Name: preparation of non-human primate brain tissue for pre-embedding immunohistochemistry and electron microscopy
Uploaded: 2017-04-03T13:00:00
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Diese Studie wurde von den Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada (NSERC, 401848-2011 zu MP) unterstützt. MP erhielt eine Karriere Auszeichnung vom Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S). LE war der Empfänger einer Promotionsstipendium aus dem FRQ-S (FRQ-S 14D 29441). Wir danken Marie-Josée Wallman für technische Unterstützung.

Ethik-Statement: Alle Protokolle Tiere beteiligt sind, wurden durch die Comité de Protection des Animaux de l&#39;Université Laval genehmigt und wurden in Übereinstimmung mit dem Canadian Council on Animal Care Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren (Ed. 2) hergestellt. Das hier beschriebene Protokoll wurde von ca. 800 g für ausgewachsene Tiere optimiert. Die Volumina des Fixiermittel sollte nach dem Tiergröße angepasst werden. 1. Herstellung von Lösungen für die t...

In diesem Artikel präsentieren wir ein zuverlässiges Protokoll für transkardiale Perfusion von nicht-menschlichen Primaten und Pre-Embedding Immunhistochemie geeignet für EM Probenprüfung. Obwohl typische Kryo-EM, wie CEMOVIS, eine gute Erhaltung des Gehirns Ultra bietet, schränkt sie auch die Verwendung von Immunhistochemie 12. Andere Techniken, einschließlich Kryo-Substitution und Tokuyaso Technik erlauben post-Einbettungs Immunhistochemie, aber diese Techniken sind teuer aufgrund zusät...

Lichtmikroskopie, einschließlich konfokale und Zwei-Photonen - Mikroskopie, hat sich als ein wirksames Instrument zur in vivo neuronalen Prozesse zu studieren, unter anderem 1, 2. Obwohl die typische räumliche Auflösung bei der Lichtmikroskopische (LM) Ebene ungefähr 200 nm, die jüngsten technologische Fortschritte sind verschiedene Lichtquellen, wie beispielsweise extremer Ultraviolett- und weiche Röntgenmikroskopie, hat insbesondere diese Auflösung auf eine fast 10 nm räumlichen Auflösung erhöht 3 , 4, 5. Weitere technologische Fortschritte in der bildgebenden Magnetresonanz - Bildgebung umfassen mit der Histologie kombiniert und bieten ein neues Verfahren zur in vivo , die Dicke der Myelinscheide Messen eines Parameters, der traditionell meßbaren nur an der Elektronenmikroskopische (EM) Stufe 6, 7 war. Although diese Fortschritte bei der LM-Ebene ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Untersuchung lebende Prozesse liefern, um eine Detailansicht und Charakterisierung von Strukturen, wie synaptische Kontakte kann nur mit EM erreicht werden, die eine Auflösung bietet, die 0,5 nm erreichen kann. Allerdings Beobachtung bei der EM-Ebene erfordert die Proben in gewisser Weise tot und verändert zu werden, mit chemischen Fixateure und Entwässerungsverfahren, um die Zytoarchitektur zu bewahren. Somit können biologische Proben bei hoher Auflösung der Prüfung herausfordernd aufgrund von Strahlungsschäden des Elektronenstrahls, geringem Kontrast, strukturelle Abweichungen von Membranen oder auch das Vorhandensein von Artefakten , die nach der Dehydratisierung und epoxy auftreten können Einbettung 8, 9, 10. Die Erhaltung Proben in ihrer nativen Form für die Strukturanalyse kann mit „Cryo EM verglastem Sections“ oder CEMOVIS, mit schneidendem Ansatz erreicht werden, dassbeinhaltet schnell einfrieren und die Probe in Eis glasiger Einbettungs und die Abschnitte unter der EM bei einer kryogenen Temperatur 11, 12 zu untersuchen. Dieses Verfahren ermöglicht die Untersuchung von Proben , während sie noch fester und vollhydratisierte sind, so dass Artefakte , die durch Austrocknung Beseitigung verarbeitet 13. Jedoch beinhaltet dieses Verfahren zusätzliche Vorrichtungen für Kryo-Ultramikrotomie, sowie zusätzliche Geräte auf dem Standard-EM, um diese Beobachtung bei sehr niedrigen Temperaturen zu ermöglichen, was erhebliche Mehrkosten erzeugen. Darüber hinaus schließt die CEMOVIS Ansatz die Verwendung von Techniken Immunmarkierung, da Antikörper in der Regel bei RT inkubiert werden müssen. Alternativ ist es möglich, ultrastrukturelle Analyse mit immunhistochemischen Verfahren zu kombinieren, indem eine Gefriert Substitution Ansatz, bei dem Kryo-fixierten Proben langsam aufgetaut werden, während in Cryo-Schutzchemikalien immerged und sind then in Spezialharze eingebettet, wie Lowicryls. Post-Einbettung Immunmarkierung kann dann auf einem solchen Material 12 durchgeführt werden. Allerdings Gefriersubstitution und Kryo-Fixierung Techniken sind zeitaufwendig. Sie erfordern die Installation zusätzlicher Ausrüstung und erfordern noch Proben zu organischem Lösungsmittel und chemische Fixiermittel ausgesetzt werden, die die Zytoarchitektur verändern können, trotz der Verwendung einer niedrigen Temperatur 14, 15. Daher trotz aller technologischen Fortschritte sowohl bei dem LM und EM - Ebene, chemische Fixierung von Hirngeweben, insbesondere Acrolein, bleibt eine kostengünstige und zeitsparende Methode zu kombinieren Immunhistochemie mit EM 16. In den letzten Jahrzehnten wurden viele Versuche unternommen, eine Mischung von Aldehyden zu finden, das die beste Gewebeerhaltung bieten. Vor den 1960er Jahren die einzige Fixiermittel Chemikalie, die akzeptable Ergebnisse für EM gab, war Osmiumtetroxid. Allerdings ist Osmiumtetroxid sehr giftig und teuer, ihre Verwendung durch das Gefäßsystem ausschließen Organe wie das Gehirn zu fixieren. Acrolein wurde in den späten 1950er Jahren als ein zuverlässiges Verfahren für die Tiergewebekonservierung geeignet für EM Beobachtung von Zellstrukturen 17 eingeführt. Es durchdringt die tiefen Gewebe und reagiert schneller als anderer Aldehyde , wenn zur Fixierung durch Eintauchen verwendet , und ermöglicht eine gute Konservierung zytoplasmatischer Komponenten mit minimaler Schrumpfung des Gewebes 17. Ein solches Merkmal ergibt Fixierung acrolein einen klaren Vorteil gegenüber anderen Aldehyden in frischem Gewebe bei der Verwendung, durch eine genauere Lokalisierung von lebenden molekulare Verbindungen ermöglichen, wie Enzyme und andere Proteine , 18. Tatsächlich hat es sich als einfache, effiziente und kostengünstige Methode der Fixierung für Visualisierung an der EM-Ebene in vielen Arten, darunter Amphibien und Nagetiere, wie sie effizient stabili im Laufe der Jahre validiertZES Peptide und Proteine, behalten Antigenität und liefern relativ intakt Ultrastruktur , wenn 16 in Kombination mit einem anderen Aldehyd Fixativ verwendet, 18, 19, 20, 21. Protokolle für Acrolein Fixation in Nagetieren seitdem wurden umfassend, vor allem durch die Pickel - Gruppe, zur Umsetzung dual Immunomarkierung für EM 16, 22 standardisiert und verwendet. Einige Gruppen haben Acrolein Fixation in nicht-menschlichen Primaten - Hirngewebe 23 verwendet. Jedoch unser Wissen gibt es nur ein veröffentlichtes Protokoll effizient chemische Fixierung mit Acrolein in nicht-menschlichen Primaten beschreibt , die kompatibel sind mit EM Immunmarkierung 24. In diesem Artikel stellen wir eine einfache und zuverlässige Methode effizient chemisch nicht-hum zu behebenein Primaten Gehirne mit Acrolein, so dass für eine potentiell langfristige Konservierung sowie vor Einbettungs Immunomarkierung und Übertragung EM Prüfung.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<tbody>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:216px;">Dibasic anhydrous sodium phosphate (Na2HPO4)</td>
			<td style="width:123px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">S374-500</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:216px;">Monobasic monohydrate sodium phosphate (NaH2PO4.H2O)</td>
			<td style="width:123px;">EM Science</td>
			<td style="width:119px;">SX0710-1</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:123px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">S271-3</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hydroxymethyl aminomethane (THAM)</td>
			<td style="width:123px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">T370-500</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">HCl&#160;</td>
			<td style="width:123px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;">HX0603-3</td>
			<td style="width:177px;">1N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate potection.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">NaOH</td>
			<td style="width:123px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;">SX0590-1</td>
			<td style="width:177px;">5N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection.</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td style="width:177px;">4% dilution. Product is highly volatile in its powder form and highly toxic. Use with caution under a venting hood with appropriate protection.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Acrolein (90%)</td>
			<td style="width:123px;">sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">110221</td>
			<td style="width:177px;">3% dilution. Product is highly toxic. Use under a venting hood with appropriate protection.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Autopsy venting table</td>
			<td style="width:123px;">Mopec</td>
			<td style="width:119px;">CE400</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Electronic perfusion pump</td>
			<td style="width:123px;">cole parmer</td>
			<td style="width:119px;">masterflex L/S 7523-90</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Needle (perfusion)</td>
			<td style="width:123px;">terumo&#160;</td>
			<td style="width:119px;">NN-1838R</td>
			<td style="width:177px;">18G 1 1/2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Needle</td>
			<td style="width:123px;">terumo&#160;</td>
			<td style="width:119px;">NN-2713R</td>
			<td style="width:177px;">21G 1/2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ketamine</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:177px;">20 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylazine</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:177px;">4 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acepromazine</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:177px;">0.5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scalpel</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Scalpel blades</td>
			<td style="width:123px;">Feather&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; lance</td>
			<td style="width:119px;">201011&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; J9913</td>
			<td style="width:177px;">No.22 for surgery and&#160;&#160;&#160; No. 11 for EM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Surgical scissors</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rongeurs</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Vibratome</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">VT 1200S</td>
			<td style="width:177px;">Calibrate blade before each use, when the device allows it</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vibratome razor blade</td>
			<td style="width:123px;">Gillette</td>
			<td style="width:119px;">GIN 642107</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:123px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">G33-4</td>
			<td style="width:177px;">30% dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethylene glycol</td>
			<td style="width:123px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">E178-4</td>
			<td style="width:177px;">30% dilution</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Sodium borohydride (NaBH4)</td>
			<td style="width:123px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">S-9125</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Normal horse serum</td>
			<td style="width:123px;">Jackson immunoResearch Laboratories</td>
			<td>008-000-121</td>
			<td style="width:177px;">2% dilution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Cold-fish gelatin</td>
			<td style="width:123px;">Aurion</td>
			<td style="width:119px;">900.033</td>
			<td style="width:177px;">0.5% dilution. Original product is concentrated at 40%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Primary antibody, SERT</td>
			<td style="width:123px;">Santa Cruz biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">SC-1458</td>
			<td style="width:177px;">1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Primary antibody, ChAT</td>
			<td style="width:123px;">Chemicon (Millipore)</td>
			<td style="width:119px;">AB144P</td>
			<td style="width:177px;">1/25 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primary antibody, TH</td>
			<td style="width:123px;">ImmunoStar</td>
			<td style="width:119px;">22941</td>
			<td style="width:177px;">1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biotinylated secondary antibody, goat</td>
			<td style="width:123px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">BA-9500</td>
			<td style="width:177px;">1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biotinylated secondary antibody, mouse</td>
			<td style="width:123px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">BA-2000</td>
			<td style="width:177px;">1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectastain elite ABC kit</td>
			<td style="width:123px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">PK6100</td>
			<td style="width:177px;">8.8 &#181;L/mL of A and B each</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">3&#39;3 diaminobenzidine (DAB)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D5637</td>
			<td style="width:177px;">0,05% dilution. Product is highly volatile in its powder form and toxic. Do not throw waste in the sink.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Peroxide (H2O2) 30%</td>
			<td style="width:123px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">H-323</td>
			<td style="width:177px;">0,005% dilution</td>
		</tr>
		<tr height="212">
			<td height="212" style="height:212px;width:216px;">Osmium tetroxide (OsO4)</td>
			<td style="width:123px;">Electron microscopic science</td>
			<td style="width:119px;">2% 19152&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 4% 19150&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Original solution can be either 2% ou 4%. Keep attention to which one is used to calculate the final 1% dilution. Product is very sensitive to light. Osmium is highly toxic. Use only under a venting hood with appropriate protection.</td>
		</tr>
		<tr height="189">
			<td height="189" style="height:189px;width:216px;">Durcupan water-repellent epoxy resin</td>
			<td style="width:123px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">A: M epoxy resin (44611)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; B: hardener 964 (44612)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; C: accelerator 960 (DY 060)&#160; (44613)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; D: plasticizer (44614)&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Polymerize 48h at 58 &#176;C before throwing in waste.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Alumium cups</td>
			<td style="width:123px;">Electron microscopic science</td>
			<td style="width:119px;">70048-01</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:123px;">commercial alcohols</td>
			<td style="width:119px;">1019C</td>
			<td style="width:177px;">Dilute in distilled water with appropriate concentration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Propylene oxide</td>
			<td style="width:123px;">Electron microscopic science</td>
			<td style="width:119px;">20401</td>
			<td style="width:177px;">Organic solvent. Highly volatile and toxic. Use under a venting hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Non-coated medium glass slides</td>
			<td style="width:123px;">brain research laboratories</td>
			<td style="width:119px;">3875-FR</td>
			<td style="width:177px;">Grease surface with mineral oil</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Plastic film (Aclar embedding film)</td>
			<td style="width:123px;">Electron microscopic science</td>
			<td style="width:119px;">50425-25</td>
			<td style="width:177px;">Grease surface with mineral oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultramicrotome</td>
			<td style="width:123px;">Leica UC7</td>
			<td style="width:119px;">EM UC7</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Diamond trimming tool (ultratrim)</td>
			<td style="width:123px;">Diatome&#160;</td>
			<td style="width:119px;">UT 1081</td>
			<td style="width:177px;">Can use glass knife alternatively</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultra 45&#176; Diatome Diamond knife</td>
			<td style="width:123px;">Diatome&#160;</td>
			<td style="width:119px;">MC13437</td>
			<td style="width:177px;">equipped with a boat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylenes</td>
			<td style="width:123px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">X5SK-4</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">150-mesh copper grids</td>
			<td style="width:123px;">Electron microscopic science</td>
			<td style="width:119px;">G150-cu</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">grid-box</td>
			<td style="width:123px;">Electron microscopic science</td>
			<td style="width:119px;">71138</td>
			<td style="width:177px;">Can store up to 100 grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:123px;">Anachemia</td>
			<td style="width:119px;">81983</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="336">
			<td height="336" style="height:336px;width:216px;">Lead nitrate</td>
			<td style="width:123px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">L-6258</td>
			<td style="width:177px;">Make a stock solution of lead citrate made of 1.33 g of lead nitrate and 1.76g of sodium citrate diluted in 42 mL of pre-boiled and cooled distilled water to which 8 mL of 1N NaOH are added after the conversion from lead nitrate to lead citrate is complete. pH should be approximately 12. Store solution in a hermetic plastic bottle and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe</td>
			<td style="width:123px;">terumo&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SS-05L</td>
			<td style="width:177px;">5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe filter</td>
			<td style="width:123px;">corning</td>
			<td style="width:119px;">431222</td>
			<td style="width:177px;">0.2 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Absorbing paper (bibulous paper)</td>
			<td style="width:123px;">Electron microscopic science</td>
			<td style="width:119px;">70086-1</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Parafilm</td>
			<td style="width:123px;">Laboratory film</td>
			<td style="width:119px;">PM-999</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M5904</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of non-human primate brain tissue for pre-embedding immunohistochemistry and electron microscopy

Trotz aller technologischen Fortschritte bei der Lichtmikroskopie Niveau bleibt Elektronenmikroskopie das einzige Werkzeug in den Neurowissenschaften zu untersuchen und zu charakterisieren, ultrastrukturelle und morphologische Details von Neuronen, wie synaptische Kontakte. Gute Erhaltung von Hirngewebe für die Elektronenmikroskopie kann durch strenge Kryo-Fixierung Verfahren erhalten werden, aber diese Techniken sind ziemlich teuer und begrenzen die Verwendung von Immunmarkierung, die von entscheidender Bedeutung ist, um die Konnektivität von identifizierten neuronalen Systemen zu verstehen. Gefriersubstitution Verfahren wurden die Verbindung von Kryo-Fixierung mit Immunmarkierung zu ermöglichen, entwickelt. Allerdings stützt sich die Reproduzierbarkeit dieser methodischen Ansätze in der Regel auf teure Gefriergeräte. Darüber hinaus wird mit dieser Technik zuverlässige Ergebnisse zu erzielen ist sehr zeitraubend und Geschick schwer. Somit bleibt das traditionelle chemisch fixierte Gehirn, insbesondere Acrolein Fixiermittel, eine zeiteffiziente und kostengünstige Methode Elektron zu kombinierenMikroskopie mit Immunhistochemie. Hier bieten wir ein zuverlässiges experimentelles Protokoll unter Verwendung von chemischen Acrolein Fixierung, die zur Erhaltung der Primaten Hirngewebe führt und ist kompatibel mit Pre-Einbettung Immunhistochemie und Transmissions-Elektronen-mikroskopische Untersuchung.

In diesem Abschnitt präsentieren wir repräsentative Ergebnisse, die nach der Beobachtung erhalten wurden, bei der Übertragung EM-Ebene, von immunhistochemisch primate Hirngewebe chemisch mit einem Gemisch aus 3% Acrolein und 4% PFA fixiert. Wir erzielen gute Konservierung der Ultrastruktur, wie durch die relativ intakte Myelinscheide und der reinen Visualisierung von Doppelmembranen (2A) angedeutet ist . Synaptische Kontakte zusammen mit neuronaler Elemente aus der Mi...

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Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Hier bieten wir eine einfache, kostengünstige und zeitsparendes Protokoll zu chemisch fixieren Primaten Hirngewebe mit Acrolein Fixiermittel, so dass für die Langzeitarchivierung, die kompatibel mit vorge Einbettung Immunhistochemie für die Transmissionselektronenmikroskopie.

Herstellung von nichtmenschlichen Primaten Hirngewebe für die Pre-Einbettung Immunhistochemie und Elektronenmikroskopie

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Vorbereitung von Gehirngewebe der Maus für Immunelektronenmikroskopie

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Forschung

Neurowissenschaften

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC Labeling von Neuronen aus Nager und nicht-menschlichen Primaten Hirnschnitten

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

Fokussierten Ionenstrahl-Fräs-und Rasterelektronenmikroskopie des Hirngewebes

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

Wholemount Immunhistochemie für die Aufdeckung von komplexen Gehirn Topographie

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionelle Bildgebung mit Ultraschall-Blut-Hirnschranke Störung und Mangan-MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt;, Um neuronale Morphologie und Migration Studieren

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

Das olfaktorische System als Modell zur Axonal Wachstumsmuster und Morphologie Studieren<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Primer für die Immunhistochemie auf gefriergeschnitten Rat Brain Tissue: Beispiel Färbung für Mikroglia und Neuronen

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Analyse Mitochondrien von Hirnzellen Verwenden der seriellen Block Gesicht Rasterelektronenmikroskopie

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Vorbereitung von Maus-Retinal-Cryo-Sektionen für die Immunhistochemie

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...