Name: prolonged incubation of acute neuronal tissue for electrophysiology and calcium-imaging
Uploaded: 2017-02-15T15:00:00
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We thank Colin Symons and James Wright for technical assistance. This work was supported by seed funding grant (WSU) to Y.B. and the innovation office at Western Sydney University. M.C. is supported by ARC fellowship (DECRA).

プロトコルは、以下のC57BL / 6及びC3H /彼が（retinally縮退）マウス神経組織の調製を記載するが、同様の技術が他の種にも適用することができます。すべての動物は健康で、温度、湿度、12時間の明/暗サイクルの標準的な条件で処理、食料と水に自由にアクセスし、任意の意図ストレス刺激なしでした。全ての実験は承認され、西シドニー大学の動物実験倫理委員会に従って実行し、動物使用とケアの指針（?...

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	<li>Colbert, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cortical+brain+slices+for+electrophysiological+recording.">Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording.</a> Meth mol biol. 337, 117-125 (2006).</li><li>Gibb, A., Edwards, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+recording+from+cells+in+sliced+tissues.">Patch clamp recording from cells in sliced tissues.</a> Microelect Techniq. , 255-274 (1994).</li><li>Kantevari, S., Buskila, Y., Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+cell-permeant+6-nitrodibenzofuranyl-caged+IP3.">Synthesis and characterization of cell-permeant 6-nitrodibenzofuranyl-caged IP3.</a> Photochem photobiol sci. 11 (3), 508-513 (2012).</li><li>Blankenship, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+and+Extrasynaptic+Factors+Governing+Glutamatergic+Retinal+Waves.">Synaptic and Extrasynaptic Factors Governing Glutamatergic Retinal Waves.</a> Neuron. 62 (2), 230-241 (2009).</li><li>Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. 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L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM.">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J Vis Exp. (23), e3-e5 (2009).</li><li>Buskila, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Astrocytic+Nitric+Oxide+Production+and+Neuronal+Modifications+in+the+Neocortex+of+a+NOS2+Mutant+Mouse.">Enhanced Astrocytic Nitric Oxide Production and Neuronal Modifications in the Neocortex of a NOS2 Mutant Mouse.</a> PLoS ONE. 2 (9), 9 (2007).</li><li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).</li></ol>

この記事では、これにより、実験の目標を完了するために必要な動物の数を減らすこと、イメージングおよび電気生理学的実験のために急性神経組織の生存能力を拡張するために、インキュベーション方法が記載されています。二つの主要なプロセスは、時間をかけて神経組織の劣化を支配：ⅰ）増加した細菌レベル、および解放細菌内毒素それに伴う増加、および外傷性スライシング手順<...

電気生理学と機能イメージング（カルシウム、電位感受性色素）は、神経科学の中で最も一般的に使用される実験技術の2つです。ここで検討する脳スライス標本および網膜ホールマウントは、麻酔薬や筋弛緩からの汚染することなく、電気生理学的特性およびシナプスの接続性を調べるための手段を提供します。脳スライスおよび網膜ホールマウントは、特定の回路と脳ネットワーク1の研究を可能にする、培養物又は細胞ホモジネートとは異なり、その構造的完全性を維持します。単離された組織からの記録は、心拍や呼吸に関連した動きとしてin vivoでの録音に比べて利点が排除されています。また、直接可視化は、標的とする細胞の特定のクラス、および薬理学的ツール2、3の局所適用を可能にします。 パッチクランプ記録とカルクイウムをローディング染料網膜ホールマウントでは、網膜神経節細胞（RGC）層をカバーし、細胞への直接アクセスを防止膜（ILM）を、制限内の存在によって複雑になります。通常、この膜は、単一のセルにギガオームシールのパッチピペットと形成の直接適用を可能にするために、ガラスピペットで削り取られています。また、浴適用カルシウム色素は、ILMと交差しないとのいずれか逆行視神経5で次の注射を輸送または組織6を介して電気穿孔し、この膜4の下に注射しなければなりません。網膜色素変性症、RD / rdマウスのげっ歯類モデルを利用する場合また、ILMは厚く、より不可解です。ここでは、両方のユビキタスカルシウム色素ローディングを可能にするために、酵素消化7でILMを除去する技術、およびパッチクランプrecordiのための網膜神経節細胞への直接アクセスを使用しますNGS 8。 脳スライスまたは網膜ホールマウントのいずれかから成功した記録は、生存可能な神経組織の切開およびインキュベーションに依存します。一般的に、組織は、実験の朝に抽出し、それを記録するために使用されるまで、人工脳脊髄液（aCSFの）中でインキュベートされます。この時間ウィンドウ以下の重大な劣化で、8時間 - 通常、組織は、6のための実行可能なままです。しかし、脳スライスとホールマウント網膜の準備の両方は、通常、この短い期間の中から記録することができるよりも多くの組織を作り出します。したがって、組織は、多くの場合、一日の終わりに廃棄され、切開は、その後の日に再び終了します。これは、別の動物を利用し、セットアップおよび解剖/繰り返し染色の〜2時間されていることを意味します。次のプロトコルが利用されている少数の動物を意味し、24時間以上のために神経組織の寿命を延長するための方法を説明し、より多くの実験時間が利用可能です。組織の生存率ワット電気生理学的特性およびカルシウム動態を記録を通じて評価し、これらのプロパティは、&lt;4時間及び&gt; 24時間postdissection間の区別がつかなかったよう。 これらの結果は、カルシウムイメージングと電気生理学的記録により評価されるように、長時間のインキュベーション後、無傷で機能的単一細胞の特性であるが、ネットワーク活動だけでなくことを示し、&gt; 24時間postdissection変更されません。さらに、我々は、カルシウム色素は、任意の有害な効果を引き起こすことなく、長期間の細胞内に残ることができることを示しています。このプロトコルの適用は、外部環境を高度に調節された後、急性神経組織における神経細胞の機能的活性は、長期間維持することができることを示しています。組織の生存率が異なるインキュベーションプロトコルによる実験室間で大きく変化する。また、この方法は、急性neuの健康状態の変動を低減するために適用されるべき理想的なパラメータのゴールドスタンダードを確立しますRONAL組織。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="831">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich VETEC</td>
			<td style="width:135px;">V800372</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">P9333</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">N-Methyl-D-glucamine</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">M2004&#160;</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">D-glucose</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">G5767</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">S6014</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">S2554</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:315px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">M9272&#160;</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:315px;">Calcium chloride&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">223506</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Papain Dissociation System</td>
			<td style="width:159px;">Worthington&#160;</td>
			<td style="width:135px;">LK003150</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Dimethyl sulfoxide anhydrous</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">276855</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:315px;">Pluronic F-127 Low UV absorbance*</td>
			<td style="width:159px;">Life technologies</td>
			<td style="width:135px;">P-6867</td>
			<td style="width:225px;">20% solution in DMSO&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:315px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Fura-2 AM&#160;&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Anaspec</td>
			<td style="width:135px;">84017</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Fluo-4 AM&#160;&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">F23917</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Fluo-8 AM</td>
			<td style="width:159px;">Abcam</td>
			<td style="width:135px;">Ab142773</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:315px;">Vibrating blade microtome&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Leica Biosystem</td>
			<td style="width:135px;">VT1200 S</td>
			<td style="width:225px;">Equiped with Leica&#8217;s Vibrocheck&#8482; measurement device&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Antivibration table</td>
			<td style="width:159px;">Kinetic Systems Vibraplane&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Vibraplane 9100/9200&#160;</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Fixed Stage Upright Microscope</td>
			<td style="width:159px;">Olympus</td>
			<td style="width:135px;">BX51WI&#160;</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Microscope Objective</td>
			<td style="width:159px;">Olympus</td>
			<td style="width:135px;">XLUMPlanFLN 20x/1.00w</td>
			<td style="width:225px;">20X&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Microscope Objective</td>
			<td style="width:159px;">Olympus</td>
			<td style="width:135px;">LUMPlanFLN 60x/1.00w</td>
			<td style="width:225px;">60X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">CCD Camera</td>
			<td style="width:159px;">Andor</td>
			<td style="width:135px;">Ixon +</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">High speed wavelength switcher</td>
			<td style="width:159px;">Sutter instrument</td>
			<td style="width:135px;">Lambda DG-4&#160;</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Patch clamp amplifier</td>
			<td style="width:159px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:135px;">MultiClamp 700B</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Data acquisition system</td>
			<td style="width:159px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:135px;">Digidata 1440A</td>
			<td style="width:225px;">Axon Digidata&#174; System</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:159px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:135px;">BF150-86-10</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Microelectrode puller</td>
			<td style="width:159px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:135px;">P-97</td>
			<td style="width:225px;">Flaming/Brown type micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Recording/perfusion chamber</td>
			<td style="width:159px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:135px;">RC-40LP</td>
			<td style="width:225px;">Low Profile Open Bath Chambers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Software</td>
			<td style="width:159px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:135px;">pClamp 10.2</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Andor iQ Live Cell Imaging Software</td>
			<td style="width:159px;">Andor</td>
			<td style="width:135px;">Andor iQ3</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Braincubator</td>
			<td style="width:159px;">Payo Scientific</td>
			<td style="width:135px;">BR26021976</td>
			<td style="width:225px;">www.braincubator.com.au</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>CP-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Temperature Controller</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>TC-36-25 RS232</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

prolonged incubation of acute neuronal tissue for electrophysiology and calcium-imaging

切開後8時間 - 急性神経組織標本、脳スライスおよび網膜ホールマウントは、通常は6維持することができます。これは、実験時間を制限し、研究ごとに使用されている動物の数を増加させます。このような浴適用染料との長時間のプレインキュベーションを必要とするカルシウムイメージングとしてこの制限は、具体的な影響のプロトコルを。 3内の指数関数的な細菌の成長 - スライス後の4時間は、しっかり組織の健康の低下と相関しています。本研究では、成長因子を含む抗生物質、滅菌手順、または組織培養培地を必要とせずに長時間（&gt; 24時間）のために実行可能な神経組織を維持するために、急性の製剤中の細菌の増殖を制限するための方法が記載されています。 UV照射による細胞外液を循環し、15でカスタム保持室で組織を維持することによって - 16°C、組織には電気生理学的特性の違い、またはカルシウムのsiを示しません&gt; 24時間postdissectionにおける細胞内カルシウム色素を通してgnaling。これらの方法は、急性神経組織を使用してそれらのための実験時間を延長するだけでなく、実験的な目標を完了するために必要な動物の数を減らすことができますし、急性神経組織の培養のためのゴールドスタンダードを設定します。

インキュベーション中にaCSFの細菌負荷と温度の厳密な調節は、神経組織の生存率を維持することが不可欠です。 16°C（ 図1） -これは、UVC光を照射し、15でaCSFの温度を維持することにより最適化することができます。環境条件の記録と実験者を提供し、続く場合は、間の変動を減少させる神経組織を、インキュベート時にこのようなパラメータのゴールド...

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Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

8時間 - 身体から取り出されると、神経組織を大幅に6後の組織の最終的な劣化につながる、環境条件によって影響されます。密接に監視し、組織の細胞外の環境を調節する独特の培養方法を用いて、組織生存率を有意に&gt; 24時間延長することができます。

電気生理学およびカルシウムイメージングのための急性神経組織の長期のインキュベーション

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

高濃縮ニューロン培養の世代のための皮質組織ブロックの凍結保存

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

カルシウムイメージングの急性脳室下帯スライスの調製

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

Cの生体内神経カルシウムイメージングでエレガンス

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

同時電気生理学的記録および視交叉上核ニューロンのカルシウムイメージング

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond

リアルタイム電気生理学：プローブ神経ダイナミクスとその先にクローズド·ループ·プロトコルの使用

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウム イメージング

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

二光子励起レーザーとゼブラフィッシュ幼虫におけるカルシウム イメージング法と行動記録を用いた評価を用いたニューロン集団のアブレーション

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

インビボ マウス劣オリーブにおけるカルシウムイメージング

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

インビボ 無傷の背根神経節における一次感覚ニューロンのネットワークにおけるニューロンアンサンブルのカルシウムイメージング

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...