Name: controllable ion channel expression through inducible transient transfection
Uploaded: 2017-02-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection at JoVE.com

Эта работа была поддержана Израильского научного фонда [гранты 1721/12, 1368/12 и 1444/16] (АП). AP является филиалом Brettler Центра и Дэвид Р. Блум центр, школа фармации, Еврейский университет в Иерусалиме.

1. лигирования представляющего интерес гена в репрессируемый Сайт Vector <ol><li> Получить индуцируемый вектор, такой как pcDNA5 / FRT / TO или pcDNA4 / TO. </li><li> Анализ интересующего гена для любых потенциально восприимчивых сайтов рестрикции в середине гена , который также представлен в сайт множестве...

<ol>
	<li>Ooi, A., Wong, A., Esau, L., Lemtiri-Chlieh, F., Gehring, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Transient+Expression+of+Membrane+Proteins+in+HEK-293+Cells+for+Functional+Characterization.">A Guide to Transient Expression of Membrane Proteins in HEK-293 Cells for Functional Characterization.</a> Frontiers in Physiology. 7, 300 (2016).</li><li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEK293+cell+line:+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins.">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).</li><li>Xu, X., Nagarajan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+sequence+of+the+Chinese+hamster+ovary+(CHO)-K1+cell+line.">The genomic sequence of the Chinese hamster ovary (CHO)-K1 cell line.</a> Nature Biotechnology. 29 (8), 735-741 (2011).</li><li>Hazan, A., Kumar, R., Matzner, H., Priel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pain+receptor+TRPV1+displays+agonist-dependent+activation+stoichiometry.">The pain receptor TRPV1 displays agonist-dependent activation stoichiometry.</a> Scientific reports. 5, 12278 (2015).</li><li>Kumar, R., Hazan, A., Basu, A., Zalcman, N., Matzner, H., Priel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+Residue+in+the+TRPV1+Vanilloid+Binding+Pocket+Regulates+Deactivation+Kinetics.">Tyrosine Residue in the TRPV1 Vanilloid Binding Pocket Regulates Deactivation Kinetics.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (26), 13855-13863 (2016).</li><li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li><li>Preuss, A. K., Connor, J. A., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transfection+induces+different+intracellular+calcium+signaling+in+CHO+K1+versus+HEK+293+cells.">Transient transfection induces different intracellular calcium signaling in CHO K1 versus HEK 293 cells.</a> Cytotechnology. 33 (1-3), 139-145 (2000).</li><li>Dalton, A. C., Barton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-expression+of+secreted+proteins+from+mammalian+cell+lines.">Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines.</a> Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923 (2012).</li><li>Bohlen, C. J., Priel, A., Zhou, S., King, D., Siemens, J., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bivalent+tarantula+toxin+activates+the+capsaicin+receptor,+TRPV1,+by+targeting+the+outer+pore+domain.">A bivalent tarantula toxin activates the capsaicin receptor, TRPV1, by targeting the outer pore domain.</a> Cell. 141 (5), 834-845 (2010).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflu&#776;gers Archiv European journal of physiology. 391 (2), 85-100 (1981).</li><li>Jones, J., Nivitchanyong, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+tetracycline-responsive+recombinant+protein+production+and+effect+on+cell+growth+and+ER+stress+in+mammalian+cells.">Optimization of tetracycline-responsive recombinant protein production and effect on cell growth and ER stress in mammalian cells.</a> Biotechnology and Bioengineering. 91 (6), 722-732 (2005).</li><li>Raphemot, R., Weaver, C. D., Denton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+for+small-molecule+modulators+of+inward+rectifier+potassium+channels.">High-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels.</a> J Vis Exp. (71), e4209 (2013).</li></ol>

Трансфекция широко используемый протокол для экспрессии белка и исследования, с множеством различных вариаций для улучшения консистенции и стабильности экспрессии. Переходные трансфекции реагенты предлагают простой, легкий в использовании протокол, в котором клетка и интерес белок...

Гетерологично экспрессирующих систем является одним из наиболее широко используемых методов для изучения множества клеточных функций 1. Их низкая эндогенный белковый профиль, минимальные требования к техническому обслуживанию, надежный рост, и способность принимать и экспрессии чужеродной ДНК сделали клеточные линии , такие как эмбриональной почки человека (HEK293) и яичника китайского хомячка (СНО) почти существенное значение для биологических исследований , 2, 3. Направления исследований с использованием систем гетерологичной включают мембранные белки, внутриклеточный сигнализацию и ферментативную активность. После трансфекции чужеродной ДНК в клетку, множество различных форм анализа могут быть выполнены, в том числе и электрофизиологических, логометрической визуализации кальция, вестерн - блоттинга и т.д. 4, 5. Благодаря широкому спектру потенциальных приложений для гетерологичных систем экспрессии, многие differeнт реагенты и продукты были разработаны , чтобы использовать эти клетки и их свойства 6. Системы доставки ДНК, которая транзиторно или постоянно интегрируют чужеродной ДНК в клетки для изучения экзогенный белок стал одним из самых популярных и полезных инструментов для биологических исследований. Более конкретно, скоротечно трансфекцию ДНК в клетку широко используется в качестве простой, прямой процесс, который требует относительно мало времени и материалов. Кроме того, вероятность успеха клеток , которые подвергаются трансфекции высок 7. Этот метод очень надежным в сочетании с маркерным геном , такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP), и может быть использован для множества различных методов , таких как изображения кальция и электрофизиологических 5. К сожалению, хотя, скоротечно экспрессии ДНК в клетки-хозяева приходит с некоторыми крупными ловушками, ни в малейшей степени, что уровень экспрессии в клетке является недостоверной. Число копий ДНК плазмиды взяты Uр на одну клетку неуправляема, таким образом , выражение между отдельными экспериментами может сильно различаться 2. Эта проблема становится существенной, когда либо пытается повторить физиологические условия, или при выполнении точных методов сбора данных. В качестве решения осложнений, упомянутых выше, стабильные протоколы трансфекции были разработаны, в котором ген, представляющий интерес может быть вставлена ​​в геном клетки под жестким контролем индуцируемого промотора, такого как система экспрессии репрессор тетрациклина, что обеспечивает единый копия плазмиды интегрирует в геном каждой клетки и выражается только после индукции механизма транскрипции, например, в присутствии доксициклина. В то время как это решает препятствия непоследовательных уровней экспрессии белка, этот метод теряет удобство быстрой и относительно простой протокол переходных трансфекциях. Создание стабильной клеточной линии занимает по меньшей мере несколько недель в whicч необходимо откалибровать кривую убийства набор специфическими антибиотиками, чтобы поддерживать экспрессию белка и обеспечивают интеграцию вектора и умело выбирать и выращивать клеточные колонии. В целом , это занимает значительно больше времени и усилий с более низкой вероятностью успеха 8. Здесь мы вводим промежуточный протокол, который опирается на сильные стороны обоих популярных вариантов трансфекции, чтобы обеспечить простой и эффективный способ контролировать уровни экспрессии в любой индуцируемого клеточной линии. Сохраняя клетки с индуцибельной системой ТЕТ мы скоротечно трансфекцию наш интерес ген, потенциальные катиона канала подсемейства V элемент 1 (TRPV1) Переходный рецепторной лигируют в вектор, который может гомологичной в сочетании с системой репрессора. Таким образом, ген может быть введен в клетки, не имеющие начала выражать. Только с добавлением доксициклин делает ген начинают выражать, что позволяет калибровать уровни белка выражession в соответствии с методикой, или уровней, наблюдаемое в физиологических условиях. Наш протокол также позволяет избежать длительных осложнений, связанных с формированием стабильно экспрессирующей клеточной линии. Мы начинаем показывать изменяющиеся уровни активации TRPV1 в визуализации кальция из ун-индуцированных через четыре часа индукции и, как повышение уровня внутриклеточного кальция коррелирует. Затем мы дублируем протокол в конфигурации всей ячейки техники патч зажима, показывающий увеличением тока с увеличением времени индукции. И, наконец, мы приводим примеры отдельных записей электрофизиологических канала, и показывают, что эта методика особенно полезна для контролируемого выражения при поиске точного сбора данных на основе отдельных единиц белка. С помощью нашего протокола, мы предлагаем удобный способ контролировать экспрессию белка в гетерологичных системах, избегая длительных осложнений культивирования клеток, обеспечивая тем самым способ контролировать условия между экспериментами и обеспечить моповторно воспроизводимые результаты.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="655">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pcDNA&#8482;4/TO Mammalian Expression Vector</td>
			<td style="width:153px;">ThermoScientific Fisher</td>
			<td style="width:119px;">V102020</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pcDNA&#8482;5/TO Mammalian Expression Vector</td>
			<td style="width:153px;">ThermoScientific Fisher</td>
			<td style="width:119px;">V103320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PureLink Quick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:153px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">K310001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Swift&#8482;&#160;MaxPro Thermal Cycler</td>
			<td style="width:153px;">Esco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">n.a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Restriction Enzymes</td>
			<td style="width:153px;">ThermoScientific Fisher</td>
			<td style="width:119px;">ER0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:153px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PureLink Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:153px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">K210012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NanoDrop 2000c</td>
			<td style="width:153px;">ThermoScientific Fisher</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:153px;">ThermoScientific Fisher</td>
			<td style="width:119px;">EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">One Shot&#174; TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td style="width:153px;">ThermoScientific Fisher</td>
			<td style="width:119px;">C404006&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ampicillin (Sodium), USP Grade</td>
			<td style="width:153px;">Gold Bio</td>
			<td style="width:119px;">A-301-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tryptone for microbiology</td>
			<td style="width:153px;">Merck</td>
			<td align="right" style="width:119px;">6.19305E+13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:153px;">BD worldwide</td>
			<td align="right" style="width:119px;">212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;SIF6000R Incubated Shaker</td>
			<td style="width:153px;">LAB COMPANION</td>
			<td style="width:119px;">45H118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:216px;"> 
			NucleoSpin&#174;plasmid</td>
			<td style="width:153px;">Macherey Nagel</td>
			<td align="right" style="width:119px;">740588.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MS 300V Power Supply</td>
			<td style="width:153px;">Major Science</td>
			<td style="width:119px;">MP-300V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Owl&#8482; EasyCast&#8482; B1A Mini Gel Electrophoresis System</td>
			<td style="width:153px;">ThermoScientific Fisher</td>
			<td style="width:119px;">B1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T-REx&#8482;-293 cell line</td>
			<td style="width:153px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">R710-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">DMEM (1X), liquid (high glucose)</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HindIII-HF&#174;</td>
			<td style="width:153px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R3104S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ApaI</td>
			<td style="width:153px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0114S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CutSmart&#174; Buffer</td>
			<td style="width:153px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">B7204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pcDNA&#8482;6/TR&#160; Mammalian Expression Vector</td>
			<td style="width:153px;">ThermoScientific Fisher</td>
			<td style="width:119px;">V102520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES Buffer Solution (1 M)</td>
			<td style="width:153px;">Biological Industries</td>
			<td style="width:119px;">03-025-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td style="width:153px;">Biological Industries</td>
			<td style="width:119px;">03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM)</td>
			<td style="width:153px;">Biological Industries</td>
			<td style="width:119px;">03-022-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Heracell&#8482; 150i CO2 Incubator</td>
			<td style="width:153px;">ThermoScientific Fisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">51026406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MSC-Advantage&#8482; Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td style="width:153px;">ThermoScientific Fisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">51025411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Blasticidine S hydrochloride</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">15205-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline Modified, without calcium chloride and magnesium chloride</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DOUBLE NEUBAUER RULED METALLIZED HEMACYTOMETER</td>
			<td style="width:153px;">Hausser Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TransIT&#174;-LT1 Transfection Reagent</td>
			<td style="width:153px;">Mirus</td>
			<td style="width:119px;">MIR 2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round</td>
			<td style="width:153px;">Knittel Glass</td>
			<td style="width:119px;">GG-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BioCoat&#8482; Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:153px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:119px;">354210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Water, Cell Culture Grade</td>
			<td style="width:153px;">Biological Industries</td>
			<td style="width:119px;">03-055-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Doxycycline hyclate</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9891-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fura-2, AM ester</td>
			<td style="width:153px;">Biotium</td>
			<td style="width:119px;">BTM-50034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pluronic&#174; F-127</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2443-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#181;-Slide 8 Well</td>
			<td style="width:153px;">ibidi</td>
			<td align="right" style="width:119px;">80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">(E)-Capsaicin</td>
			<td style="width:153px;">Tocris</td>
			<td align="right" style="width:119px;">462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Olympus IX70 Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:153px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">n.a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lambda DG-4 Wavelength Switcher</td>
			<td style="width:153px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">n.a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EXi Blue Fluorescence Microscopy Camera</td>
			<td style="width:153px;">QImaging</td>
			<td style="width:119px;">n.a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software</td>
			<td style="width:153px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">n.a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thin Walled Borosilicate Tubing</td>
			<td style="width:153px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">B150-110-7.5HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Standard Walled Borosilicate Tubing</td>
			<td style="width:153px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">B150-86-7.5HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dimethyl sulfoxide anhydrous</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">P1000 micropipette puller</td>
			<td style="width:153px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MF-900 Microforge</td>
			<td style="width:153px;">NARISHIGE</td>
			<td style="width:119px;">n.a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ValveBank perfusion sysytem</td>
			<td style="width:153px;">AutoMate Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Digidata&#174; 1440A Low-noise Data Acquisition System</td>
			<td style="width:153px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">n.a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Axopatch 200B Amplifier</td>
			<td style="width:153px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">n.a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pCLAMP 10.6 Software</td>
			<td style="width:153px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">n.a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">micromanipulator</td>
			<td style="width:153px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">MP-225</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controllable ion channel expression through inducible transient transfection

Трансфекция, поставка зарубежных нуклеиновых кислот в клетку, является мощным инструментом в исследованиях белка. С помощью этого метода, ионные каналы могут быть исследованы через электрофизиологического анализа, биохимических характеристик, мутационных исследований, а также их влияние на клеточные процессы. Переходные трансфекцию предлагают простой протокол, в котором белок становится доступным для анализа в течение нескольких часов до нескольких дней. Хотя этот метод представляет относительно простой и эффективный протокол времени, одним из важнейших компонентов калибровки экспрессии представляющего интерес гена в физиологических соответствующих уровней или уровней, которые пригодны для анализа. С этой целью, множество различных подходов, которые предлагают возможность контролировать экспрессию представляющего интерес гена появились. Несколько устойчивых протоколов трансфекции клеток обеспечивают способ постоянно введения гена интереса в клеточный геном под регуляции тетрациклином контролируемой transcripной активации. Хотя этот метод производит надежные уровни экспрессии, каждый ген интерес требует нескольких недель квалифицированной работы, включая калибровку кривой убийства, выбор клеточных колоний, и в целом больше ресурсов. Здесь мы приводим протокол, который использует переходную трансфекцию потенциал катиона канала члена подсемейства V 1 (TRPV1) гена рецептора Переходный в индуцируемого системе как эффективный способ для экспрессии белка контролируемым способом, который имеет важное значение при анализе ионных каналов. Показано, что с помощью этой техники, мы способны выполнить визуализацию кальция, целых клеток, а также анализ одного канала с помощью контролируемых уровней каналов, необходимых для каждого типа сбора данных с одной трансфекции. В целом, это обеспечивает воспроизводимый метод, который может быть использован для изучения структуры и функции ионных каналов.

Для того, чтобы быстро создать индуцируемый модель экспрессии, мы использовали клетки НЕК293 , которые выражают Тетрациклин белок - репрессор (TR) (например, T-REX-293) и векторы, содержащие последовательности оператора тетрациклина (Teto) между промотором CMV и сайт множест...

Watch this Scientific Journal Video about Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection at JoVE.com

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Изучение ионных каналов через гетерологично, выражающей системы стало основной техникой в ​​области биомедицинских исследований. В этой рукописи, мы представляем эффективный метод времени для достижения экспрессии канала жестко контролируемой ионной путем выполнения временной трансфекции под контролем индуцируемого промотора.

Управляемая Expression ионного канала через Индуцибельные временная трансфекция

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

миРНК Трансфекция и EMSA Анализы на свежеизолированных ворсинок Cytotrophoblasts человека

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

Терруар Концепция толкуется через виноградной ягоды метаболомики и транскриптомика

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Индуцируемая T7-РНК-полимераза-опосредованная мультигенная экспрессия, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Изучение экспрессии генов, регулируемых клеточным циклом, двумя протоколами синхронизации комплементарных ячеек

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Микроинъекции ТРИФОСФАТЫ/Cas9 белка в канал сома, сомик punctatus, эмбрионы для редактирования гена

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Учредительные и индуцибельной систем для генетических в естественных условиях изменения мыши гепатоцитов, используя инъекции Вену гидродинамических хвост

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

Переходных выражение иностранных генов в клетках насекомых (sf9) для функциональных Assay протеина

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Изучения корня микрофлора: извлечение данных бактериальных сообщества из почвы, ризосфере и корень Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Ткани конкретных Мирна выражение профилирования в мыши сердца с помощью секции гибридизации In Situ

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

Ингибирование белков индуцибельной и обратимым Доминант отрицательной (DN)

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...