Name: expression of exogenous cytokine in patient-derived xenografts via injection with a cytokine-transduced stromal cell line
Uploaded: 2017-05-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Exogenous Cytokine in Patient-derived Xenografts via Injection with a Cytokine-transduced Stromal Cell Line at JoVE.com

This work was supported by NIH R21CA162259, NIH R01CA209829, NIH P20 MD006988, NIH 2R25 GM060507, a Hyundai Hope on Wheels Scholar Hope Grant, the Department of Pathology and Human Anatomy, the Department of Basic Sciences, and the Center for Health Disparities and Molecular Medicine at Loma Linda University School of Medicine and by a Grant to Promote Collaborative and Translational Research from Loma Linda University (KJP). The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the NIH.

<html> Studier ble utført i samsvar med Loma Linda Universitets Institutt for dyrepleie og brukskomité (IACUC) og Institutional Review Board (IRB) godkjente protokoller og i henhold til alle føderale retningslinjer. FORSIKTIG: PDX og humant vev skal håndteres i samsvar med sikkerhetsprosedyrer for å forhindre overføring av blodbårne patogener. 1. Kultur og utvidelse av cytokin-transduserte stromceller MERK: Hver gang stroma passer...

<ol>
	<li>Francis, O. L., Milford, T. A., Beldiman, C., Payne, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-tuning+patient-derived+xenograft+models+for+precision+medicine+approaches+in+leukemia.">Fine-tuning patient-derived xenograft models for precision medicine approaches in leukemia.</a> J Investig Med. 64 (3), 740-744 (2016).</li><li>Parrish, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7+Dependence+in+human+B+lymphopoiesis+increases+during+progression+of+ontogeny+from+cord+blood+to+bone+marrow.">IL-7 Dependence in human B lymphopoiesis increases during progression of ontogeny from cord blood to bone marrow.</a> J Immunol. 182 (7), 4255-4266 (2009).</li><li>Johnson, S. E., Shah, N., Panoskaltsis-Mortari, A., LeBien, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+and+human+IL-7+activate+STAT5+and+induce+proliferation+of+normal+human+pro-B+cells.">Murine and human IL-7 activate STAT5 and induce proliferation of normal human pro-B cells.</a> J Immunol. 175 (11), 7325-7331 (2005).</li><li>Milford, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TSLP+or+IL-7+provide+an+IL-7Ralpha+signal+that+is+critical+for+human+B+lymphopoiesis.">TSLP or IL-7 provide an IL-7Ralpha signal that is critical for human B lymphopoiesis.</a> Eur J Immunol. 46 (9), 2155-2161 (2016).</li><li>Reche, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+thymic+stromal+lymphopoietin+preferentially+stimulates+myeloid+cells.">Human thymic stromal lymphopoietin preferentially stimulates myeloid cells.</a> J Immunol. 167 (1), 336-343 (2001).</li><li>Francis, O. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+xenograft+model+to+study+the+role+of+TSLP-induced+CRLF2+signals+in+normal+and+malignant+human+B+lymphopoiesis.">A novel xenograft model to study the role of TSLP-induced CRLF2 signals in normal and malignant human B lymphopoiesis.</a> Haematologica. 101 (4), 417-426 (2016).</li><li>Willinger, T., Rongvaux, A., Strowig, T., Manz, M. G., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+human+hemato-lymphoid-system+mice+by+cytokine+knock-in+gene+replacement.">Improving human hemato-lymphoid-system mice by cytokine knock-in gene replacement.</a> Trends Immunol. 32 (7), 321-327 (2011).</li><li>Graf, L., Iwata, M., Torok-Storb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+the+functionally+distinct+human+bone+marrow+stromal+cell+lines+HS-5+and+HS-27a.">Gene expression profiling of the functionally distinct human bone marrow stromal cell lines HS-5 and HS-27a.</a> Blood. 100 (4), 1509-1511 (2002).</li><li>Follenzi, A., Ailles, L. E., Bakovic, S., Geuna, M., Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+by+lentiviral+vectors+is+limited+by+nuclear+translocation+and+rescued+by+HIV-1+pol+sequences.">Gene transfer by lentiviral vectors is limited by nuclear translocation and rescued by HIV-1 pol sequences.</a> Nat Genet. 25 (2), 217-222 (2000).</li><li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system.">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J Vis Exp. (63), e4031 (2012).</li><li>Cockrell, A. S., Kafri, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+by+lentivirus+vectors.">Gene delivery by lentivirus vectors.</a> Mol Biotechnol. 36 (3), 184-204 (2007).</li><li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freezing,+thawing,+and+packaging+cells+for+transport.">Freezing, thawing, and packaging cells for transport.</a> J Vis Exp. (17), (2008).</li><li>Tasian, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+STAT5+and+PI3K/mTOR+pathway+signaling+occurs+in+human+CRLF2-rearranged+B-precursor+acute+lymphoblastic+leukemia.">Aberrant STAT5 and PI3K/mTOR pathway signaling occurs in human CRLF2-rearranged B-precursor acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 120 (4), 833-842 (2012).</li><li>Kalaitzidis, D., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-cytometric+phosphoprotein+analysis+reveals+agonist+and+temporal+differences+in+responses+of+murine+hematopoietic+stem/progenitor+cells.">Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells.</a> PLoS One. 3 (11), (2008).</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li><li>Kovacsics, D., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+expression+of+proteins+by+hydrodynamic+gene+delivery+in+mice.">Transient expression of proteins by hydrodynamic gene delivery in mice.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types.">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li><li>Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+15,+Creation+of+&amp;#34;humanized&amp;#34;+mice+to+study+human+immunity.">Chapter 15, Creation of &amp;#34;humanized&amp;#34; mice to study human immunity.</a> Curr Protoc Immunol. , (2008).</li><li>Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+bone+marrow+derived+murine+dendritic+cells+for+use+in+2-photon+imaging.">Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging.</a> J Vis Exp. (17), (2008).</li><li>Scheeren, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymic+stromal+lymphopoietin+induces+early+human+B-cell+proliferation+and+differentiation.">Thymic stromal lymphopoietin induces early human B-cell proliferation and differentiation.</a> Eur J Immunol. 40 (4), 955-965 (2010).</li><li>Lee, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+serum+thymic+stromal+lymphopoietin+in+children+with+atopic+dermatitis.">Increased serum thymic stromal lymphopoietin in children with atopic dermatitis.</a> Pediatr Allergy Immunol. 21 (2 Pt 2), e457-e460 (2010).</li></ol>

Dette manuskriptet beskriver en enkel, rask og relativt kostnadseffektiv metode for konstruksjon av PDX for å uttrykke eksogent humant cytokin. Strategien beskrevet her er basert på ukentlige intraperitoneale injeksjoner av en stromalcellelinje transdusert for å uttrykke det humane cytokin, TSLP. Før utførelse av metodene beskrevet her, ble stroma konstruert for å uttrykke høye nivåer av cytokinet av interesse (TSLP) og tilsvarende konstruert kontrollstroma generert. I protokollene som presenteres her, blir stro...

Pasient-avledede xenografter (PDX) er en kraftig in vivo- modell for å studere produksjon av normale og ondartede hematopoietiske celler i et &quot;naturlig&quot; pattedyrsmiljø. Oftest produseres PDX ved å injisere eller transplantere humane celler til immundefekte mus. Produksjonen av PDX ved bruk av normale humane hematopoietiske stamceller tillater in vivo studier av normalt humant blod og utvikling av immuncelle. PDX produsert fra leukemi eller andre kreftceller gjør det mulig å studere onkogene mekanismer og identifisere effektive terapier i sammenheng med omfanget av genetiske landskaper og mutasjoner tilstede i den humane befolkningen. 1 PDX er derfor den nåværende gullstandarden for translasjonell biomedisinsk forskning for å identifisere effektive terapier og et viktig verktøy for å forstå mekanismer for kreftprogresjon. PDX-modeller er et viktig verktøy for å støtte forskning i helseforskjeller sykdommer på grunn av spesifikke<html> Genetiske lesjoner, eller en hvilken som helst sykdom der variasjonene i pasientens genetiske landskap kan i vesentlig grad bidra til onkogenese og behandlingsresultat. Mus-humane PDX-modeller er mulige fordi mange mus-cytokiner tilstrekkelig etterligner deres humane analoger ved aktivering av cytokinreceptorene av humane celler mens de er inne i musen. For eksempel gir interleukin-7 (IL-7) et kritisk signal for human B-celleutvikling. 2 I dette tilfelle har musen IL-7 tilstrekkelig homologi med human IL-7 at mus-cytokinet stimulerer signalveier i humane B-celleforløpere. 2 , 3 , 4 Dette er imidlertid ikke tilfelle for tymisk stromal lymfopoietin (TSLP), 5 , 6 som blant annet cytokiner (IL-3, granulocyt-makrofagkolonistimulerende faktor (GM-CSF), stamcellefaktor (SCF) ,Ref &quot;&gt; 7 er viktig for produksjon av normale og ondartede humane hematopoietiske celler. Når mus og humane cytokiner viser lav homologi, aktiverer muscytokinene ikke sine respektive reseptorer på humane celler. For å overvinne denne hindringen, har en rekke strategier blitt brukt For å konstruere ekspresjon av humane cytokiner i PDX-mus. Disse inkluderer injeksjon av rekombinante humane cytokiner, hydrodynamisk injeksjon av DNA, lentiviral ekspresjon, transgen ekspresjon og knockin-genutskiftning. 7 Denne rapporten beskriver en metode for konstruksjon av PDX for å produsere humant cytokin via stromal-mediert Cytokinlevering ( figur 1 ). I metoden som er demonstrert her, er PDX-mus konstruert for å uttrykke det humane cytokinet, TSLP, eller å tjene som cytokin-negative kontroller. TSLP-uttrykkende PDX oppnås ved ukentlig intraperitoneal injeksjon av stromalceller som har blitt transdusert for å uttrykke høye nivåer av human TSLP.Cytokin-negative PDX &quot;kontroll&quot; -mus er på samme måte konstruert; Selv om kontrollstroma blir transdusert med en kontrollvektor. Denne metoden oppnår normale fysiologiske nivåer av human TSLP i PDX-mus injisert med TSLP + stroma. Ingen detekterbar TSLP blir observert i PDX-mus som mottar den cytokin-negative stroma. Vi valgte den humane stromalcellelinjen HS-27A for våre studier fordi den vokser robust i kultur og viser svært lavt nivå av cytokinproduksjon som ikke støtter proliferasjon av isolerte stamceller i kulturer. 8 For humant TSLP-uttrykk ble stroma transdusert med en avansert, selvinaktiverende lentiviral vektor avledet fra en tidligere beskrevet ryggrad 9 og inkluderer cPPT / cts-elementet og trichchip hepatitt post-transkripsjonell regulatorisk element (WPRE) for å øke transgenuttrykk. Det humane TSLP-genet ble konstruert i denne vektoren under kontroll av forlengelsesfaktoren-1(EF-1) alfa-promotor for å oppnå robust, konstitutivt og langsiktig uttrykk. Konstruksjonen av denne human-cytokin-forbedrede PDX-modellen består av 4 hovedtrinn. Først ekspanderes stroma ekspandert in vitro og vurderes ved enzymkoblet immunosorbentanalyse (ELISA) for stabil, høyt nivå cytokinproduksjon. For det andre bekreftes aktiviteten av humant cytokin fremstilt av de transduserte stromaceller (og mangel på cytokinaktivitet fra kontrollstroma) ved bruk av fosfos-flowcytometri. Cellelinjer som er kjent for å være responsive mot cytokin av interesse (i dette tilfelle, TSLP) inkuberes med stromalcelle-supernatant og analyseres for cytokininducert fosforylering. For det tredje blir mus injisert med transduced human stroma, og deretter blir museplasma evaluert av ELISA for nivåer av humant cytokin på ukentlig basis. Fjerde menneskelige hematopoietiske celler transplanteres og in vivo funksjonelle effekter av det humane cytokinet blir evaluert på et kjent mål ( <em&gt; F.eks. Cellepopulasjon). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/55384/55384fig1.jpg" /> Figur 1: PDX-modell konstruert for å produsere eksogen human cytokin hos mus. ( 1A ) Designeksperiment og oppnå transduserte humane stromalceller ( 1B ) Oppnå humane celler (hematopoietiske stamceller, leukemiceller osv .) For å generere PDX (pasient-avledede xenograft) mus. ( 2A ) Injiser konstruerte stroma og ( 2B ) transplanterte humane celler til immundefekte mus i henhold til eksperimentell tidsplan. ( 3A-B ) Monitor cytokinkonsentrasjoner i stroma supernatanten og museplasmaet ved ELISA. ( 4 ) Harvest menneskelige celler og vurdere in vivo funksjonelle effekter av det humane cytokinet tilstede i PDX. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55384/55384fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her</a>For å se en større versjon av denne figuren. Levering av humant cytokin via stromaceller gir både fordeler og ulemper når det sammenlignes med andre metoder for å levere / produsere humane cytokiner i PDX-mus. 7 Sammenlignet med injeksjon av rekombinant humant cytokin er stroma-mediert tilførsel generelt billigere (kostnaden for stromalcellekultur er mindre enn kostnaden for rekombinant cytokin) og mindre arbeidsintensiv (en injeksjon per uke versus flere injeksjoner per uke). Spørsmålet om kort cytokinhalveringstid reduseres også siden stroma kontinuerlig produserer det eksogene cytokinet. Levering av cytokin via hydrodynamisk injeksjon av DNA kan være rimeligere enn levering via stroma. Det er imidlertid også forbigående og kan kreve mer teknisk ferdighet enn den enkle ukentlige intraperitoneale injeksjonen som kreves for stroma-mediert levering. Lentiviral genuttrykk i musen kan gi en mindre traNsient metode for cytokin levering; Men i våre hender ble fysiologiske TSLP-nivåer ikke oppnådd. I tillegg er denne metoden arbeidskrevende, og krever kontinuerlig produksjon av lentiviral vektor. Transgene eller knock-in-mus tilbyr stabilt langsiktig uttrykk for cytokin og kan konstrueres for vevsspesifikke uttrykk, noe som kan være en fordel. På den annen side, krever det transgene uttrykket av det humane cytokin-gen på den immundefekte musbakgrunnen som kreves for PDX-mus, en enorm investering av ressurser før verdien av modellen er blitt etablert. Videre tillater ikke transgene modeller generelt muligheten til å variere tidspunktet for cytokininitiering eller nivået av in vitro- cytokinproduksjon. Disse kan oppnås med stroma-mediert levering ved ganske enkelt å endre tidspunktet for initiering av stromalcelleinjeksjon eller dosen av injiserte stromalceller. Den stromal-cellemedierte cytokin-leveringsmetodenOd detaljert her ble brukt til å utvikle PDX for å evaluere rollen av TSLP i normal human B-celleutvikling 4 , 6 og høy risiko B-celle akutt lymfoblastisk leukemi. 6 Denne metoden gir en alternativ cytokin-leveringsmetode for bruk ved generering av lignende modeller med andre cytokiner enn TSLP. Denne modellen kan også være nyttig for å generere foreløpige data som kan bidra til å avgjøre om verdien av en cytokin-transgen eller cytokin-knappe PDX-modell ville være verdig til den betydelige investeringen i tid og penger.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1101">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Wet lab reagents&#160;</td>
			<td style="width:212px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T-25 Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks, 7 mL capacity,&#160; 25cm&#178; culture area</td>
			<td style="width:212px;">Thermo Scientific / Fisher</td>
			<td style="width:136px;">156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">T-75 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 250 mL capacity, 75 cm&#178; culture area &#38; vented cap</td>
			<td style="width:212px;">Corning Inc. / Fisher</td>
			<td style="width:136px;">353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">T-150 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 600 mL capacity, 150 cm&#178; culture area &#38; vented cap</td>
			<td style="width:212px;">Corning Inc. / Fisher</td>
			<td style="width:136px;">355001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">10 mL serological pipettes</td>
			<td style="width:212px;">Falcon</td>
			<td style="width:136px;">357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">15 mL&#160; polypropylene conical tubes</td>
			<td style="width:212px;">Fisher</td>
			<td style="width:136px;">05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">5 mL round-bottom polystyrene tubes</td>
			<td style="width:212px;">Falcon</td>
			<td style="width:136px;">352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">50 mL polypropylene conical tubes</td>
			<td style="width:212px;">Falcon</td>
			<td style="width:136px;">352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">2.0 mL cryogenic vials, externally threaded</td>
			<td style="width:212px;">Corning Inc. / Fisher</td>
			<td style="width:136px;">4230659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">1 mL pipette tips</td>
			<td style="width:212px;">Fisher</td>
			<td style="width:136px;">2707509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">200 &#956;L pipette tips&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:136px;">P3020-CPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">10 &#956;L pipette tips</td>
			<td style="width:212px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:136px;">P-1096-CP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Sterile Disposable Filter Units with SFCA Membrane, Nalgene Rapid-Flow</td>
			<td style="width:212px;">Fisher</td>
			<td style="width:136px;">09-740-28D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:665px;">2N H2SO4&#160;</td>
			<td style="width:212px;">BioLegend</td>
			<td style="width:136px;">423001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (PBS) without calicium and magnesium, 1&#215;</td>
			<td style="width:212px;">Corning cellgro/ Mediatech</td>
			<td style="width:136px;">21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Human TSLP ELISA Max Deluxe Set</td>
			<td style="width:212px;">BioLegend</td>
			<td style="width:136px;">434204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">3% Acetic Acid with Methylene Blue</td>
			<td style="width:212px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:136px;">7060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Trypan Blue&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Corning</td>
			<td style="width:136px;">25-900-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">&#34;Trypsin&#34; 1x 0.25% Trypsin 2.21 mM EDTA in HBSS</td>
			<td style="width:212px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:136px;">25-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">TWEEN 20 BioXtra</td>
			<td style="width:212px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">P-7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">&#8220;R10&#8221; cell culture medium, % of total volume (makes 565 mL)</td>
			<td style="width:212px;">-</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td style="width:88px;">Lab Recipe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">RPMI, 88.5% (500 mL)&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Mediatech</td>
			<td style="width:136px;">10-040-CV&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">FBS, 9.9% (56 mL)&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Mediatech</td>
			<td style="width:136px;">35-011-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">L-Glutamine, 0.99% (5.6 mL)&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Mediatech</td>
			<td style="width:136px;">25-005-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Penicillin-Streptomycin, 0.50% (2.8 mL)&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Mediatech</td>
			<td style="width:136px;">30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">2-Mercaptoethanol, 0.10% (560 &#181;L)&#160;</td>
			<td style="width:212px;">MP</td>
			<td style="width:136px;">190242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">&#8220;R20&#8221; cell culture medium, % of total volume (makes 195 mL)</td>
			<td style="width:212px;">-</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td style="width:88px;">Lab Recipe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">&#160;&#160;&#160;&#160; RPMI, 76.84% (150&#160; mL)</td>
			<td style="width:212px;">see above</td>
			<td style="width:136px;">see above</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">&#160;&#160;&#160;&#160; FBS, 20.49% (40 mL)</td>
			<td style="width:212px;">see above</td>
			<td style="width:136px;">see above</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">&#160;&#160;&#160;&#160; 2mM L-glutamine, 1.02% (2 mL)</td>
			<td style="width:212px;">see above</td>
			<td style="width:136px;">see above</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">&#160;&#160;&#160;&#160; 1mM Na pyruvate, 1.02% (2 mL )</td>
			<td style="width:212px;">see above</td>
			<td style="width:136px;">see above</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">&#160;&#160;&#160;&#160; Penicillin-Streptomycin,&#160; 0.51% (1 mL)</td>
			<td style="width:212px;">see above</td>
			<td style="width:136px;">see above</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">&#160;&#160;&#160;&#160; 2-Mercaptoethanol, 0.10% (0.1 M),&#160; 0.10% (200 &#181;L)</td>
			<td style="width:212px;">see above</td>
			<td style="width:136px;">see above</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">&#8220;Freezing medium&#8221;, % of total volume</td>
			<td style="width:212px;">-</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td style="width:88px;">Lab Recipe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">&#8220;R10&#8221; medium, 45%</td>
			<td style="width:212px;">see &#34;R10&#34; recipe</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">FBS, 20%</td>
			<td style="width:212px;">see above</td>
			<td style="width:136px;">35-011-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">DMSO, 10%</td>
			<td style="width:212px;">Corning</td>
			<td style="width:136px;">25-950-CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:665px;">D(-)(+)-Trehalose dihydrate, 5%</td>
			<td style="width:212px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">BP2687-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Name</td>
			<td style="width:212px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catolog Number</td>
			<td style="width:88px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Biologics&#160;</td>
			<td style="width:212px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">&#34;HS-27&#34; HS-27A human stroma line</td>
			<td style="width:212px;">ATCC</td>
			<td>CRL-2496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">&#34;CALL-4&#34; MHH-CALL-4 cell line, human B cell precursor leukemia</td>
			<td style="width:212px;">DSMZ</td>
			<td style="width:136px;">ACC 337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:665px;">&#8220;NSG mice&#8221; NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, male or female, age 6 &#8211; 8 weeks</td>
			<td style="width:212px;">JAX Mice&#160;</td>
			<td style="width:136px;"># 005557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">MUTZ-5 cell line, human B cell precursor leukemia</td>
			<td style="width:212px;">DSMZ</td>
			<td style="width:136px;">ACC 490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:665px;">Recombinant Human TSLP protein</td>
			<td style="width:212px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:136px;">1398-TS-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Name</td>
			<td style="width:212px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catolog Number</td>
			<td style="width:88px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Flow cytomery antibodies (clone)*</td>
			<td style="width:212px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Anti-mouse CD45 FITC (30F11)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-102-778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">CD127 PE (MB15-18C9) (alternate name is IL-7R&#945;)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">CD34 APC (8G12)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">CD45 PE-Cy7&#160; (HI30)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#34;FVD&#34; Fixable viability dye&#160; eFluor 780&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>65-0865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Ig &#954; light chain FITC&#160; (G20-193)</td>
			<td style="width:212px;">BD Pharmingen</td>
			<td>555791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Ig &#955; light chain FITC (JDC-12)</td>
			<td style="width:212px;">BD Pharmingen</td>
			<td>561379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">IgD PE (IA6-2)</td>
			<td style="width:212px;">BioLegend</td>
			<td>348203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">IgM PE-Cy5 (G20-127)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:665px;">pSTAT5 PE,&#160; mouse anti-STAT5 (pY694)</td>
			<td style="width:212px;">BD PhosphoFlow</td>
			<td>612567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Name</td>
			<td style="width:212px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catolog Number</td>
			<td style="width:88px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Other materials &#38; equipment&#160;</td>
			<td style="width:212px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Animal Implantable Nano Transponder with Canula</td>
			<td style="width:212px;">Trovan&#160;</td>
			<td style="width:136px;">ID-100B(1.25)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EMLA lidocaine anesthetic cream (obtain by presciption through animal care facility)</td>
			<td style="width:212px;">perscription</td>
			<td style="width:136px;">perscription</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD &#189; cc LO-DOSE U-100 Insulin Syringe 28G&#189;&#160;</td>
			<td style="width:212px;">BD</td>
			<td style="width:136px;">#329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:665px;">BD Microtainer Tubes with K2EDTA</td>
			<td style="width:212px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:136px;">#365974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:136px;">Alegra X-15R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FisherBrand Capillary Tubes (Heparinized)</td>
			<td style="width:212px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">22-260-950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:212px;">Fisher</td>
			<td style="width:136px;">02-671-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">MACSQuant Analyzer 10</td>
			<td style="width:212px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:136px;">130-096-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Mouse Pie Cage</td>
			<td style="width:212px;">Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:136px;">MPC-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Mouse Tail Illuminator Restrainer</td>
			<td style="width:212px;">Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:136px;">MTI STD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Pistol Grip Implanter</td>
			<td style="width:212px;">Trovan&#160;</td>
			<td style="width:136px;">IM-300(1.25)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">&#181;Quant&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Bio-Tek Instruments Inc.</td>
			<td style="width:136px;">MQX200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">FlowJo flow cytometry analysis software</td>
			<td>FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:136px;">Version 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">*All antibodies are anti-human unless otherwise stated.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of exogenous cytokine in patient-derived xenografts via injection with a cytokine-transduced stromal cell line

Pasient-avledede xenograftmus (PDX) produseres ved transplantasjon av humane celler til immundefekte mus. Disse modellene er et viktig verktøy for å studere mekanismer for normal og ondartet hematopoiesis og er gullstandarden for å identifisere effektive kjemoterapier for mange maligniteter. PDX-modeller er mulige fordi mange av mus cytokiner også virker på humane celler. Dette er imidlertid ikke tilfelle for alle cytokiner, inkludert mange som er kritiske for å studere normal og ondartet hematopoiesis i humane celler. Teknikker som konstruerer mus for å produsere humane cytokiner (transgene og inntaksmodeller) krever betydelig kostnad før bruken av modellen har blitt påvist. Andre teknikker er arbeidsintensive (injeksjon av rekombinant cytokin eller lentivirus) og krever i noen tilfeller høye tekniske ferdigheter (hydrodynamisk injeksjon av DNA). Denne rapporten beskriver en enkel metode for å generere PDX-mus som har eksogen menneskelig cyTokin (TSLP, tymisk stromal lymfopoietin) via ukentlig intraperitoneal injeksjon av stroma som er blitt transdusert for å overuttrykke dette cytokinet. Bruk av denne metoden gir en in vivo kilde til kontinuerlig cytokinproduksjon som oppnår fysiologiske nivåer av sirkulerende humant cytokin i musen. Plasmanivåer av humant cytokin kan varieres basert på antall stromalceller som injiseres, og cytokinproduksjon kan påbegynnes på et hvilket som helst tidspunkt i forsøket. Denne metoden inkluderer også cytokin-negative kontrollmus som er produsert på samme måte, men gjennom intraperitoneal injeksjon av stroma transdusert med en kontrollvektor. Vi har tidligere vist at leukemiceller høstet fra TSLP-uttrykkende PDX, sammenlignet med kontroll PDX, viser et genuttrykksmønster mer som den opprinnelige pasientprøven. Sammen produserer cytokin-produserende og cytokin-negative PDX-mus produsert ved denne metoden et modellsystem som vi har brukt med suksess til å studereTSLPs rolle i normal og ondartet hematopoiesis.

En oversikt over modellen er vist i Figur 1 . Når cytokin-produserende (TSLP + stroma) og kontrollstroma er blitt oppnådd, blir de utvidet i kultur. Før stroma injeksjon i mus, vurderes stromalcelle-supernatanten ved hjelp av ELISA for å verifisere cytokinproduksjon ( Figur 2 ) og fosfostrømningscytometri (Protokol nr. 3) brukes til å verifisere aktiviteten til cytokinet produsert av stroma. Supernatant oppsamles fra sammenflytende stromalcellekult...

Watch this Scientific Journal Video about Expression of Exogenous Cytokine in Patient-derived Xenografts via Injection with a Cytokine-transduced Stromal Cell Line at JoVE.com

Expression of Exogenous Cytokine in Patient-derived Xenografts via Injection with a Cytokine-transduced Stromal Cell Line

Beskrevet her er en metode for fremstilling av eksogent cytokin i pasient-avledede xenograftmus (PDX) -mus via ukentlig intraperitoneal injeksjon av en cytokin-transduced stromalcellelinje. Denne metoden utvider bruken av PDX og gir muligheten for forbigående eller vedvarende eksogen cytokinlevering i en rekke PDX-modeller.

Ekspresjon av eksogen cytokin i pasient-avledede xenotransplantater via injeksjon med en cytokin-transduced stromcellelinje

Patient-derived xenograft (PDX) mice are produced by transplanting human cells into immune deficient mice. These models are an important tool for studying ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Eksperimentell Generation of Karsinom-Associated Fibroblaster (kafeer) fra Human mammary Fibroblaster

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Pasient avledet celle Kultur og Isolering av CD133<sup&gt; +</sup&gt; Antatte kreft stamceller fra melanom

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Collecting Saliva and Measuring Salivary Cortisol and Alpha-amylase in Frail Community Residing Older Adults via Family Caregivers

Salivary measures have emerged in bio-behavioral research  that are easy-to-collect, minimally invasive, and relatively inexpensive  biologic markers of ...

Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts

Minimal Invasive Etablering av Murint orthotopic Blære xenografts

Orthotopic bladder cancer xenografts are the gold standard to study molecular cellular manipulations and new therapeutic agents&#160;in vivo. Suitable ...

Ultrasound-guided Transthoracic Intramyocardial Injection in Mice

Ultralydveiledet Transtorakal Intramyocardial Injeksjon i Mus

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. ...

Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography

Vurdering av Livskraftig of Human Fat Injeksjon i Nude Mus med Micro-Datatomografiscanning

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

Isolasjon og immortalization av pasient-avledet cellelinjer fra muskelbiopsi for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Generering av Prostate Cancer Patient Avledet xenotransplantat Modeller fra Sirkulasjonstumorceller

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Nedbryting av museceller fra menneske tumorxenotransplantater forbedrer Nedstrøms Analyse av Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Full-root Aortic Valve Replacement by Stentless Aortic Xenografts in Patients with Small Aortic Roots

Full-rot Aortic Valve Replacement av Stentless Aortic Xenografts hos pasienter med små Aortic røtter

In patients with small aortic roots who need an aortic valve replacement with biological valve substitutes, the implantation of the stented pericardial ...