Name: prolonged incubation of acute neuronal tissue for electrophysiology and calcium-imaging
Uploaded: 2017-02-15T15:00:00
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We thank Colin Symons and James Wright for technical assistance. This work was supported by seed funding grant (WSU) to Y.B. and the innovation office at Western Sydney University. M.C. is supported by ARC fellowship (DECRA).

Das Protokoll unten beschreibt die Herstellung von C57BL / 6 und C3H / He (retinally degeneriert) Maus neuronalem Gewebe, aber ähnliche Techniken können auf andere Arten angewendet werden. Alle Tiere gesund und Umgang mit Standardbedingungen von Temperatur, Feuchtigkeit, 12 h Hell / Dunkel-Zyklus, den freien Zugang zu Futter und Wasser waren, und ohne beabsichtigte Stressreize. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den westlichen Sydney University Animal Care und Ethikkommission und nach der Nutzung von Tieren und Pflegerichtlin...

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	<li>Colbert, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cortical+brain+slices+for+electrophysiological+recording.">Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording.</a> Meth mol biol. 337, 117-125 (2006).</li><li>Gibb, A., Edwards, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+recording+from+cells+in+sliced+tissues.">Patch clamp recording from cells in sliced tissues.</a> Microelect Techniq. , 255-274 (1994).</li><li>Kantevari, S., Buskila, Y., Ellis-Davies, G. C. 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L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM.">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J Vis Exp. (23), e3-e5 (2009).</li><li>Buskila, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Astrocytic+Nitric+Oxide+Production+and+Neuronal+Modifications+in+the+Neocortex+of+a+NOS2+Mutant+Mouse.">Enhanced Astrocytic Nitric Oxide Production and Neuronal Modifications in the Neocortex of a NOS2 Mutant Mouse.</a> PLoS ONE. 2 (9), 9 (2007).</li><li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).</li></ol>

Dieser Artikel beschreibt eine Inkubation Methode, um die Lebensfähigkeit von akuten neuronalen Gewebe für die Bildgebung und elektrophysiologischen Experimenten zu verlängern, wodurch die Anzahl der Tiere zu reduzieren erforderlich, um experimentelle Ziele abzuschließen. Zwei Hauptprozesse regeln die Verschlechterung der neuronalen Gewebe im Laufe der Zeit: i) erhöhte Keimbelastung und die damit einhergehende Erhöhung der bakterielles Endotoxin freigesetzt, und ii) Exzitotoxizität , die das traumatische Slicing ...

Elektrophysiologie und funktionelle Bildgebung (Calcium, spannungsempfindliche Farbstoffe) sind zwei der am häufigsten verwendeten experimentellen Techniken in den Neurowissenschaften. Hirnschnittpräparaten und retinale Wholemount, die hier untersucht werden, ein Mittel zur Prüfung der elektrophysiologischen Eigenschaften und synaptischer Verbindungen ohne Kontamination von Anästhetika oder Muskelrelaxantien. Hirnschnitte und Retina - Wholemount ihre strukturelle Integrität aufrechtzuerhalten, im Gegensatz zu Kulturen oder Zellhomogenisate, so dass die Untersuchung spezifischer Schaltungen und Gehirn Netzwerke 1. Aufnahmen von isolierten Gewebe haben Vorteile gegenüber in vivo Aufnahmen als Bewegungen mit dem Herzschlag und Atmung verbunden sind eliminiert. Darüber hinaus ermöglicht die direkte Visualisierung bestimmte Klassen von Zellen 2, 3 gezielte und lokale Anwendung von pharmakologischen Werkzeugen werden. Patch-Clamp-Aufnahmen und Calcium Farbstoffbeladung in retinalen Wholemount wird durch die Existenz der inneren Grenzmembran (ILM), die deckt die retinalen Ganglienzellen (RGC) Schicht kompliziert und direkten Zugang zu den Zellen verhindert. Typischerweise wird diese Membran mit einer Glaspipette abgeschabt direkte Anwendung eines Patch-Pipette und die Bildung eines Gigaohm Dichtung an einer einzigen Zelle zu ermöglichen. Darüber hinaus Bade angewendet Kalzium Farbstoffe nicht kreuzen die ILM und müssen entweder unter dieser Membran 4, retrograden Transport nach der Injektion an den Sehnerv 5 oder durch Elektroporation durch das Gewebe 6 injiziert werden. Wenn darüber hinaus ein Nagetiermodell von Retinitis pigmentosa verwendet wird , die rd / rd Maus, ist die ILM dicker und undurchdringlich. Hier verwenden wir eine Technik , um die ILM mit enzymatischen Aufschluss 7 zu entfernen , sowohl allgegenwärtige Calcium - Farbstoff-Beladung und den direkten Zugang zu retinalen Ganglionzellen für Patch-Clamp - recordi zu ermöglichenNGS 8. Erfolgreiche Aufnahmen von beiden Hirnschnitten oder retinalen Wholemount hängen von Präparation und Inkubation von lebenden Nervengewebe. Typischerweise wird Gewebe am Morgen des Experiments entnommen und in künstlichen Cerebrospinalflüssigkeit (aCSF) inkubiert, bis sie für die Aufnahmen verwendet wird. Normalerweise bleibt Gewebe lebensfähig für 6 - 8 h, mit signifikanten Abbau nach diesem Zeitfenster. beide Gehirnscheiben und Präparate jedoch in der Regel Wholemount retinae produzieren mehr Gewebe als kann innerhalb dieser kurzen Zeitspanne aufgezeichnet werden. Folglich wird Gewebe oft am Ende des Tages verworfen und die Präparation wird wieder an den nachfolgenden Tagen abgeschlossen. Das bedeutet, ein anderes Tier wird verwendet, und ~ 2 h Setup und Dissektion / Färbung wiederholt. Das folgende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Verlängerung der Lebensdauer von neuronalem Gewebe für mehr als 24 h, was bedeutet weniger Tiere verwendet werden, und Versuchszeit zur Verfügung steht. Gewebeviabilität wwie beurteilt durch elektrophysiologischen Eigenschaften der Aufnahme und Kalziumdynamik, und diese Eigenschaften waren nicht zu unterscheiden zwischen &lt;4 h und&gt; 24 h postdissection. Diese Ergebnisse zeigen, dass nicht nur einzelne Zelleigenschaften intakt und funktionsfähig nach längerer Inkubation, aber Netzwerk-Aktivität, wie durch Calcium-Bildgebung und elektrophysiologischen Ableitungen beurteilt, ist unverändert&gt; 24 h postdissection. Darüber hinaus zeigen wir, dass Calcium Farbstoffe in Zellen über einen längeren Zeitraum, ohne dass irgendwelche nachteiligen Effekte bleiben kann. Anwendung dieses Protokolls veranschaulicht, dass die funktionelle Aktivität von Neuronen in akuten neuronalen Gewebe können für lange Zeiträume aufrechterhalten werden, sobald die äußere Umgebung stark reguliert ist. Außerdem ist, wie die Lebensfähigkeit des Gewebes aufgrund unterschiedlicher Inkubationsprotokolle stark zwischen den Labors variiert, stellt dieses Verfahren einen Goldstandard für die idealen Parameter, die Variabilität in der Gesundheit der akuten neu zu reduzieren angewendet werden sollteronal Gewebe.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="831">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich VETEC</td>
			<td style="width:135px;">V800372</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">P9333</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">N-Methyl-D-glucamine</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">M2004&#160;</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">D-glucose</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">G5767</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">S6014</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">S2554</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:315px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">M9272&#160;</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:315px;">Calcium chloride&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">223506</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Papain Dissociation System</td>
			<td style="width:159px;">Worthington&#160;</td>
			<td style="width:135px;">LK003150</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Dimethyl sulfoxide anhydrous</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">276855</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:315px;">Pluronic F-127 Low UV absorbance*</td>
			<td style="width:159px;">Life technologies</td>
			<td style="width:135px;">P-6867</td>
			<td style="width:225px;">20% solution in DMSO&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:315px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Fura-2 AM&#160;&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Anaspec</td>
			<td style="width:135px;">84017</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Fluo-4 AM&#160;&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">F23917</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Fluo-8 AM</td>
			<td style="width:159px;">Abcam</td>
			<td style="width:135px;">Ab142773</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:315px;">Vibrating blade microtome&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Leica Biosystem</td>
			<td style="width:135px;">VT1200 S</td>
			<td style="width:225px;">Equiped with Leica&#8217;s Vibrocheck&#8482; measurement device&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Antivibration table</td>
			<td style="width:159px;">Kinetic Systems Vibraplane&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Vibraplane 9100/9200&#160;</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Fixed Stage Upright Microscope</td>
			<td style="width:159px;">Olympus</td>
			<td style="width:135px;">BX51WI&#160;</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Microscope Objective</td>
			<td style="width:159px;">Olympus</td>
			<td style="width:135px;">XLUMPlanFLN 20x/1.00w</td>
			<td style="width:225px;">20X&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Microscope Objective</td>
			<td style="width:159px;">Olympus</td>
			<td style="width:135px;">LUMPlanFLN 60x/1.00w</td>
			<td style="width:225px;">60X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">CCD Camera</td>
			<td style="width:159px;">Andor</td>
			<td style="width:135px;">Ixon +</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">High speed wavelength switcher</td>
			<td style="width:159px;">Sutter instrument</td>
			<td style="width:135px;">Lambda DG-4&#160;</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Patch clamp amplifier</td>
			<td style="width:159px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:135px;">MultiClamp 700B</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Data acquisition system</td>
			<td style="width:159px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:135px;">Digidata 1440A</td>
			<td style="width:225px;">Axon Digidata&#174; System</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:159px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:135px;">BF150-86-10</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Microelectrode puller</td>
			<td style="width:159px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:135px;">P-97</td>
			<td style="width:225px;">Flaming/Brown type micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Recording/perfusion chamber</td>
			<td style="width:159px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:135px;">RC-40LP</td>
			<td style="width:225px;">Low Profile Open Bath Chambers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Software</td>
			<td style="width:159px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:135px;">pClamp 10.2</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Andor iQ Live Cell Imaging Software</td>
			<td style="width:159px;">Andor</td>
			<td style="width:135px;">Andor iQ3</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Braincubator</td>
			<td style="width:159px;">Payo Scientific</td>
			<td style="width:135px;">BR26021976</td>
			<td style="width:225px;">www.braincubator.com.au</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>CP-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Temperature Controller</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>TC-36-25 RS232</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

prolonged incubation of acute neuronal tissue for electrophysiology and calcium-imaging

8 Stunden nach der Präparation - neuronaler Gewebepräparate Akut, Hirnschnitten und Retina-Wholemount, können in der Regel nur für 6 gehalten werden. Dies begrenzt die Versuchszeit und erhöht die Anzahl der Tiere, die pro Studie verwendet werden. Diese Einschränkung speziell Auswirkungen Protokolle wie Kalzium-Imaging, die verlängerte Vorinkubation erfordern mit Bad aufgetragen Farbstoffe. Exponential Bakterienwachstum in 3 - 4 h nach dem Schneiden ist eng mit einer Abnahme der Gewebegesundheit korreliert. Diese Studie beschreibt ein Verfahren für die Vermehrung von Bakterien in acute Zubereitungen Begrenzung für längere Zeiträume (&gt; 24 h) ohne die Notwendigkeit von Antibiotika, sterile Verfahren oder Gewebekulturmedien, enthaltend Wachstumsfaktoren tragfähige neuronalem Gewebe zu halten. Durch Radfahren Kammer die extrazelluläre Flüssigkeit durch UV-Bestrahlung und halten das Gewebe in einem benutzerdefinierten Halte bei 15 - 16 ° C, zeigt das Gewebe keinen Unterschied in der elektrophysiologischen Eigenschaften, oder Calcium-signaling durch intrazelluläres Calcium Farbstoffe bei&gt; 24 h postdissection. Diese Methoden werden nicht nur verlängern experimentelle Zeit für diejenigen, mit akuten neuronalen Gewebe, sondern die Zahl der Tiere zu reduzieren erforderlich, um experimentelle Ziele abzuschließen, und wird eine Goldstandard für die akute neuronale Gewebe Inkubation gesetzt.

Strenge Regulierung der Bakterienlast und der Temperatur der aCSF während der Inkubation ist wesentlich neuronalem Gewebe Lebensfähigkeit zu erhalten. 16 ° C (Abbildung 1) - dies kann mit UVC - Licht und Aufrechterhalten der Temperatur des aCSF bei 15 durch Bestrahlung optimiert werden. Des Weiteren Parameter der aCSF Stempel (APS; 1C) stellt die Experimentator mit einem Rekord von den Umgebungsbedingungen (pH - Wert und Temperatur.), So dass ein Gold...

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Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Sobald aus dem Körper entfernt wird neuronalem Gewebe stark durch Umweltbedingungen beeinflusst, den späteren Abbau des Gewebes führt nach 6 - 8 h. Unter Verwendung einer einzigartigen Inkubationsverfahren, die eng überwacht und reguliert die extrazelluläre Umgebung des Gewebes kann Gewebeviabilität deutlich&gt; 24 h ausgedehnt werden.

Längerer Inkubation von Akute neuronales Gewebe für Elektrophysiologie und Calcium-Bildgebung

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

Kryokonservierung von kortikalen Gewebes Bausteine ​​für die Generierung von hoch angereichertem neuronalen Kulturen

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Forschung

Neurowissenschaften

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Vorbereitung der akuten Subventrikulärzone Slices für Calcium Imaging

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Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

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In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

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Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

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To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

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Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

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Im lebenden Organismus Calcium-Bildgebung neuronaler Ensembles in Netzwerken primärer sensorischer Neurone in intakten dorsalen Wurzelganglien

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