SSE was used to examine elution profiles after varying incubation lengths. A transcriptional activator, Polybromo 1, showed similar elution profiles when incubated for three minutes and 10 minutes. The transcriptional repressor, Polycomb Repressive Complex 1, indicated by BMI1, needed more than three minutes to be released from chromatin.Protein-protein interactions were investigated by examining the change in elution profiles. In the presence of an inhibitor, bromodomain containing protein four alluded at lower salt concentrations than without the inhibitor. Differences in the histone patters were observed when cells were treated with a histone deacetylase inhibitor, altering the landscape of the chromatin.Changes in protein binding when cells experienced genomic stress were also reflected in elution profiles. Here, the increase in salt concentration needed for elution, suggested that Polybromo 1 binds more tightly to chromatin following DNA damage with Doxorubicin. Once mastered, this technique can be done in two to three hours if it is performed properly.While attempting this procedure, remember to be as consistent as possible with your treatment of each sample. This procedure can be used in the initial steps of a study to elucidate the mechanism and regulation of a chromatin-binding protein. This saves time and money on unnecessary genome-wide studies.

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Analys av c-KIT-ligand-promotorn med användning av kromatinimmunfällning

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generation av infödda kromatin Immunoprecipitation sekvensering bibliotek för Nucleosome densitet analys

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokoll för låg-överflöd embryonala prover

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Kromatin sprida preparat för analys av mus äggcellen Progression från profas till metafas II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation av Genome-wide kromatin konformation fånga bibliotek från tätt stegvis tidiga Drosophila embryon

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) Histon ändringar från Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

Anpassning av hybridisering fånga av kromatin-associerade proteiner för proteomik för att däggdjursceller

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

Formaldehyd-assisted isolering av reglerande element till åtgärd kromatin tillgänglighet i däggdjursceller

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-medierad omorganiseringen av kromatin Loop struktur

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Kromatin Immunoprecipitation av murina Brun fettvävnad

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...