Name: preparation of non-human primate brain tissue for pre-embedding immunohistochemistry and electron microscopy
Uploaded: 2017-04-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC, 401,848-2011 כדי MP). MP קיבל פרס הקריירה מן Fonds דה משוכלל ונדיר קוויבק-Santé (FRQ-S). LE היה הנמען של דוקטורט מן FRQ-S (FRQ-S 14D 29,441). אנו מודים מארי ג&#39;וזי Wallman לקבלת סיוע טכני.

משפט ואתיקה: כל הפרוטוקולים מעורבים בעלי חיים אושרו על ידי Laval Comité דה להגנת des animaux de l&#39;אוניברסיטת ונעשו על פי המועצה הקנדית על מדריך Animal Care אל לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (אד 2.). הפרוטוקול המתואר כאן היה מותאם לבעלי חיים בוגרים של כ 800 גרם. הנפחים של מקבע צריכים להיות מות...

במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול אמין זלוף transcardiac של פרימטים לא אנושיים אימונוהיסטוכימיה טרום ההטבעה המתאימה לבדיקת מדגם EM. למרות טיפוסי קריו-EM, כגון CEMOVIS, מספק שימור טוב של ultrastructure המוח, זה גם מגביל את השימוש אימונוהיסטוכימיה 12. טכניקות אחרות, כוללים החלפת ?...

במיקרוסקופ אור, כולל confocal מיקרוסקופיה שני פוטונים, הוכיחה להיות כלי יעיל לחקר בתהליכים עצביים vivo, בין היתר 1, 2. למרות הרזולוציה המרחבית הטיפוסית ברמת האור המיקרוסקופית (LM) היא כ 200 ננומטר, התקדמות טכנולוגית אחרונה באמצעות מקורות אור שונים, כגון אולטרה סגול קיצוני וכן במיקרוסקופ רנטגן הרכה, גדל בעיקר החלטה זו החלטה מרחבית 10 ננומטר כמעט 3 , 4, 5. התקדמות טכנולוגית אחרת הדמיה כוללת בשילוב הדמיה בתהודה מגנטית עם היסטולוגיה ולספק שיטה חדשה למדידת העובי של מעטפת המיאלין in vivo, פרמטר זה היה למדידה באופן מסורתי רק על מיקרוסקופית אלקטרונים (EM) הרמה 6, 7. AlthouGH התקדמויות אלה ברמת LM לספק כלי מצוין ללימוד תהליכי חיים, נוף ואפיון מפורט של מבנים, כגון קשרים סינפטיים, יכול להיות מושגת רק עם EM, המציע רזולוציה שיכול להגיע 0.5 ננומטר. עם זאת, תצפית ברמת EM מחייבת דגימות להיות מת ושינה במובנים מסוימים, עם fixatives כימי ותהליכי התייבשות, על מנת לשמר את cytoarchitecture. לפיכך, בחינת דגימות ביולוגיות ברזולוציה גבוהה יכול להיות מאתגרת בשל נזקי קרינה מקרן האלקטרונים, ניגודיות נמוכה, סטיות מבניות של ממברנות, או אפילו נוכחות של חפצים שיכולים להתרחש התייבשות אפוקסי הבאים הטבעה 8, 9, 10. שימור דגימות בצורתם המקורית לניתוח מבני יכול להיות מושגת על ידי שימוש &quot;Cryo EM סעיפים מזוגגים&quot; או CEMOVIS, גישת חתך כיכרוך מקפיא והטבעה המדגם במהירות קרח זגוגי בחינת הסעיפים תחת EM בטמפרטורה קריוגני 11, 12. הליך זה מאפשר בחינת דגימות בזמן שהם עדיין מוצקים hydrated מלא, ובכך לחסל חפצים הנגרמים על ידי התייבשות מעבד 13. עם זאת, שיטה זו כרוכה מכשירים נוספים קריו-ultramicrotomy, כמו גם מכשירים נוספים על EM הרגיל, על מנת לאפשר תצפית זו בטמפרטורות מאוד נמוכות, אשר יוצרות עלויות משמעותיות נוספות. בנוסף, הגישה CEMOVIS מונע את השימוש של immunolabeling טכניקות, מאז נוגדנים בדרך כלל צריך להיות וטופחו על RT. לחלופין, אפשר לשלב ניתוח ultrastructural עם נהלים אימונוהיסטוכימיים ידי שימוש בגישה הקפאת-החלפה, שבמהלכה דגימות קבוע קריו הם הפשירו לאט תוך immerged ב כימיקלים קריו-מגן והם הen מוטבע שרפים מיוחדים, כגון Lowicryls. פוסט-הטבעת immunolabeling יכול להתבצע אז על חומר כזה 12. עם זאת, הקפאה-החלפה וטכניקות קריו-קיבוע הן זמן רב. הם דורשים התקנה של ציוד נוסף ועדיין דורשים דגימות להיחשף ממס אורגני ו מקבעים כימי שיכול לשנות את cytoarchitecture, למרות השימוש בטמפרטורה נמוכה 14, 15. לפיכך, למרות כל ההתקדמות הטכנולוגית הן בבית LM ורמת EM, קיבוע כימי של רקמת המוח, במיוחד עם acrolein, נשאר שיטה בעלות נמוכה זמן יעיל לשלב אימונוהיסטוכימיה עם EM 16. בעשורים האחרונים, נעשו ניסיונות רבים למצוא תערובת של אלדהידים המספקים לשימור רקמות הטוב. לפני 1960, מקבע כימי רק כי נתן תוצאות מקובל EM היה tetroxide אוסמיום. עם זאת, tetroxide אוסמיום הוא רעיל ביותר ויקר, מניעת השימוש בו דרך מערכת כלי דם כדי לתקן איברים כמו המוח. Acrolein הוצג בשנת 1950 מאוחר כשיטה אמינה לשימור רקמות בעלי החיים מתאים תצפית EM של מבנים הסלולר 17. זה חודר לרקמה עמוקה יותר ומגיב מהר יותר מאשר אלדהידים אחרים כאשר נעשה שימוש עבור קיבוע על ידי טבילה ומאפשר שימור טוב של רכיבים ציטופלסמית, עם הצטמקות מינימאלית של הרקמה 17. תכונה כזו נותנת קיבוע acrolein יתרון ברור על פני אלדהידים אחרים בעת שימוש ברקמה טריה, על ידי מתן אפשרות לוקליזציה מדויקת יותר של חי תרכובות מולקולריות, כגון אנזימים וחלבונים אחרים 18. ואכן, שיטה זו הוכחה לאורך השנים כשיטה יעילה ונוחה בעלות נמוכה של קיבוע עבור להדמיה ברמה EM במינים רבים, כולל דו חיים מכרסמים, כפי שהוא יעיל stabiliפפטידים וחלבוני zes, שומרים antigenicity ומספקים יחסית ללא פגע ultrastructure כאשר נעשו שימוש בשילוב עם אלדהיד אחר קוֹבֵעַ 16, 18, 19, 20, 21. הפרוטוקולים לקיבוע acrolein במכרסמים יש ומאז כבר טופל ו שימוש נרחב, בעיקר על ידי קבוצת פיקל, ליישם immunolabeling כפול עבור 16 EM, 22. כמה קבוצות שהשתמשו קיבוע acrolein ברקמת המוח הפרימטים הלא-אנושי 23. עם זאת, למיטב ידיעתנו, יש רק פרוטוקול אחד שפורסם ביעילות המתאר קיבוע כימי עם acrolein ב פרימטים לא אנושיים התואמת EM immunolabeling 24. במאמר זה, אנו מספקים שיטה קלה ואמינה כימיים יעיל לתקן אי-לזמזםמוח הפרימטים עם acrolein, המאפשר שימור לטווח ארוך בפוטנציה יחד עם טרום הטבעת EM immunolabeling והעביר בדיקה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<tbody>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:216px;">Dibasic anhydrous sodium phosphate (Na2HPO4)</td>
			<td style="width:123px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">S374-500</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:216px;">Monobasic monohydrate sodium phosphate (NaH2PO4.H2O)</td>
			<td style="width:123px;">EM Science</td>
			<td style="width:119px;">SX0710-1</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:123px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">S271-3</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hydroxymethyl aminomethane (THAM)</td>
			<td style="width:123px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">T370-500</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">HCl&#160;</td>
			<td style="width:123px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;">HX0603-3</td>
			<td style="width:177px;">1N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate potection.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">NaOH</td>
			<td style="width:123px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;">SX0590-1</td>
			<td style="width:177px;">5N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection.</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td style="width:177px;">4% dilution. Product is highly volatile in its powder form and highly toxic. Use with caution under a venting hood with appropriate protection.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Acrolein (90%)</td>
			<td style="width:123px;">sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">110221</td>
			<td style="width:177px;">3% dilution. Product is highly toxic. Use under a venting hood with appropriate protection.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Autopsy venting table</td>
			<td style="width:123px;">Mopec</td>
			<td style="width:119px;">CE400</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Electronic perfusion pump</td>
			<td style="width:123px;">cole parmer</td>
			<td style="width:119px;">masterflex L/S 7523-90</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Needle (perfusion)</td>
			<td style="width:123px;">terumo&#160;</td>
			<td style="width:119px;">NN-1838R</td>
			<td style="width:177px;">18G 1 1/2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Needle</td>
			<td style="width:123px;">terumo&#160;</td>
			<td style="width:119px;">NN-2713R</td>
			<td style="width:177px;">21G 1/2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ketamine</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:177px;">20 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylazine</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:177px;">4 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acepromazine</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:177px;">0.5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scalpel</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Scalpel blades</td>
			<td style="width:123px;">Feather&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; lance</td>
			<td style="width:119px;">201011&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; J9913</td>
			<td style="width:177px;">No.22 for surgery and&#160;&#160;&#160; No. 11 for EM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Surgical scissors</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rongeurs</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Vibratome</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">VT 1200S</td>
			<td style="width:177px;">Calibrate blade before each use, when the device allows it</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vibratome razor blade</td>
			<td style="width:123px;">Gillette</td>
			<td style="width:119px;">GIN 642107</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:123px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">G33-4</td>
			<td style="width:177px;">30% dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethylene glycol</td>
			<td style="width:123px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">E178-4</td>
			<td style="width:177px;">30% dilution</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Sodium borohydride (NaBH4)</td>
			<td style="width:123px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">S-9125</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Normal horse serum</td>
			<td style="width:123px;">Jackson immunoResearch Laboratories</td>
			<td>008-000-121</td>
			<td style="width:177px;">2% dilution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Cold-fish gelatin</td>
			<td style="width:123px;">Aurion</td>
			<td style="width:119px;">900.033</td>
			<td style="width:177px;">0.5% dilution. Original product is concentrated at 40%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Primary antibody, SERT</td>
			<td style="width:123px;">Santa Cruz biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">SC-1458</td>
			<td style="width:177px;">1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Primary antibody, ChAT</td>
			<td style="width:123px;">Chemicon (Millipore)</td>
			<td style="width:119px;">AB144P</td>
			<td style="width:177px;">1/25 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primary antibody, TH</td>
			<td style="width:123px;">ImmunoStar</td>
			<td style="width:119px;">22941</td>
			<td style="width:177px;">1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biotinylated secondary antibody, goat</td>
			<td style="width:123px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">BA-9500</td>
			<td style="width:177px;">1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biotinylated secondary antibody, mouse</td>
			<td style="width:123px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">BA-2000</td>
			<td style="width:177px;">1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectastain elite ABC kit</td>
			<td style="width:123px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">PK6100</td>
			<td style="width:177px;">8.8 &#181;L/mL of A and B each</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">3&#39;3 diaminobenzidine (DAB)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D5637</td>
			<td style="width:177px;">0,05% dilution. Product is highly volatile in its powder form and toxic. Do not throw waste in the sink.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Peroxide (H2O2) 30%</td>
			<td style="width:123px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">H-323</td>
			<td style="width:177px;">0,005% dilution</td>
		</tr>
		<tr height="212">
			<td height="212" style="height:212px;width:216px;">Osmium tetroxide (OsO4)</td>
			<td style="width:123px;">Electron microscopic science</td>
			<td style="width:119px;">2% 19152&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 4% 19150&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Original solution can be either 2% ou 4%. Keep attention to which one is used to calculate the final 1% dilution. Product is very sensitive to light. Osmium is highly toxic. Use only under a venting hood with appropriate protection.</td>
		</tr>
		<tr height="189">
			<td height="189" style="height:189px;width:216px;">Durcupan water-repellent epoxy resin</td>
			<td style="width:123px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">A: M epoxy resin (44611)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; B: hardener 964 (44612)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; C: accelerator 960 (DY 060)&#160; (44613)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; D: plasticizer (44614)&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Polymerize 48h at 58 &#176;C before throwing in waste.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Alumium cups</td>
			<td style="width:123px;">Electron microscopic science</td>
			<td style="width:119px;">70048-01</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:123px;">commercial alcohols</td>
			<td style="width:119px;">1019C</td>
			<td style="width:177px;">Dilute in distilled water with appropriate concentration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Propylene oxide</td>
			<td style="width:123px;">Electron microscopic science</td>
			<td style="width:119px;">20401</td>
			<td style="width:177px;">Organic solvent. Highly volatile and toxic. Use under a venting hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Non-coated medium glass slides</td>
			<td style="width:123px;">brain research laboratories</td>
			<td style="width:119px;">3875-FR</td>
			<td style="width:177px;">Grease surface with mineral oil</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Plastic film (Aclar embedding film)</td>
			<td style="width:123px;">Electron microscopic science</td>
			<td style="width:119px;">50425-25</td>
			<td style="width:177px;">Grease surface with mineral oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultramicrotome</td>
			<td style="width:123px;">Leica UC7</td>
			<td style="width:119px;">EM UC7</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Diamond trimming tool (ultratrim)</td>
			<td style="width:123px;">Diatome&#160;</td>
			<td style="width:119px;">UT 1081</td>
			<td style="width:177px;">Can use glass knife alternatively</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultra 45&#176; Diatome Diamond knife</td>
			<td style="width:123px;">Diatome&#160;</td>
			<td style="width:119px;">MC13437</td>
			<td style="width:177px;">equipped with a boat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylenes</td>
			<td style="width:123px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">X5SK-4</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">150-mesh copper grids</td>
			<td style="width:123px;">Electron microscopic science</td>
			<td style="width:119px;">G150-cu</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">grid-box</td>
			<td style="width:123px;">Electron microscopic science</td>
			<td style="width:119px;">71138</td>
			<td style="width:177px;">Can store up to 100 grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:123px;">Anachemia</td>
			<td style="width:119px;">81983</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="336">
			<td height="336" style="height:336px;width:216px;">Lead nitrate</td>
			<td style="width:123px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">L-6258</td>
			<td style="width:177px;">Make a stock solution of lead citrate made of 1.33 g of lead nitrate and 1.76g of sodium citrate diluted in 42 mL of pre-boiled and cooled distilled water to which 8 mL of 1N NaOH are added after the conversion from lead nitrate to lead citrate is complete. pH should be approximately 12. Store solution in a hermetic plastic bottle and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe</td>
			<td style="width:123px;">terumo&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SS-05L</td>
			<td style="width:177px;">5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe filter</td>
			<td style="width:123px;">corning</td>
			<td style="width:119px;">431222</td>
			<td style="width:177px;">0.2 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Absorbing paper (bibulous paper)</td>
			<td style="width:123px;">Electron microscopic science</td>
			<td style="width:119px;">70086-1</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Parafilm</td>
			<td style="width:123px;">Laboratory film</td>
			<td style="width:119px;">PM-999</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M5904</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of non-human primate brain tissue for pre-embedding immunohistochemistry and electron microscopy

למרות כל ההתקדמות הטכנולוגית ברמה המיקרוסקופית האור, מיקרוסקופ אלקטרונים נשאר הכלי היחיד במדעי המוח לבחון ולאפיין פרטי ultrastructural ו מורפולוגי של נוירונים, כגון קשרים סינפטיים. שימור טוב של רקמת המוח עבור במיקרוסקופ אלקטרונים ניתן להשיג על ידי שיטות קריו-קיבוע קפדני, אך הטכניקות הללו הם די יקרים ולהגביל את השימוש immunolabeling, שהוא חיוני כדי להבין את הקישוריות של מערכות עצביות מזוהה. שיטות Freeze-החלפה פותחו כדי לאפשר שילוב של קיבעון קריו עם immunolabeling. עם זאת, השחזור של גישות מתודולוגיות אלה בדרך כלל מסתמך על מכשירי קירור יקרים. יתר על כן, השיג תוצאות אמינות עם טכניקה זו הוא גוזל זמן מאוד ומיומן-מאתגר. לפיכך, המוח הקבוע המסורתי כימי, במיוחד עם מקבע אקרולאין, נשאר זמן-יעיל שיטה זולה לשלב אלקטרוניםמיקרוסקופ עם אימונוהיסטוכימיה. כאן, אנו מספקים פרוטוקול ניסוי אמין באמצעות קיבוע acrolein כימי שמוביל לשימור רקמות מוח הפרימטים והוא תואם מראש הטבעת בדיקה מיקרוסקופית אלקטרונים אימונוהיסטוכימיה והעביר.

בחלק זה, אנו מציגים תוצאות נציגים שהושגו בעקבות התצפית, ברמת EM השידור, של רקמת המוח הפרימטים immunostained הקבוע כימי בתערובת של acrolein 3% ו 4% PFA. השגנו שימור טוב של ultrastructure, כפי שצוין על ידי מעטפת המיאלין יחסית ללא פגע והדמיון המודרך המסודר של ממברנות כפולות <st...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy at JoVE.com

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

כאן, אנו מספקים קלה, בעלות נמוכה, וזמן חסכוני פרוטוקול לתקן כימי רקמת מוח הפרימטים עם מקבע אקרולאין, המאפשר שימור לטווח ארוך התואמת טרום הטבעה אימונוהיסטוכימיה עבור במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים.

הכנה של רקמת מוח הפרימאטים לא-אנושית עבור טרום הטבעת אימונוהיסטוכימיה ו מיקרוסקופי אלקטרונים

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

הכנת רקמות מוח עכבר מיקרוסקופית Immunoelectron

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

תיוג DiOLISTIC של הנוירונים מפני מכרסמים שאינן פרוסות המוח האנושי הפרימאטים

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

אלומת יונים ממוקדת כרסום מיקרוסקופיית אלקטרונים של רקמת המוח

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

אימונוהיסטוכימיה Wholemount על טופוגרפיה חושפני המוח קומפלקס

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

הדמייה תפקודית באמצעות שיבוש Ultrasonic הדם למוח הגדר מנגן משופרת MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

מערכת חוש הריח כמודל לחקר דפוסי axonal צמיחה ומורפולוגיה<em&gt; In vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

פריימר לאימונוהיסטוכימיה על רקמות Cryosectioned מוח חולדה: דוגמא להכתמת Microglia ונוירונים

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

ניתוח של המוח המיטוכונדריה באמצעות מיקרוסקופ סידורי בלוק פן אלקטרונים סורק

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...