Name: prolonged incubation of acute neuronal tissue for electrophysiology and calcium-imaging
Uploaded: 2017-02-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging at JoVE.com

We thank Colin Symons and James Wright for technical assistance. This work was supported by seed funding grant (WSU) to Y.B. and the innovation office at Western Sydney University. M.C. is supported by ARC fellowship (DECRA).

Le protocole suivant décrit la préparation de C57BL / 6 et C3H / He (retinally dégénéré) un tissu neuronal de la souris, mais des techniques similaires peuvent être appliquées à d&#39;autres espèces. Tous les animaux étaient en bonne santé et manipulé avec les conditions normales de température, d&#39;humidité, 12 h cycle lumière / obscurité, l&#39;accès libre à la nourriture et de l&#39;eau, et sans stimuli de stress destinés. Toutes les expériences ont été approuvées et effectuées en conformité avec comité de l&...

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	<li>Colbert, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cortical+brain+slices+for+electrophysiological+recording.">Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording.</a> Meth mol biol. 337, 117-125 (2006).</li><li>Gibb, A., Edwards, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+recording+from+cells+in+sliced+tissues.">Patch clamp recording from cells in sliced tissues.</a> Microelect Techniq. , 255-274 (1994).</li><li>Kantevari, S., Buskila, Y., Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+cell-permeant+6-nitrodibenzofuranyl-caged+IP3.">Synthesis and characterization of cell-permeant 6-nitrodibenzofuranyl-caged IP3.</a> Photochem photobiol sci. 11 (3), 508-513 (2012).</li><li>Blankenship, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+and+Extrasynaptic+Factors+Governing+Glutamatergic+Retinal+Waves.">Synaptic and Extrasynaptic Factors Governing Glutamatergic Retinal Waves.</a> Neuron. 62 (2), 230-241 (2009).</li><li>Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Perez De Sevilla Muller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+and+Calcium+Imaging+Methods+in+Wholemount+Rat+Retina.">Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina.</a> J Vis Exp. (92), e51396 (2014).</li><li>Kulkarni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Ca2++dynamics+in+cone+photoreceptor+axon+terminals+of+the+mouse+retina.">Imaging Ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina.</a> J Vis Exp. (99), e52588 (2015).</li><li>Velte, T. J., Masland, R. 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L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM.">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J Vis Exp. (23), e3-e5 (2009).</li><li>Buskila, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Astrocytic+Nitric+Oxide+Production+and+Neuronal+Modifications+in+the+Neocortex+of+a+NOS2+Mutant+Mouse.">Enhanced Astrocytic Nitric Oxide Production and Neuronal Modifications in the Neocortex of a NOS2 Mutant Mouse.</a> PLoS ONE. 2 (9), 9 (2007).</li><li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).</li></ol>

Cet article décrit une méthode d&#39;incubation pour prolonger la viabilité du tissu neuronal aigu pour les expériences d&#39;imagerie et électrophysiologiques, réduisant ainsi le nombre d&#39;animaux nécessaires à la réalisation des objectifs expérimentaux. Deux processus principaux régissent la détérioration du tissu neuronal au fil du temps: i) l&#39; augmentation des niveaux de bactéries, et l&#39;augmentation d&#39; accompagnement dans l&#39; endotoxine bactérienne libérée, et ii) excitotoxicité q...

Électrophysiologie et d&#39;imagerie fonctionnelle (calcium, tension colorants sensibles) sont deux des techniques expérimentales les plus couramment utilisés dans les neurosciences. Casse des préparations de tranche et wholemount rétinienne, qui sera examiné ici, fournissent un moyen d&#39;examiner les propriétés électrophysiologiques et la connectivité synaptique sans contamination par des anesthésiques ou des relaxants musculaires. Des tranches de cerveau et de la rétine wholemount conservent leur intégrité structurelle, à la différence des cultures ou des homogénats cellulaires, permettant l&#39;étude des circuits spécifiques et des réseaux cérébraux 1. Les enregistrements de tissu isolé présentent des avantages par rapport aux enregistrements in vivo que les mouvements associés au rythme cardiaque et la respiration sont éliminés. De plus, la visualisation directe permet à des classes spécifiques de cellules à cibler, et l&#39; application locale d&#39;outils pharmacologiques 2, 3. enregistrements de patch-clamp et calcium colorant chargement dans wholemount rétinienne est compliquée par l&#39;existence de l&#39;Inner Limitation de la membrane (ILM), qui couvre la couche rétinienne Ganglion cellulaire (RGC) et empêche l&#39;accès direct aux cellules. Typiquement, cette membrane est gratté avec une pipette en verre pour permettre une application directe d&#39;une pipette de patch et la formation d&#39;un joint d&#39;étanchéité gigaohm sur une seule cellule. En outre, les colorants de calcium bain appliquée ne traversent pas la ILM et doivent soit être injectés sous cette membrane 4, rétrogressivement transporté après l&#39; injection au niveau du nerf optique 5 ou électroporation à travers le tissu 6. En outre, lorsqu&#39;on utilise un modèle de rongeur de la rétinite pigmentaire, le rd / rd souris, la MLI est plus épaisse et plus impénétrable. Ici, nous utilisons une technique pour éliminer l&#39;ILM à la digestion enzymatique 7, pour permettre à la fois du calcium omniprésent colorant chargement, et un accès direct à des cellules ganglionnaires de la rétine pour patch-clamp recordings 8. enregistrements réussis provenant soit des tranches de cerveau ou wholemount rétinienne dépendent de la dissection et l&#39;incubation du tissu neuronal viable. Typiquement, le tissu est extrait le matin de l&#39;expérience et mis en incubation dans le liquide céphalorachidien artificiel (aCSF) jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit utilisé pour l&#39;enregistrement. En général, le tissu reste viable pour les 6 - 8 h, à une dégradation importante qui suit cette fenêtre temporelle. Cependant, les deux tranches de cerveau et les préparations de rétines wholemount produisent habituellement plus de tissu que peuvent être enregistrées à partir de cette courte période de temps. Par conséquent, le tissu est souvent mis au rebut à la fin de la journée et de la dissection est achevée à nouveau les jours suivants. Cela signifie un autre animal est utilisé et ~ 2 h de la configuration et la dissection / coloration répétée. Le protocole suivant décrit une méthode pour prolonger la vie de tissu neuronal pendant plus de 24 h, ce qui signifie moins d&#39;animaux sont utilisés, et le temps plus expérimental est disponible. Tissue viabilité wcomme évalué par l&#39;enregistrement des propriétés électrophysiologiques et la dynamique de calcium, et ces propriétés ne se distinguaient pas entre &lt;4 h et&gt; 24 h postdissection. Ces résultats indiquent que non seulement les propriétés des cellules individuelles intactes et fonctionnelles après une incubation prolongée, mais l&#39;activité du réseau, tel qu&#39;évalué par imagerie du calcium et des enregistrements électrophysiologiques, est inchangé&gt; 24 h postdissection. En outre, nous montrons que les colorants de calcium dans les cellules peuvent rester pendant des périodes prolongées sans provoquer d&#39;effets secondaires nuisibles. L&#39;application de ce protocole démontre que l&#39;activité fonctionnelle des neurones dans le tissu neuronal aiguë peut être maintenue pendant de longues périodes, une fois que l&#39;environnement extérieur est très réglementé. En outre, comme la viabilité des tissus varie grandement entre les laboratoires en raison de protocoles d&#39;incubation différents, cette méthode établit une norme d&#39;or pour les paramètres idéaux qui devraient être appliqués pour réduire la variabilité de la santé de neu aiguëtissus ronal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="831">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich VETEC</td>
			<td style="width:135px;">V800372</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">P9333</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">N-Methyl-D-glucamine</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">M2004&#160;</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">D-glucose</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">G5767</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">S6014</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">S2554</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:315px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">M9272&#160;</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:315px;">Calcium chloride&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">223506</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Papain Dissociation System</td>
			<td style="width:159px;">Worthington&#160;</td>
			<td style="width:135px;">LK003150</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Dimethyl sulfoxide anhydrous</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">276855</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:315px;">Pluronic F-127 Low UV absorbance*</td>
			<td style="width:159px;">Life technologies</td>
			<td style="width:135px;">P-6867</td>
			<td style="width:225px;">20% solution in DMSO&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:315px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Fura-2 AM&#160;&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Anaspec</td>
			<td style="width:135px;">84017</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Fluo-4 AM&#160;&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">F23917</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Fluo-8 AM</td>
			<td style="width:159px;">Abcam</td>
			<td style="width:135px;">Ab142773</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:315px;">Vibrating blade microtome&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Leica Biosystem</td>
			<td style="width:135px;">VT1200 S</td>
			<td style="width:225px;">Equiped with Leica&#8217;s Vibrocheck&#8482; measurement device&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Antivibration table</td>
			<td style="width:159px;">Kinetic Systems Vibraplane&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Vibraplane 9100/9200&#160;</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Fixed Stage Upright Microscope</td>
			<td style="width:159px;">Olympus</td>
			<td style="width:135px;">BX51WI&#160;</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Microscope Objective</td>
			<td style="width:159px;">Olympus</td>
			<td style="width:135px;">XLUMPlanFLN 20x/1.00w</td>
			<td style="width:225px;">20X&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Microscope Objective</td>
			<td style="width:159px;">Olympus</td>
			<td style="width:135px;">LUMPlanFLN 60x/1.00w</td>
			<td style="width:225px;">60X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">CCD Camera</td>
			<td style="width:159px;">Andor</td>
			<td style="width:135px;">Ixon +</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">High speed wavelength switcher</td>
			<td style="width:159px;">Sutter instrument</td>
			<td style="width:135px;">Lambda DG-4&#160;</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Patch clamp amplifier</td>
			<td style="width:159px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:135px;">MultiClamp 700B</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Data acquisition system</td>
			<td style="width:159px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:135px;">Digidata 1440A</td>
			<td style="width:225px;">Axon Digidata&#174; System</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:159px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:135px;">BF150-86-10</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Microelectrode puller</td>
			<td style="width:159px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:135px;">P-97</td>
			<td style="width:225px;">Flaming/Brown type micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Recording/perfusion chamber</td>
			<td style="width:159px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:135px;">RC-40LP</td>
			<td style="width:225px;">Low Profile Open Bath Chambers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Software</td>
			<td style="width:159px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:135px;">pClamp 10.2</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Andor iQ Live Cell Imaging Software</td>
			<td style="width:159px;">Andor</td>
			<td style="width:135px;">Andor iQ3</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Braincubator</td>
			<td style="width:159px;">Payo Scientific</td>
			<td style="width:135px;">BR26021976</td>
			<td style="width:225px;">www.braincubator.com.au</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>CP-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Temperature Controller</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>TC-36-25 RS232</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

prolonged incubation of acute neuronal tissue for electrophysiology and calcium-imaging

Aiguë des préparations de tissus neuronaux, des tranches de cerveau et wholemount rétinienne, ne peuvent généralement être conservés pendant 6-8 heures après dissection. Cela limite la durée de l&#39;essai, et augmente le nombre d&#39;animaux qui sont utilisés pour l&#39;étude. Cette limitation spécifiquement les impacts des protocoles tels que l&#39;imagerie calcique qui nécessitent une pré-incubation prolongée avec des colorants de bain appliqués. la croissance bactérienne exponentielle dans les 3 - 4 h après le découpage en tranches est étroitement corrélée avec une diminution de la santé des tissus. Cette étude décrit un procédé pour limiter la prolifération des bactéries dans les préparations aiguës pour maintenir le tissu neuronal viables pendant des périodes de temps prolongées (&gt; 24 h) sans avoir recours à des antibiotiques, des procédures stériles ou milieux de culture tissulaire contenant des facteurs de croissance. Par un cycle du fluide extracellulaire par irradiation UV et de maintenir le tissu dans une chambre de maintien de la commande à 15 - 16 ° C, le tissu ne montre aucune différence dans les propriétés électrophysiologiques, ou si de calciumgnaling par des colorants de calcium intracellulaire à&gt; 24 h postdissection. Ces méthodes ne seront pas seulement prolonger le temps expérimental pour ceux qui utilisent le tissu neuronal aigu, mais permettra de réduire le nombre d&#39;animaux nécessaires à la réalisation des objectifs expérimentaux, et établira une norme d&#39;or pour l&#39;incubation de tissu neuronal aiguë.

une régulation stricte de la charge bactérienne et la température du LCRa pendant l&#39;incubation est essentiel pour maintenir la viabilité des tissus neuronaux. Ceci peut être optimisée par l&#39; irradiation avec de la lumière UV - C et en maintenant la température du LCRa à 15 - 16 ° C (figure 1). En outre, le LCRa paramètres timbre (APS; Figure 1C) fournit l&#39;expérimentateur avec un enregistrement des conditions environnementales (pH ...

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Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Une fois sorti du corps, le tissu neuronal est fortement influencée par les conditions environnementales, ce qui conduit à une dégradation éventuelle du tissu après 6 à 8 heures. En utilisant une méthode d&#39;incubation unique, qui surveille de près et régule l&#39;environnement extracellulaire du tissu, la viabilité des tissus peut être considérablement prolongée pour&gt; 24 h.

L&#39;incubation prolongée de aiguë Neuronal tissus pour électrophysiologie et Calcium-imagerie

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Research

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Neuroscience

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Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

In vivo Imagerie calcique d’ensembles neuronaux dans des réseaux de neurones sensoriels primaires dans des ganglions radiculaires dorsaux intacts

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...