Name: streamlined single cell tcr isolation and generation of retroviral vectors for in vitro and in vivo expression of human tcrs
Uploaded: 2017-09-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs at JoVE.com

Undersøgelsen blev finansieret af JDRF 1-FAC-2014-243-A-N, ADA 7-14-JF-07, NIH 5 P30 DK079638-05 PILOT PJ, og The Robert og Janice McNair Foundation.
Vi takker Sandra Pena og Andrene McDonald for patient rekruttering, Samuel Blum for teknisk bistand, Dr. George Makedonas til gave af antistoffer og kontrol DNA anvendes til PCR optimering.

1. identificere T-celle population af interesse.
 Bemærk: Antigen specifikke spredning i kombination med celledeling farvestof (ligesom Carboxyfluorescein succinimidyl ester, CFSE) kan bruges til at isolere T celler baseret på deres spredning i svar til antigene stimulation. Hvis start fra PBMC, en 7-dages in vitro- udvidelse bør være tilstrækkelige til at identificere en antigen specifikke CFSE lav befolkningen 12.
<ol><li>Mix PBMC 1:1 med MHC-matched...

<ol>
	<li>Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+development+and+the+CD4-CD8+lineage+decision.">T-cell development and the CD4-CD8 lineage decision.</a> Nat Rev Immunol. 2 (5), 309-322 (2002).</li><li>Singer, A., Adoro, S., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+fate+and+intense+debate:+myths,+models+and+mechanisms+of+CD4-+versus+CD8-lineage+choice.">Lineage fate and intense debate: myths, models and mechanisms of CD4- versus CD8-lineage choice.</a> Nat Rev Immunol. 8 (10), 788-801 (2008).</li><li>Tubo, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+naive+CD4++T+cells+from+a+diverse+repertoire+produce+different+effector+cell+types+during+infection.">Single naive CD4+ T cells from a diverse repertoire produce different effector cell types during infection.</a> Cell. 153 (4), 785-796 (2013).</li><li>Sprouse, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+and+expression+of+human+TCRs+in+retrogenic+mice.">Rapid identification and expression of human TCRs in retrogenic mice.</a> J Immunol Methods. , (2016).</li><li>Lennon, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+islet+accumulation+in+type+1+diabetes+is+a+tightly+regulated,+cell-autonomous+event.">T cell islet accumulation in type 1 diabetes is a tightly regulated, cell-autonomous event.</a> Immunity. 31 (4), 643-653 (2009).</li><li>Dash, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired+analysis+of+TCRalpha+and+TCRbeta+chains+at+the+single-cell+level+in+mice.">Paired analysis of TCRalpha and TCRbeta chains at the single-cell level in mice.</a> J Clin Invest. 121 (1), 288-295 (2011).</li><li>Kobayashi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+cloning+and+expression+system+yields+and+validates+TCRs+from+blood+lymphocytes+of+patients+with+cancer+within+10+days.">A new cloning and expression system yields and validates TCRs from blood lymphocytes of patients with cancer within 10 days.</a> Nat Med. 19 (11), 1542-1546 (2013).</li><li>Szymczak, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+multi-gene+deficiency+in+vivo+using+a+single+'self-cleaving'+2A+peptide-based+retroviral+vector.">Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector.</a> Nat Biotechnol. 22 (5), 589-594 (2004).</li><li>Szymczak, A. L., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+2A+peptide-based+strategies+in+the+design+of+multicistronic+vectors.">Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors.</a> Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).</li><li>Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+receptor+retrogenic+mice:+a+rapid,+flexible+alternative+to+T-cell+receptor+transgenic+mice.">T-cell receptor retrogenic mice: a rapid, flexible alternative to T-cell receptor transgenic mice.</a> Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).</li><li>Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+T-cell+selection+in+vivo+using+T+cell-receptor+retrogenic+mice.">Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice.</a> Nat Methods. 3 (3), 191-197 (2006).</li><li>Mannering, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells.">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> J Immunol Methods. 283 (1-2), 173-183 (2003).</li><li>James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+antigen+specific+CD4++T+cells+using+MHC+class+II+tetramers.">Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Corthay, A., Nandakumar, K. S., Holmdahl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+percentage+of+peripheral+T+cells+with+two+different+T+cell+receptor+alpha-chains+and+of+their+potential+role+in+autoimmunity.">Evaluation of the percentage of peripheral T cells with two different T cell receptor alpha-chains and of their potential role in autoimmunity.</a> J Autoimmun. 16 (4), 423-429 (2001).</li><li>Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+Transduction+of+Bone+Marrow+Progenitor+Cells+to+Generate+T-cell+Receptor+Retrogenic+Mice.">Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice.</a> J Vis Exp. (113), (2016).</li><li>Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+T+cell+receptor-retrogenic+mice:+improved+retroviral-mediated+stem+cell+gene+transfer.">Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer.</a> Nat Protoc. 8 (10), 1837-1840 (2013).</li><li>Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antitumor+activity+of+murine-human+hybrid+T-cell+receptor+(TCR)+in+human+lymphocytes+is+associated+with+improved+pairing+and+TCR/CD3+stability.">Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability.</a> Cancer Res. 66 (17), 8878-8886 (2006).</li></ol>

I den nuværende protokol beskriver vi en effektiv metode til enkelt celle TCR forstærkning og efterfølgende sub kloning af parret TCR alfa og beta kæder i en skabelon retroviral udtryk vektor. Selv om flere enkelt celle PCR-protokoller er blevet udviklet, har ingen hidtil været forenelig med øjeblikkelig sub kloning til et udtryk vektor. I de fleste tilfælde forstærkes delsekvens omfatter de meget varierende CDR3 regioner med nok sekvens til at ekstrapolere den variable region. Denne mindre PCR produktstørrelse ...

T-celle receptoren (TCR) dikterer T-celle skæbne beslutning under udvikling, steady state/homøostase og antigene stimulation i periferien1,2,3. Seneste udvidelse af dyb sekventering teknologier har afdækket en tidligere underappreciated TCR mangfoldighed inden for antigen specifikke T-celle svar. TCR mangfoldighed antyder et potentiale for funktionelt bred T-celle svar. For at integrere TCR Sekvensanalyse repertoire med TCR funktionelle assays, bør sekventering strategier være udformet til at være kompatibel med eksperimentelle systemer og i vivo modeller udnyttede efterfølgende funktionel analyse af Vælg TCRs. Vi har udviklet en effektiv tilgang til menneskelige TCR sekvens isolation og strømlinet sub kloning til en kimære menneskelige/mus TCR skabelon vektor kompatibel med TCR udtryk i HLA-humaniseret mus4. Isolering af tilsvarende alpha og beta kæder af heterodimerisk TCRs kræver PCR-amplifikation af begge kæder fra en enkelt celle. Selv om flere encellede TCR kloning protokoller er blevet udviklet og udnyttet, har ingen hidtil været let forenelig med høj overførselshastighed strømlinet direkte kloning af ukendt Vα/Vβ TCRs i retroviral vektorer nødvendige for fornyet udtryk in vivo 4,5,6,7. Tidligere undersøgelser har udnyttet to vigtigste tilgange, enten til selektivt forstærke en begrænset del af TCR tilstrækkeligt at ekstrapolere sekvensen, eller til at forstærke den hele TCR sekvens4,5,6 , 7. downstream funktionel analyse af TCR sekvenser opnået via den første tilgang kræver dyre i siliciummangan forsamling og de novo konstruktion af TCR. Mens den anden tilgang giver den komplette TCR sekvens, er den menneskelige konstant region ikke kompatibel med i vivo udtryk af de klonede TCRs i musemodeller. Vores tilgang er specielt designet til at være kompatibel med i vivo funktionel analyse af TCRs i musemodeller. Vi udviklet en effektiv og strømlinet enkelt celle PCR-protokol, der giver mulighed for direkte sub kloning af PCR fragmenter i skabelonen udtryk vektor.
Vores tilgang udnytter en meget følsomme multiplex-indlejret PCR reaktion, der er udført i to trin. I den første multiplex reaktion trin en pulje af 40 primere specifikke for alle V-beta kæder og en pulje af 44 primere specifikke for alle V-alpha kæder er brugt til at forstærke TCR-alpha eller TCR-beta uden forudgående kendskab til sekvensen (tabel 1). Den forreste primer har en adapter sekvens, som er indarbejdet i 5' af PCR-produktet. Den omvendte primer er baseret på konstant regionen af TCR. Vi har identificeret entydig begrænsning websteder, der er fraværende fra menneskelige variabel eller krydset TCR regioner, og indarbejdet disse i nydesignede TCRα og TCRβ primere (figur 1). I den anden indlejrede reaktion bruges en specifik for adapter sekvens primer og en indlejret omvendt primer inden for regionen konstant til at yderligere forstærke TCR kæder med øget specificitet (tabel 1, figur 1). Efter enkelt celle isolation, to runder af PCR (første reaktion med en pulje af både Vα og Vβ primere, og for det andet med adapter primere) resultere i et PCR-produkt, der kan være direkte sub klonet i skabelonen retroviral vektor. Den endelige TCR konstruktion vil indkode, i en enkelt åben behandling ramme (ORF), menneskelige variable regioner kombineret med mouse konstant regioner forbundet med den 'selvstændig cleaving' protein sekvens, P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8. P2A sekvens er blevet brugt i flere systemer, og er blevet grundigt testet specielt til udtryk i TCRs8,9,10,11. Selv efter oversættelse de fleste af P2A sekvens forbliver knyttet til C-terminus af alfa kæden forbundet med en fleksibel linker, mens beta kæde signal sekvensen har en ekstra prolin, denne ændring har nogen skadelig indvirkning på TCR funktion. Regionen mus konstant bruges i konstruktionen i stedet for menneskelige for at undgå potentielle ændrede interaktioner med downstream signaling komponenter når re udtrykt i mus celler. Den eneste ORF vil resultere i støkiometriske separat udtryk for alpha og beta kæder9,11. Den nuværende protokol er baseret på reagenser og tilgange, der er bredt tilgængelige, og er designet til at være udført på en strømlinet og effektiv måde. Selv om vi har specielt brugt denne teknik til analysen TCRs fra self-reactive T celler impliceret i autoimmune diabetes, forventer vi, at denne protokol kan være almindeligt gældende for identifikation og funktionel vurdering af menneskelige TCRs bestemt for autoimmun epitoper, kræft epitoper eller svar til patogener og vacciner.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="815">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">CFSE&#160;</td>
			<td style="width:148px;">eBioscience&#160;</td>
			<td style="width:116px;">65-0850-84</td>
			<td style="width:223px;">5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-human CD4 (OKT4) BV421</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>317433</td>
			<td>2 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-human CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>317336</td>
			<td>2 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse CD3 AF647</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>100322</td>
			<td>2.5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant RNAse inhibitor biotech grd 2.5KU&#160;&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-158</td>
			<td>0.7 U</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Applied Biosystems High capaity cDNA RT kit&#160;</td>
			<td>Invirtogen&#160;</td>
			<td>4368814</td>
			<td>9 U (RT enzyme)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NF-H2O: Nuclease-free water 1000mL</td>
			<td>Invirtogen&#160;</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gotaq DNA polymerase 2500U</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PAM3008</td>
			<td>1 U</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 Well Half Skirt PCR Plate</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>MPX-96M2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroAmp Clear Adhesive Film&#160;</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>4306311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Agarose&#160;</td>
			<td>Invirtogen&#160;</td>
			<td>15510-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SnaBI</td>
			<td>New England Biolabs&#160;</td>
			<td>R0130</td>
			<td>15 U (insert) 30 U (vector)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SacII</td>
			<td>New England Biolabs&#160;</td>
			<td>R0157</td>
			<td>40 U (insert) 80 U (vector)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MfeI</td>
			<td>New England Biolabs&#160;</td>
			<td>R3589S</td>
			<td>40 U (insert) 80 U (vector)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BstBI</td>
			<td>New England Biolabs&#160;</td>
			<td>R0519</td>
			<td>40 U (insert) 80 U (vector)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calf Intestinal Phosphatase (CIP)</td>
			<td>New England Biolabs&#160;</td>
			<td>M0290S</td>
			<td>10 U</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quick ligase&#160;</td>
			<td>New England Biolabs&#160;</td>
			<td>M2200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Plus minipreps DNA purification systems&#160;</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>A1460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Plus midipreps DNA purification systems&#160;</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>A7640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA clean &#38; concentrator-25 kit</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>11-304C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ZR-96 DNA clean &#38; concentrator-5 kit</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>11-306A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick gel extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells&#160;</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>18265017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transit LT-1 Reagent 1mL (transfection reagent)</td>
			<td>Mirus&#160;</td>
			<td>MIR2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD FACS Aria II (sorter)</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Fortessa (flow cytometer)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

streamlined single cell tcr isolation and generation of retroviral vectors for in vitro and in vivo expression of human tcrs

Selv om flere metoder til sekvensering af parret T-celle receptoren (TCR) alpha og beta kæder fra enkelt T celler er blevet udviklet, har ingen hidtil været befordrende for downstream i vivo funktionel analyse af TCR heterodimers. Vi har udviklet en forbedret protokol baseret på en to-trins multiplex-indlejret PCR, hvilket resulterer i et PCR-produkt, der strækker sig over hele variable regioner af en menneskelig TCR alfa og beta kæder. Ved at identificere entydig begrænsning websteder og indarbejde dem i PCR-primere, har vi gjort PCR produkt kompatibelt med direkte sub kloning til skabelon retroviral vektor. Den resulterende retroviral konstruere koder en kimære menneskelige/mus TCR med en mus intracellulære domæne, som er funktionelle i mus celler eller i vivo musemodeller. Samlet set kombinerer protokollen beskrevet her menneskelige enkelt celle parret TCR alfa og beta kæde identifikation med strømlinede generation af retroviral vektorer let kan tilpasses til in vitro- og i vivo TCR udtryk. Videoen og den ledsagende materiale er designet til at give en meget detaljeret beskrivelse af den enkelte celle PCR, således at de kritiske trin kan være fulgt og potentielle faldgruber undgås. Derudover giver vi en detaljeret beskrivelse af de nødvendige til at generere udtryk vektor kloning skridt. Når styr, kunne hele proceduren fra enkelt celle sortering til TCR udtryk udføres i en kort periode på to uger.

Effektiviteten af multiplex-indlejret PCR reaktionen er markeret i trin 3.2.7 (figur 2) ved at køre ud 5 µl af den anden reaktion på en agarosegel. I gennemsnit effektiviteten af TCR-beta forstærkning forventes at blive på omkring 80%, mens effektiviteten af TCR-alpha reaktion er normalt lavere, ca 50%4. Kun parrede TCR-alpha og TCR-beta kæder kan bruges til TCR udtryk; men alle PCR produkter kunne blive sekventeret for at opnå ...

Watch this Scientific Journal Video about Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs at JoVE.com

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

De nuværende protokol kombinerer enkelt celle parret menneskelige TCR alfa og beta kæde sekventering med strømlinet generation af retroviral vektorer kompatibel med in vitro- og i vivo TCR udtryk.

Strømlinet enkelt celle TCR Isolation og Generation af Retroviral vektorer for In Vitro og In Vivo udtryk for menneskelige TCRs

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Ændring af primære humane T-celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymfocyt Isolering fra menneskehud for Fænotypisk Analyse og<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering og analyse for at fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhed til terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

En simpel og effektiv tilgang til Construct Mutant vacciniavirus Vektorer

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flowcytometrisk analyse of Natural Killer Cell lytisk aktivitet i humant fuldblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Kvantificering af humane monocyt Chemotaxis In Vitro og Murine lymfocyt handel In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolering af Salmonella typhimurium-indeholdende Phagosomes fra makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation og In Vitro kultur af Murine og menneskelige alveolær makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...