Name: detection and enrichment of rare antigen-specific b cells for analysis of phenotype and function
Uploaded: 2017-02-16T15:00:00
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This work was supported by grants from the JDRF (1-2008-994, 27-2012-450) and the National Institutes of Health (R01DK096492-05, R21AI124488-01, T32OD012201, and F30OD021477).

1. मानव PBMCs का अलगाव <ol><li> heparinized रक्त संग्रह ट्यूब का उपयोग रक्त के 30-50 मिलीलीटर लीजिए। नोट: इस्तेमाल किया रक्त की मात्रा विशेष रूप से प्रयोगात्मक सवाल और ब्याज की विशिष्ट प्रतिजन बी कोशिकाओं के रक्त में आ?...

<ol>
	<li>de Wildt, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+analysis+and+production+of+monoclonal+antibody+fragments+originating+from+single+human+B+cells.">A new method for the analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B cells.</a> J Immunol Methods. 207 (1), 61-67 (1997).</li><li>Edelman, G. M., Rutishauser, U., Millette, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fractionation+and+arrangement+on+fibers,+beads,+and+surfaces.">Cell fractionation and arrangement on fibers, beads, and surfaces.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 68 (9), 2153-2157 (1971).</li><li>Haas, W., Schrader, J. 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J., Slifka, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+rare+memory+B+cell+populations+by+two+independent+and+complementary+approaches.">Quantitation of rare memory B cell populations by two independent and complementary approaches.</a> Journal of immunological methods. 317 (1-2), 175-185 (2006).</li><li>Scheid, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+identification+of+HIV+gp140+binding+memory+B+cells+in+human+blood.">A method for identification of HIV gp140 binding memory B cells in human blood.</a> Journal of immunological methods. 343 (2), 65-67 (2009).</li><li>Doucett, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+and+characterization+of+virus-specific+B+cells+by+multicolor+flow+cytometry.">Enumeration and characterization of virus-specific B cells by multicolor flow cytometry.</a> Journal of immunological methods. 303 (1-2), 40-52 (2005).</li><li>Malkiel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Checkpoints+for+Autoreactive+B+Cells+in+Peripheral+Blood+of+Lupus+Patients+Assessed+By+Flow+Cytometry.">Checkpoints for Autoreactive B Cells in Peripheral Blood of Lupus Patients Assessed By Flow Cytometry.</a> Arthritis Rheumatol. , (2016).</li><li>Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+B+cell+populations+mediate+early+and+late+memory+during+an+endogenous+immune+response.">Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response.</a> Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).</li><li>Abts, H., Emmerich, M., Miltenyi, S., Radbruch, A., Tesch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD20+positive+human+B+lymphocytes+separated+with+the+magnetic+cell+sorter+(MACS)+can+be+induced+to+proliferation+and+antibody+secretion+in+vitro.">CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic cell sorter (MACS) can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro.</a> Journal of immunological methods. 125 (1-2), 19-28 (1989).</li></ol>

यहाँ हम अलगाव और मानव परिधीय रक्त से प्रतिजन बाध्यकारी बी कोशिकाओं के संवर्धन को पूरा करने के लिए एक उपन्यास विधि का वर्णन है। विधि चूहों के लिए और इस तरह के प्लीहा और लिम्फ नोड्स के रूप में अन्य ऊतकों, ?...

सीमित कमजोर पड़ने एंटीबॉडी स्रावित सेल अग्रदूत आवृत्ति का विश्लेषण करती सुझाव दिया है कि बी एक विशेष प्रतिजन के लिए प्रतिक्रियाशील कोशिकाओं को आमतौर पर सामान्य श्रेणी में प्रदर्शनों की सूची में 0.05 0.005% की एक आवृत्ति पर होते टीकाकरण की स्थिति और प्रतिजन पर उपस्थित epitopes के आकार / संख्या पर निर्भर करता है। इन कोशिकाओं के कम आवृत्ति यह मुश्किल ऐसे निम्नलिखित टीकाकरण या जोखिम एक विदेशी प्रतिजन के लिए, या autoimmunity के विकास के दौरान के रूप में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, के विकास के दौरान उनकी स्थिति में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए बनाया गया है। सक्रिय प्रतिदीप्ति सेल 1, 2, 3, 4, 5, 6 छँटाई इससे पहले, शोधकर्ताओं प्रतिजन प्रतिक्रियाशील बी प्रतिजन लेपित प्लेट या स्तंभ Adsorbents, प्रतिजन लेपित लाल रक्त कोशिका रीसेट करने से लेकर तकनीक का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं के अलगाव किए गए हैं। thougज इन तकनीकों की पहचान करने और प्रतिजन प्रतिक्रियाशील बी कोशिकाओं को अलग-थलग करने में सफल रहे हैं, परिणाम निकलेगा, पवित्रता और scalability के मामले में अलग है। हाल ही में हम दोनों का पता लगाने और चुंबकीय नैनोकणों का उपयोग दुर्लभ बी लिम्फोसाइट उप-जनसंख्या संतुष्ट करने के लिए एक उपन्यास विधि विकसित की है। विधि अपेक्षाकृत उच्च उपज और बड़े शुरुआती आबादी से पवित्रता के साथ संवर्धन के लिए सक्षम बनाता है, और प्रतिजन के लिए प्रतिक्रियाओं के विश्लेषण के साथ संगत है। निलंबन में कोशिकाओं की आबादी से समृद्ध बनाने के द्वारा, विधि बाधाओं कि प्रतिजन में लिपटे प्लेटों या स्तंभों, और सीमा throughput की ज्यामिति के साथ जुड़े रहे समाप्त। अंत में, के बाद से समृद्ध कोशिकाओं प्रतिजन और एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के साथ जुड़े रहते हैं, वे आगे FACS छँटाई द्वारा शुद्ध किया जा सकता है। के रूप में वर्णित हम परिधीय रक्त टिटनेस toxoid प्रतिक्रियाशील बी से पहले कोशिकाओं के अध्ययन और मानव विषयों के निम्नलिखित टीकाकरण के लिए इस दृष्टिकोण, साथ ही विभिन्न autoi के साथ विषयों से स्वप्रतिजन प्रतिक्रियाशील बी कोशिकाओं का इस्तेमाल किया हैmmune विकारों, सहित टाइप 1 मधुमेह, &#39;कब्र रोग, और Hashimoto रोग 7। विधि माउस और मानव में समान रूप से अच्छी तरह से काम करता है, और ऊतकों की एक किस्म (तैयारी में पांडुलिपि) से प्रतिजन प्रतिक्रियाशील बी कोशिकाओं के विश्लेषण के साथ संगत है। अपने मूल स्वरूप में, परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear पहली सतह प्ररूपी विश्लेषण के लिए आवश्यक एंटीजन सेल एंटीबॉडी के साथ-साथ biotinylated प्रतिजन के साथ incubated हैं। यह लेबलिंग कदम धोने और निर्धारण, और (चित्रा 1) biotinylated प्रतिजन बाध्यकारी कोशिकाओं का पता लगाने के लिए दूर-लाल-फ्लोरोसेंट डाई करने के लिए मिलकर streptavidin के अलावा द्वारा पीछा किया जाता है। पिछले अध्ययनों से एक समान तरीके से विशिष्ट प्रतिजन बी कोशिकाओं की पहचान की है लेकिन एंटीजन का उपयोग कर सीधे एक fluorochrome 8, 9, 10, 11 संयुग्मित। हालांकि यह एक योग्य हैदृष्टिकोण, streptavidin के साथ संयोजन के रूप में biotinylated एंटीजन का उपयोग अधिक से अधिक संकेत प्रवर्धन (बाध्यकारी और गैर-बाध्यकारी कोशिकाओं की इसलिए बेहतर भेदभाव) के लिए सक्षम बनाता है, खासकर जब एंटीजन छोटे 12, 13, 14 हैं। एक अतिरिक्त विचार के बजाय streptavidin avidin क्योंकि streptavidin deglycosylated है, गैर विशिष्ट बंधन को कम करने के लिए इस्तेमाल होता है। इसके अलावा, हम अपने photostability, क्वांटम उपज (चमक), और अपने छोटे आकार (~ 1.3 केडी) की वजह से fluorochrome के रूप में दूर-लाल-फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग करें। क्योंकि वे संभावित कई प्रतिजनी epitopes शामिल ऐसे phycoerythrin के रूप में प्रोटीन fluorochromes (~ 250 केडी) और allophycocyanin (~ 105 केडी) 15 इष्टतम नहीं कर रहे हैं। ऐसे में दूर-लाल-फ्लोरोसेंट रंजक के रूप में, एक एकल मिलान से बना एक छोटा सा कार्बनिक फ्लोरोसेंट डाई का प्रयोग करें, पृथक सेल की आबादी की जटिलता कम कर देता है। एक बार जब कोशिकाओं रहे हैं biotinylated-एकntigen और दूर लाल फ्लोरोसेंट डाई streptavidin adsorbed, वे विरोधी दूर लाल फ्लोरोसेंट डाई संयुग्मित चुंबकीय नैनोकणों का उपयोग कर समृद्ध कर रहे हैं। एकल नैनोकणों सबसे प्रवाह cytometers से नहीं पाया जाता है और इसलिए छँटाई FACS और नीचे की ओर assays 16 से शुद्धि करने से पहले हटाया जा जरूरत नहीं है। विशिष्ट प्रतिजन बी कोशिकाओं के लिए चुंबकीय चयन ब्याज की आबादी को समृद्ध करती है, समय और एक प्रवाह कोशिकामापी का उपयोग कर दुर्लभ घटनाओं छँटाई की लागत को नष्ट करने। नीचे हम एक विषय से पहले और सात दिन टिटनेस toxoid बूस्टर टीकाकरण के बाद से टिटनेस-toxoid-विशिष्ट बी कोशिकाओं के संवर्धन से प्रतिनिधि के परिणाम बताते हैं। हम आदेश विशिष्ट प्रतिजन बी विवो उत्तेजना में तीव्र निम्नलिखित कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए इस विधि की क्षमता को प्रदर्शित करने के लिए एक उदाहरण के रूप में यह विशेष रूप से आवेदन चुना है। जब से फ्लो के साथ मिलकर, इस विधि समृद्ध और फर्क विशिष्ट प्रतिजन भोले, स्मृति में सक्षम है, औरplasmablast बी कोशिकाओं और शोधकर्ता समय के साथ उनकी आवृत्ति में परिवर्तन का पालन करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, हम एक और संभव नीचे की ओर परख, उदाहरण के लिए एक ELISPOT परख है, जो यह दर्शाता है कि कोशिकाओं संवर्धन निम्नलिखित एंटीबॉडी स्रावित करने की क्षमता को बनाए रखने में शामिल हैं। इस पद्धति का एक अन्य आवेदन में एक मेजबान के समृद्ध कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण शामिल कर सकता है। हम पहले से पता चला है कोशिकाओं प्रतिजन अलगाव और स्थानांतरण के बाद प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं के लिए कोशिकाओं पेश के रूप में कार्य करने की क्षमता को बनाए रखने के (डेटा) नहीं दिखाया। इसलिए, वहाँ संभव बहाव assays कि विधि है, जो एक साथ विशिष्ट प्रतिजन प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की समझ को सूचित करने के लिए मिलकर किया जा सकता है की एक संख्या हैं। हम नीचे वर्णित विधि है, कुल उपज, पवित्रता, सेल विशिष्टता का निर्धारण, और गुना-संवर्धन के लिए नियंत्रण भी शामिल है।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="594">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="99">
			<td height="99" style="height:99px;width:164px;">Antigen of interest</td>
			<td style="width:104px;">variable</td>
			<td style="width:131px;">variable</td>
			<td style="width:196px;">At least 100 &#956;g to biotinylate easily; if using protein try to use protein that has been validated by ELISA. It must be carrier&#160; protein free.</td>
		</tr>
		<tr height="118">
			<td height="118" style="height:118px;width:164px;">Biotin for labeling; e.g. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td style="width:104px;">e.g. Thermo Scientific</td>
			<td style="width:131px;">e.g. 21335</td>
			<td style="width:196px;">Biotin is available in different formulations, such as those containing&#160; various length spacers, so the type used should be determined by the researcher</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Streptavidin-Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:104px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">S21374</td>
			<td style="width:196px;">Can obtain from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:164px;">Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microbeads</td>
			<td style="width:104px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:131px;">130-091-395</td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:164px;">LS Columns</td>
			<td style="width:104px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:131px;">130-042-401</td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:164px;">MACS manual separators</td>
			<td style="width:104px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:131px;">variable</td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:164px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:196px;">Dilute to 2% with PBS; optional if downstream assay requires live cells</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:164px;">PBS without calcium and magnesium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:164px;">Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td style="width:104px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:131px;">17-1440-02</td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="59" style="height:59px;width:164px;">Whole blood in heparinized collection tubes</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:164px;">FACS buffer (PBS + 1% BSA + 0.01% sodium azide)</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:164px;">Separation buffer (PBS + 0.5% BSA + 2mM EDTA)</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:164px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:164px;">15 mL conical tubes</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:164px;">1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="96">
			<td height="96" style="height:96px;width:164px;">Surface marker&#160; reactive antibodies, Fc Block, live/dead discriminating stain, if needed</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:164px;">ELISPOT supplies, if needed</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and enrichment of rare antigen-specific b cells for analysis of phenotype and function

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.

पवित्रता, उपज का विश्लेषण, और गुना संवर्धन से फ्लो का उपयोग कर के रूप में वर्णित उपरोक्त अनिवार्य रूप से दूषित कोशिकाओं है कि streptavidin- दूर लाल फ्लोरोसेंट डाई के लिए बाध्य...

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Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

एक साधारण अभी तक प्रभावी तरीका है कि पता लगाने और कार्यात्मक और प्ररूपी विश्लेषण के लिए प्रतिजन प्रतिक्रियाशील बी कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए चुंबकीय नैनोकणों को रोजगार में वर्णित है।

का पता लगाने और दुर्लभ के संवर्धन विशिष्ट प्रतिजन phenotype और समारोह के विश्लेषण के लिए बी कोशिकाओं

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

The overall goal of this simple yet effective procedure is to isolate and enrich for rare antigen-binding B cells from human peripheral blood using magnetic nanoparticles for their phenotypic and functional analysis. This method can help answer key questions in the field of immunology regarding the phenotype and biology of rare antigen-binding B cells both before and following in-vivo antigen encounter. The major advantage of this technique is that it obviates problems associated with geometry, particularly when one is using a styrene plate or a large bead.And it obviates problems associated with flow rate when one is isolating cells by flow cytometry to isolate rare cells in quite large starting cell populations. Immediately after collecting 30 to 50 milliliters of whole blood into heparinized blood collection tubes, mix the blood at a 1:1 ratio with sterile room-temperature magnesium and calcium-free PBS. Next, layer the blood mixture onto 10 milliliters of room-temperature density gradient solution in a sterile 50 milliliter conical tube using slow consistent pipette trigger pressure.Separate the cells by centrifugation. Discard the plasma and platelet-containing upper layer and use a sterile pipette to transfer the mononuclear cell container buffy coat into a new sterile 50 milliliter tube. Fill the tube with up to 50 milliliters of PBS for washing of the mononuclear cells by centrifugation.Then, resuspend the pellet in 10 milliliters of fresh PBS for counting and resuspend the cells at a 1x10^7 cells per milliliter concentration in fresh PBS on ice. To stain the cells for magnetic bead-binding, first transfer 1-2x10^6 cell aliquots into five milliliter polystyrene tubes for each fluorescence compensation and Fluorescence Minus One control as appropriate. Next, collect the remainder of the cell sample by centrifugation and resuspend the pellet to a 3-6x10^7 cells per milliliter concentration in sterile filtered cold FACS buffer.Split the cell solution equally into four FACS tubes on ice and add human Fcgamma receptor blocking reagant to these four experimental sample fractions. At the end of the nonspecific-binding blocking incubation, add the appropriate fluorescence conjugated cell-surface staining antibodies to the cells in all four sample fractions. Then, add the appropriate biotinylated antigen to fractions A and D followed by the addition of a sufficient volume of unlabeled antigen to fraction B such that the majority of the receptors with an affinity of at least 1x10^6 molar are blocked.Incubate all of the samples for 30 minutes on ice followed by a 30 minute incubation of fraction B with the appropriate biotinylated antigen. At the end of the incubations, wash the cells two times in one milliliter of ice cold FACS buffer per 5x10^7 cells. And resuspend the pellets in one milliliter of 2%formaldehyde per 5x10^7 cells for five minutes in the dark on ice.After fixation, wash cells two more times as just demonstrated. And resuspend the pellets in one milliliter of fresh ice cold FACS buffer per 5x10^7 cells. Then label the cells with one to two micrograms of the appropriate secondary Streptavidin Conjugated Antibody for 20 minutes in the dark on ice and wash the cells two more times.For magnetic nanoparticle-based enrichment, resuspend the A, B, and C cell fractions in one milliliter of cold Separation Buffer per 5x10^7 cells and filter the cells through individual 40 microliter strainers to eliminate any clumps. Next, add the fluorescent dye nanoparticles at the appropriate concentration for 10 minutes in the dark at four degrees Celsius with rotation and wash the samples two times in one milliliter of cold Separation Buffer. Resuspend the pellets in one milliliter of cold Separation Buffer per 5x10^7 cells.Then equilibrate three magnetic columns on their appropriately-sized magnets with three milliliters of Separation Buffer each, allowing the entire volume of Separation Buffer to run through each column into a waste container. Now place one labeled 15 milliliter conical tube under each column and add the magnetic particle labeled cells to their respective columns. When the entire volume of each cell fraction has passed through each column, add three milliliters of fresh ice cold Separation Buffer to the top of each column, collecting the effluents in the labeled tubes.After the second wash has completely drained through the columns, place the tubes of negatively selected cells from each fraction on ice and transfer the columns into new 15 milliliter tubes for each fraction. Fill each column with approximately six milliliters of fresh Separation Buffer and immediately plunge the buffer through the columns to collect the magnetically-bound cells. Then collect both the positive and negative cell fractions by centrifugation and resuspend the pellets in the appropriate solution for the planned downstream analysis.In these graphs, the frequency of tetanus-toxoid reactive B cells from an individual who was last vaccinated against tetanus more than a decade ago demonstrates the ability of this method to be used to enrich the tetanus-toxoid-binding cells approximately seven-fold with the purity of about 4%The addition of a 50-fold excess of unlabeled tetanus toxoid to the cells from a subject who was vaccinated about three years prior to the blood draw. Before biotinylated antigen is added, the tetanus-toxoid binding is decreased by 83%demonstrating the specificity of antigen binding. When the biotinylated antigen is omitted from the procedure, only 0.2%of the B cells still bind, presumably, reflecting the binding of some non-tetanus antigen in the absorbent.These graphs demonstrate how the frequency of tetanus-toxoid-specific naive B cells from a blood sample drawn seven days after the booster vaccination of a healthy subject, decreases from 84%to 64%after the boost. While the percentage of memory and plasmablast populations increases from 16%to 36%and zero to 40%respectively. Further, representative ELISPOT data from a peripheral blood sample obtained seven days post-boost from a healthy subject illustrate the four-fold enrichment in tetanus-toxoid antibody-secreting cell frequency observed in the isolated tetanus-toxoid-binding B cells.Once mastered, this technique can be completed in about three to four hours with all the proper controls. The method can be combined with secondary assays, for example, transfer of cells into adopted recipients for subsequent studies of cell fate and function. After watching this video, you should have a good understanding of how to isolate and enrich for rare antigen-binding B cells from human peripheral blood using the proper controls.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

बी कोशिकाओं की CD40 सक्रियण के murine मॉडल

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

विशिष्ट प्रतिजन Vivo में हत्या CFSE लेबल टारगेट कक्ष का उपयोग परख

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

कुशल के लिए खूनी कृत्रिम एंटीजन पेश कोशिकाओं (KaAPC)<em&gt; इन विट्रो</em&gt; मानव प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं की कमी

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

सच का पता लगाने के लिए माउस बी वंश प्रकोष्ठों आईजीई व्यक्त

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Nanoparticle के टीकाकरण के बाद के विश्लेषण से प्रतिजन विशेष CD8 + टी सेल प्रतिक्रिया के लिए पूरे पशु इमेजिंग और प्रवाह cytometric तकनीकों

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

स्व-प्रतिरक्षात्मकता खिलाफ स्टेम सेल व्युत्पन्न विशिष्ट प्रतिजन विनियामक टी कोशिकाओं के विकास

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

सीटू में MHC-tetramer धुंधला और मात्रात्मक विश्लेषण स्थान, बहुतायत, और Phenotype के ऊतकों में प्रतिजन-विशिष्ट सीडी टी कोशिकाओं का निर्धारण करने के लिए

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Vivo में एक टीकाकरण मॉडल का उपयोग कर प्रतिजन-विशिष्ट टी-सेल Cytolytic फ़ंक्शन का पता लगाने के लिए परख

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

दुर्लभ प्रतिजन-विशिष्ट बी कोशिकाओं से रक्त में परिचालित में भेदभावपूर्ण मानव मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की पीढ़ी

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Murine सीमांत क्षेत्र बी कोशिकाओं के कतरनी प्रवाह प्रेरित प्रवासन का विश्लेषण इन विट्रो में

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...