Name: expression of exogenous cytokine in patient-derived xenografts via injection with a cytokine-transduced stromal cell line
Uploaded: 2017-05-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Exogenous Cytokine in Patient-derived Xenografts via Injection with a Cytokine-transduced Stromal Cell Line at JoVE.com

This work was supported by NIH R21CA162259, NIH R01CA209829, NIH P20 MD006988, NIH 2R25 GM060507, a Hyundai Hope on Wheels Scholar Hope Grant, the Department of Pathology and Human Anatomy, the Department of Basic Sciences, and the Center for Health Disparities and Molecular Medicine at Loma Linda University School of Medicine and by a Grant to Promote Collaborative and Translational Research from Loma Linda University (KJP). The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the NIH.

<html> Studier genomfördes i enlighet med Loma Linda Universitys Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) och Institutional Review Board (IRB) godkända protokoll och enligt alla federala riktlinjer. VARNING: PDX och mänskliga vävnader ska hanteras i enlighet med säkerhetsförfaranden för att förhindra överföring av blodburna patogener. 1. Kultur och expansion av cytokin-transducerade stromceller OBS: Varje gång strom...

<ol>
	<li>Francis, O. L., Milford, T. A., Beldiman, C., Payne, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-tuning+patient-derived+xenograft+models+for+precision+medicine+approaches+in+leukemia.">Fine-tuning patient-derived xenograft models for precision medicine approaches in leukemia.</a> J Investig Med. 64 (3), 740-744 (2016).</li><li>Parrish, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7+Dependence+in+human+B+lymphopoiesis+increases+during+progression+of+ontogeny+from+cord+blood+to+bone+marrow.">IL-7 Dependence in human B lymphopoiesis increases during progression of ontogeny from cord blood to bone marrow.</a> J Immunol. 182 (7), 4255-4266 (2009).</li><li>Johnson, S. E., Shah, N., Panoskaltsis-Mortari, A., LeBien, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+and+human+IL-7+activate+STAT5+and+induce+proliferation+of+normal+human+pro-B+cells.">Murine and human IL-7 activate STAT5 and induce proliferation of normal human pro-B cells.</a> J Immunol. 175 (11), 7325-7331 (2005).</li><li>Milford, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TSLP+or+IL-7+provide+an+IL-7Ralpha+signal+that+is+critical+for+human+B+lymphopoiesis.">TSLP or IL-7 provide an IL-7Ralpha signal that is critical for human B lymphopoiesis.</a> Eur J Immunol. 46 (9), 2155-2161 (2016).</li><li>Reche, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+thymic+stromal+lymphopoietin+preferentially+stimulates+myeloid+cells.">Human thymic stromal lymphopoietin preferentially stimulates myeloid cells.</a> J Immunol. 167 (1), 336-343 (2001).</li><li>Francis, O. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+xenograft+model+to+study+the+role+of+TSLP-induced+CRLF2+signals+in+normal+and+malignant+human+B+lymphopoiesis.">A novel xenograft model to study the role of TSLP-induced CRLF2 signals in normal and malignant human B lymphopoiesis.</a> Haematologica. 101 (4), 417-426 (2016).</li><li>Willinger, T., Rongvaux, A., Strowig, T., Manz, M. G., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+human+hemato-lymphoid-system+mice+by+cytokine+knock-in+gene+replacement.">Improving human hemato-lymphoid-system mice by cytokine knock-in gene replacement.</a> Trends Immunol. 32 (7), 321-327 (2011).</li><li>Graf, L., Iwata, M., Torok-Storb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+the+functionally+distinct+human+bone+marrow+stromal+cell+lines+HS-5+and+HS-27a.">Gene expression profiling of the functionally distinct human bone marrow stromal cell lines HS-5 and HS-27a.</a> Blood. 100 (4), 1509-1511 (2002).</li><li>Follenzi, A., Ailles, L. E., Bakovic, S., Geuna, M., Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+by+lentiviral+vectors+is+limited+by+nuclear+translocation+and+rescued+by+HIV-1+pol+sequences.">Gene transfer by lentiviral vectors is limited by nuclear translocation and rescued by HIV-1 pol sequences.</a> Nat Genet. 25 (2), 217-222 (2000).</li><li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system.">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J Vis Exp. (63), e4031 (2012).</li><li>Cockrell, A. S., Kafri, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+by+lentivirus+vectors.">Gene delivery by lentivirus vectors.</a> Mol Biotechnol. 36 (3), 184-204 (2007).</li><li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freezing,+thawing,+and+packaging+cells+for+transport.">Freezing, thawing, and packaging cells for transport.</a> J Vis Exp. (17), (2008).</li><li>Tasian, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+STAT5+and+PI3K/mTOR+pathway+signaling+occurs+in+human+CRLF2-rearranged+B-precursor+acute+lymphoblastic+leukemia.">Aberrant STAT5 and PI3K/mTOR pathway signaling occurs in human CRLF2-rearranged B-precursor acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 120 (4), 833-842 (2012).</li><li>Kalaitzidis, D., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-cytometric+phosphoprotein+analysis+reveals+agonist+and+temporal+differences+in+responses+of+murine+hematopoietic+stem/progenitor+cells.">Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells.</a> PLoS One. 3 (11), (2008).</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li><li>Kovacsics, D., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+expression+of+proteins+by+hydrodynamic+gene+delivery+in+mice.">Transient expression of proteins by hydrodynamic gene delivery in mice.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types.">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li><li>Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+15,+Creation+of+&amp;#34;humanized&amp;#34;+mice+to+study+human+immunity.">Chapter 15, Creation of &amp;#34;humanized&amp;#34; mice to study human immunity.</a> Curr Protoc Immunol. , (2008).</li><li>Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+bone+marrow+derived+murine+dendritic+cells+for+use+in+2-photon+imaging.">Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging.</a> J Vis Exp. (17), (2008).</li><li>Scheeren, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymic+stromal+lymphopoietin+induces+early+human+B-cell+proliferation+and+differentiation.">Thymic stromal lymphopoietin induces early human B-cell proliferation and differentiation.</a> Eur J Immunol. 40 (4), 955-965 (2010).</li><li>Lee, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+serum+thymic+stromal+lymphopoietin+in+children+with+atopic+dermatitis.">Increased serum thymic stromal lymphopoietin in children with atopic dermatitis.</a> Pediatr Allergy Immunol. 21 (2 Pt 2), e457-e460 (2010).</li></ol>

Detta manuskript beskriver en enkel, snabb och relativt kostnadseffektiv metod för att konstruera PDX för att uttrycka exogent humant cytokin. Strategin som beskrivs här är baserad på veckovis intraperitoneala injektioner av en stromalcellinje transducerad för att uttrycka den humana cytokinen, TSLP. Före utförandet av de metoder som beskrivs här genererades strom som konstruerades för att uttrycka höga nivåer av cytokinet av intresse (TSLP) och liknande konstruerat kontrollstrom. I de protokoll som presente...

Patient-härledda xenotransplantat (PDX) är en kraftfull in vivo- modell för att studera produktion av normala och maligna hematopoetiska celler i en &quot;naturlig&quot; däggdjursmiljö. Oftast produceras PDX genom att injicera eller transplantera humana celler i immundeficenta möss. Produktionen av PDX med användning av normala humana hematopoetiska stamceller möjliggör in vivo- studier av normalt humant blod och utveckling av immunceller. PDX som produceras från leukemi eller andra cancerceller gör det möjligt att studera onkogena mekanismer och identifiera effektiva terapier i sammanhanget med de olika genetiska landskapen och mutationer som finns i den mänskliga populationen. 1 PDX är därför den nuvarande guldstandarden för translationell biomedicinsk forskning för att identifiera effektiva terapier och ett viktigt verktyg för att förstå mekanismer för cancerprogression. PDX-modeller är ett viktigt verktyg för att stödja forskning om hälsofördelar sjukdomar på grund av specifika<html> Genetiska skador eller någon sjukdom där variationerna i en patients genetiska landskap kan väsentligt bidra till onkogenes och behandlingsresultat. Mus-humana PDX-modeller är möjliga eftersom många muscytokiner efterliknar efterliknande deras humana analoger vid aktivering av cytokinreceptorerna av humana celler medan de är inne i musen. Till exempel ger interleukin-7 (IL-7) en kritisk signal för humant B-cellutveckling. 2 I detta fall har musen IL-7 tillräcklig homologi med humant IL-7 att muscytokinet stimulerar signalvägar i humana B-cellprekursorer. 2 , 3 , 4 Detta är emellertid inte fallet för tymisk stromal lymfopoietin (TSLP), 5,6 som bland annat cytokiner (IL-3, granulocyt-makrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF), stamcellerfaktor (SCF) ,Ref &quot;&gt; 7 är viktigt för framställning av normala och maligna humana hematopoietiska celler. När mus och humana cytokiner uppvisar låg homologi aktiverar muscytokinerna inte sina respektive receptorer på humana celler. För att övervinna detta hinder har ett antal strategier använts Att manipulera expression av humana cytokiner i PDX-möss. Dessa inkluderar injektion av rekombinanta humana cytokiner, hydrodynamisk injektion av DNA, lentiviraluttryck, transgen expression och knockin-genutbyte. 7 Denna rapport beskriver en metod för att konstruera PDX för att producera humant cytokin via stromal-medierad Cytokinavgivning ( Figur 1 ). I den metod som visas här konstrueras PDX-möss för att uttrycka den humana cytokinen, TSLP eller att fungera som cytokin-negativa kontroller. TSLP-uttryckande PDX uppnås genom veckovis intraperitoneal injektion av stromala celler som har transducerats för att uttrycka höga nivåer av human TSLP.Cytokin-negativa PDX &quot;kontroll&quot; möss är likadana konstruerade; Även om kontrollstroma transduceras med en kontrollvektor. Denna metod uppnår normala fysiologiska nivåer av humant TSLP i PDX-möss injicerade med TSLP + stroma. Ingen detekterbar TSLP observeras i PDX-möss som tar emot den cytokin-negativa stromen. Vi valde den mänskliga stromalcellinjen HS-27A för våra studier eftersom den växer kraftigt i kultur och visar en mycket låg nivå av cytokinproduktion som inte stöder proliferation av isolerade stamceller i kulturer. 8 För humant TSLP-uttryck transducerades stroma med en avancerad generationens självinaktiverande lentiviral vektor härledd från en tidigare beskriven ryggrad 9 och innefattar cPPT / cts-elementet och trichchip hepatit efter transkriptionellt regulatoriskt element (WPRE) för att öka transgenuttryck. Den humana TSLP-genen konstruerades i denna vektor under kontroll av förlängningsfaktorn-1(EF-1) alfa-promotorn för att uppnå robust, konstitutivt och långsiktigt uttryck. Konstruktionen av denna human-cytokin-förstärkta PDX-modell består av 4 huvudsteg. Först expanderas transducerad stroma in vitro och utvärderas genom enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA) för stabil cytokinproduktion på hög nivå. För det andra verifieras aktiviteten av humant cytokin som produceras av de transducerade stromacellerna (och brist på cytokinaktivitet från kontrollstroma) med användning av fosfosflödescytometri. Cellinjer som är kända för att vara mottagliga för cytokin av intresse (i detta fall, TSLP) inkuberas med stromalcells supernatant och analyseras för cytokininducerad fosforylering. För det tredje injiceras möss med transducerad human stroma och sedan utvärderas musplasma genom ELISA för nivåer av humant cytokin på veckovis basis. Fjärde humana hematopoietiska celler transplanteras och de in vivo funktionella effekterna av det humana cytokinet utvärderas på ett känt mål ( <em&gt; T.ex. Cellpopulation). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/55384/55384fig1.jpg" /> Figur 1: PDX-modell konstruerad för att producera exogen human cytokin hos möss. ( 1A ) Konstruktionsexperiment och erhålla transducerade humana stromaceller ( IB ) Erhålla mänskliga celler (hematopoetiska stamceller, leukemiceller, etc. ) för att generera PDX (patient-härledda xenograft) möss. ( 2A ) Injicera konstruerade stroma och ( 2B ) transplanterade humana celler i immundeficenta möss enligt experimentell schema. ( 3A-B ) Monitor cytokinkoncentrationer i strom-supernatanten och musplasma genom ELISA. ( 4 ) Skörda människa celler och bedöma in vivo funktionella effekter av den humana cytokin närvarande i PDX. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55384/55384fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här</a>För att se en större version av denna figur. Leverans av humant cytokin via stromala celler erbjuder både fördelar och nackdelar jämfört med andra metoder för att leverera / producera humana cytokiner i PDX-möss. 7 Jämfört med injektion av rekombinant humant cytokin är stromemedierad leverans i allmänhet billigare (kostnaden för stromalcellodling är mindre än kostnaden för rekombinant cytokin) och mindre arbetsintensiv (en injektion per vecka jämfört med flera injektioner per vecka). Frågan om kort cytokinhalveringstid mildras också eftersom stroma kontinuerligt producerar det exogena cytokinet. Leverans av cytokin via hydrodynamisk injektion av DNA kan vara billigare än leverans via stroma. Det är emellertid likartat övergående och kan kräva mer teknisk skicklighet än den enkla, veckliga intraperitoneala injektionen som krävs för stroma-medierad leverans. Lentiviral-genuttryck i musen kan ge en mindre traNsient metod för cytokinavgivning; Men i våra händer uppnåddes inte fysiologiska TSLP-nivåer. Dessutom är denna metod arbetskrävande, vilket kräver kontinuerlig produktion av lentiviral vektor. Transgena eller knock-in-möss erbjuder stabilt långsiktigt uttryck av cytokin och kan konstrueras för vävnadsspecifik expression, som kan vara en fördel. Å andra sidan kräver det transgena uttrycket av den humana cytokingenen på den immunbristande musbakgrund som krävs för PDX-möss en enorm investering av resurser innan värdet av modellen har fastställts. Vidare tillåter transgena modeller generellt inte möjligheten att variera tidpunkten för cytokininitiering eller nivå av in vivo cytokinproduktion. Dessa kan uppnås med stroma-medierad leverans genom att helt enkelt ändra tidpunkten för initiering av stromalcellinjektion eller dosen av stromalceller som injiceras. Den stromalcellmedierade cytokinleveransmetodenOd detaljerad här användes för att utveckla PDX för att utvärdera rollen av TSLP vid normal human B-cellutveckling 4 , 6 och hög risk B-cell akut lymfoblastisk leukemi. 6 Denna metod tillhandahåller en alternativ cytokinleveransmetod för användning vid framställning av liknande modeller med andra humana cytokiner än TSLP. Denna modell kan också vara användbar för att generera preliminära data som kan hjälpa till att bestämma huruvida värdet av en cytokin-transgen eller cytokin-knock-in PDX-modell skulle vara värdig den betydande investeringen i tid och pengar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1101">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Wet lab reagents&#160;</td>
			<td style="width:212px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T-25 Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks, 7 mL capacity,&#160; 25cm&#178; culture area</td>
			<td style="width:212px;">Thermo Scientific / Fisher</td>
			<td style="width:136px;">156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">T-75 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 250 mL capacity, 75 cm&#178; culture area &#38; vented cap</td>
			<td style="width:212px;">Corning Inc. / Fisher</td>
			<td style="width:136px;">353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">T-150 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 600 mL capacity, 150 cm&#178; culture area &#38; vented cap</td>
			<td style="width:212px;">Corning Inc. / Fisher</td>
			<td style="width:136px;">355001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">10 mL serological pipettes</td>
			<td style="width:212px;">Falcon</td>
			<td style="width:136px;">357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">15 mL&#160; polypropylene conical tubes</td>
			<td style="width:212px;">Fisher</td>
			<td style="width:136px;">05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">5 mL round-bottom polystyrene tubes</td>
			<td style="width:212px;">Falcon</td>
			<td style="width:136px;">352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">50 mL polypropylene conical tubes</td>
			<td style="width:212px;">Falcon</td>
			<td style="width:136px;">352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">2.0 mL cryogenic vials, externally threaded</td>
			<td style="width:212px;">Corning Inc. / Fisher</td>
			<td style="width:136px;">4230659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">1 mL pipette tips</td>
			<td style="width:212px;">Fisher</td>
			<td style="width:136px;">2707509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">200 &#956;L pipette tips&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:136px;">P3020-CPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">10 &#956;L pipette tips</td>
			<td style="width:212px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:136px;">P-1096-CP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Sterile Disposable Filter Units with SFCA Membrane, Nalgene Rapid-Flow</td>
			<td style="width:212px;">Fisher</td>
			<td style="width:136px;">09-740-28D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:665px;">2N H2SO4&#160;</td>
			<td style="width:212px;">BioLegend</td>
			<td style="width:136px;">423001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (PBS) without calicium and magnesium, 1&#215;</td>
			<td style="width:212px;">Corning cellgro/ Mediatech</td>
			<td style="width:136px;">21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Human TSLP ELISA Max Deluxe Set</td>
			<td style="width:212px;">BioLegend</td>
			<td style="width:136px;">434204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">3% Acetic Acid with Methylene Blue</td>
			<td style="width:212px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:136px;">7060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Trypan Blue&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Corning</td>
			<td style="width:136px;">25-900-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">&#34;Trypsin&#34; 1x 0.25% Trypsin 2.21 mM EDTA in HBSS</td>
			<td style="width:212px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:136px;">25-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">TWEEN 20 BioXtra</td>
			<td style="width:212px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">P-7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">&#8220;R10&#8221; cell culture medium, % of total volume (makes 565 mL)</td>
			<td style="width:212px;">-</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td style="width:88px;">Lab Recipe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">RPMI, 88.5% (500 mL)&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Mediatech</td>
			<td style="width:136px;">10-040-CV&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">FBS, 9.9% (56 mL)&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Mediatech</td>
			<td style="width:136px;">35-011-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">L-Glutamine, 0.99% (5.6 mL)&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Mediatech</td>
			<td style="width:136px;">25-005-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Penicillin-Streptomycin, 0.50% (2.8 mL)&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Mediatech</td>
			<td style="width:136px;">30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">2-Mercaptoethanol, 0.10% (560 &#181;L)&#160;</td>
			<td style="width:212px;">MP</td>
			<td style="width:136px;">190242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">&#8220;R20&#8221; cell culture medium, % of total volume (makes 195 mL)</td>
			<td style="width:212px;">-</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td style="width:88px;">Lab Recipe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">&#160;&#160;&#160;&#160; RPMI, 76.84% (150&#160; mL)</td>
			<td style="width:212px;">see above</td>
			<td style="width:136px;">see above</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">&#160;&#160;&#160;&#160; FBS, 20.49% (40 mL)</td>
			<td style="width:212px;">see above</td>
			<td style="width:136px;">see above</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">&#160;&#160;&#160;&#160; 2mM L-glutamine, 1.02% (2 mL)</td>
			<td style="width:212px;">see above</td>
			<td style="width:136px;">see above</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">&#160;&#160;&#160;&#160; 1mM Na pyruvate, 1.02% (2 mL )</td>
			<td style="width:212px;">see above</td>
			<td style="width:136px;">see above</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">&#160;&#160;&#160;&#160; Penicillin-Streptomycin,&#160; 0.51% (1 mL)</td>
			<td style="width:212px;">see above</td>
			<td style="width:136px;">see above</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">&#160;&#160;&#160;&#160; 2-Mercaptoethanol, 0.10% (0.1 M),&#160; 0.10% (200 &#181;L)</td>
			<td style="width:212px;">see above</td>
			<td style="width:136px;">see above</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">&#8220;Freezing medium&#8221;, % of total volume</td>
			<td style="width:212px;">-</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td style="width:88px;">Lab Recipe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">&#8220;R10&#8221; medium, 45%</td>
			<td style="width:212px;">see &#34;R10&#34; recipe</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">FBS, 20%</td>
			<td style="width:212px;">see above</td>
			<td style="width:136px;">35-011-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">DMSO, 10%</td>
			<td style="width:212px;">Corning</td>
			<td style="width:136px;">25-950-CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:665px;">D(-)(+)-Trehalose dihydrate, 5%</td>
			<td style="width:212px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">BP2687-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Name</td>
			<td style="width:212px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catolog Number</td>
			<td style="width:88px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Biologics&#160;</td>
			<td style="width:212px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">&#34;HS-27&#34; HS-27A human stroma line</td>
			<td style="width:212px;">ATCC</td>
			<td>CRL-2496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">&#34;CALL-4&#34; MHH-CALL-4 cell line, human B cell precursor leukemia</td>
			<td style="width:212px;">DSMZ</td>
			<td style="width:136px;">ACC 337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:665px;">&#8220;NSG mice&#8221; NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, male or female, age 6 &#8211; 8 weeks</td>
			<td style="width:212px;">JAX Mice&#160;</td>
			<td style="width:136px;"># 005557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">MUTZ-5 cell line, human B cell precursor leukemia</td>
			<td style="width:212px;">DSMZ</td>
			<td style="width:136px;">ACC 490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:665px;">Recombinant Human TSLP protein</td>
			<td style="width:212px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:136px;">1398-TS-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Name</td>
			<td style="width:212px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catolog Number</td>
			<td style="width:88px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Flow cytomery antibodies (clone)*</td>
			<td style="width:212px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Anti-mouse CD45 FITC (30F11)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-102-778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">CD127 PE (MB15-18C9) (alternate name is IL-7R&#945;)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">CD34 APC (8G12)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">CD45 PE-Cy7&#160; (HI30)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#34;FVD&#34; Fixable viability dye&#160; eFluor 780&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>65-0865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Ig &#954; light chain FITC&#160; (G20-193)</td>
			<td style="width:212px;">BD Pharmingen</td>
			<td>555791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Ig &#955; light chain FITC (JDC-12)</td>
			<td style="width:212px;">BD Pharmingen</td>
			<td>561379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">IgD PE (IA6-2)</td>
			<td style="width:212px;">BioLegend</td>
			<td>348203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">IgM PE-Cy5 (G20-127)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:665px;">pSTAT5 PE,&#160; mouse anti-STAT5 (pY694)</td>
			<td style="width:212px;">BD PhosphoFlow</td>
			<td>612567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Name</td>
			<td style="width:212px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catolog Number</td>
			<td style="width:88px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Other materials &#38; equipment&#160;</td>
			<td style="width:212px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Animal Implantable Nano Transponder with Canula</td>
			<td style="width:212px;">Trovan&#160;</td>
			<td style="width:136px;">ID-100B(1.25)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EMLA lidocaine anesthetic cream (obtain by presciption through animal care facility)</td>
			<td style="width:212px;">perscription</td>
			<td style="width:136px;">perscription</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD &#189; cc LO-DOSE U-100 Insulin Syringe 28G&#189;&#160;</td>
			<td style="width:212px;">BD</td>
			<td style="width:136px;">#329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:665px;">BD Microtainer Tubes with K2EDTA</td>
			<td style="width:212px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:136px;">#365974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:136px;">Alegra X-15R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FisherBrand Capillary Tubes (Heparinized)</td>
			<td style="width:212px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">22-260-950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:212px;">Fisher</td>
			<td style="width:136px;">02-671-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">MACSQuant Analyzer 10</td>
			<td style="width:212px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:136px;">130-096-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Mouse Pie Cage</td>
			<td style="width:212px;">Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:136px;">MPC-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Mouse Tail Illuminator Restrainer</td>
			<td style="width:212px;">Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:136px;">MTI STD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">Pistol Grip Implanter</td>
			<td style="width:212px;">Trovan&#160;</td>
			<td style="width:136px;">IM-300(1.25)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">&#181;Quant&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Bio-Tek Instruments Inc.</td>
			<td style="width:136px;">MQX200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:665px;">FlowJo flow cytometry analysis software</td>
			<td>FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:136px;">Version 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">*All antibodies are anti-human unless otherwise stated.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of exogenous cytokine in patient-derived xenografts via injection with a cytokine-transduced stromal cell line

Patient-härledda xenograftmus (PDX) produceras genom transplantation av humana celler till immundeficenta möss. Dessa modeller är ett viktigt verktyg för att studera mekanismerna för normal och malign hematopoiesis och är guldstandarden för att identifiera effektiva kemoterapier för många maligniteter. PDX-modeller är möjliga eftersom många av cytokinerna hos mus också verkar på mänskliga celler. Detta är emellertid inte fallet för alla cytokiner, inklusive många som är kritiska för att studera normal och malign hematopoiesis i humana celler. Tekniker som konstruerar möss för att producera humana cytokiner (transgena och inslagsmodeller) kräver betydande kostnader innan användbarheten av modellen har visats. Andra tekniker är arbetsintensiva (injektion av rekombinant cytokin eller lentivirus) och i vissa fall kräver hög teknisk expertis (hydrodynamisk injektion av DNA). Denna rapport beskriver en enkel metod för att generera PDX-möss som har exogen human cyTokin (TSLP, tymisk stromal lymfopoietin) via en vecka intraperitoneal injektion av stroma som har transducerats för att överuttrycka denna cytokin. Användning av denna metod ger en in vivo källa till kontinuerlig cytokinproduktion som uppnår fysiologiska nivåer av cirkulerande humant cytokin i musen. Plasmanivåerna av humant cytokin kan varieras baserat på antalet injicerade stromalceller, och cytokinproduktionen kan initieras vid vilken som helst punkt i experimentet. Denna metod innefattar även cytokin-negativa kontrollmöss som framställs på liknande sätt, men genom intraperitoneal injektion av stroma transducerad med en kontrollvektor. Vi har tidigare visat att leukemi-celler skördade från TSLP-uttryckande PDX, jämfört med kontroll PDX, uppvisar ett genuttrycksmönster mer som det ursprungliga patientprovet. Tillsammans tillhandahåller de cytokinproducerande och cytokin-negativa PDX-mössen som produceras med denna metod ett modellsystem som vi har använt framgångsrikt för att studeraTSLP: s roll i normal och malign hematopoiesis.

En översikt över modellen visas i Figur 1 . När en cytokinproducerande (TSLP + stroma) och kontrollstrom har erhållits expanderas de i kultur. Före stroma-injektion i möss utvärderas stromalcellsupernatanten med ELISA för att verifiera cytokinproduktion ( Figur 2 ) och fosfosflödescytometri (Protokoll nr 3) används för att verifiera aktiviteten hos cytokinet som produceras av stroma. Supernatanten uppsamlas från sammanflytande stromalcellkult...

Watch this Scientific Journal Video about Expression of Exogenous Cytokine in Patient-derived Xenografts via Injection with a Cytokine-transduced Stromal Cell Line at JoVE.com

Expression of Exogenous Cytokine in Patient-derived Xenografts via Injection with a Cytokine-transduced Stromal Cell Line

Beskriven här är en metod för att producera exogent cytokin i patient-härledda xenograftmus (PDX) via veckovis intraperitoneal injektion av en cytokin-transducerad stromalcellinje. Denna metod breddar nyttan av PDX och ger möjlighet till övergående eller långvarig exogen cytokinleverans i en mängd PDX-modeller.

Uttryck av exogen cytokin i patient-härledda xenotransplantat via injektion med en cytokin-transducerad ströcellinje

Patient-derived xenograft (PDX) mice are produced by transplanting human cells into immune deficient mice. These models are an important tool for studying ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Experimentell generationens Cancer Associated-fibroblasts (CAFS) från Human bröst fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture och isolering av CD133<sup&gt; +</sup&gt; Förmodade Cancer stamceller från melanom

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Collecting Saliva and Measuring Salivary Cortisol and Alpha-amylase in Frail Community Residing Older Adults via Family Caregivers

Salivary measures have emerged in bio-behavioral research  that are easy-to-collect, minimally invasive, and relatively inexpensive  biologic markers of ...

Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts

Minimalinvasiva Etablering av murina Orthotopic Bladder implanterad

Orthotopic bladder cancer xenografts are the gold standard to study molecular cellular manipulations and new therapeutic agents&#160;in vivo. Suitable ...

Ultrasound-guided Transthoracic Intramyocardial Injection in Mice

Ultrasound-guidad transtorakal Intramyocardial Injection hos möss

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. ...

Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography

Bedömning av livskraft Human Fat Injektion i nakna möss med Micro-datortomografi

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

Isolering och Immortalisering av patientgenererade cellinjer från muskelbiopsi for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Generation av prostatacancer Patient Härstammar xenograft-modeller från cirkulerande tumörceller

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Utarmning av musceller från humana tumörxenotransplantat avsevärt förbättrar Nedströms analys av målceller

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Full-root Aortic Valve Replacement by Stentless Aortic Xenografts in Patients with Small Aortic Roots

Full-rot Aortic Valve Replacement av stentless Aortic Xenografts hos patienter med små Aortic rötter

In patients with small aortic roots who need an aortic valve replacement with biological valve substitutes, the implantation of the stented pericardial ...