Name: enhanced sample multiplexing of tissues using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cpilot)
Uploaded: 2017-05-01T10:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT at JoVE.com

Gli autori riconoscono l&#39;Università di Pittsburgh start-up fondi e NIH, NIGMS R01 concessione (GM 117.191-01) per RASR.

Etica dichiarazione: I topi sono stati acquistati da un non-profit di ricerca biomedica istituzione indipendente e alloggiati presso la Divisione di laboratorio risorse animali presso l&#39;Università di Pittsburgh. Tutti i protocolli di animali sono stati approvati dal Comitato di cura ed uso degli animali Istituzionale presso l&#39;Università di Pittsburgh. 1. Proteine ​​Estrazione e Generazione di peptidi per Chemical-tagging <ol><li> Estrarre proteine da tessuti, cellule,...

<ol>
	<li>Ong, S. -. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Isotope+Labeling+by+Amino+Acids+in+Cell+Culture,+SILAC,+as+a+Simple+and+Accurate+Approach+to+Expression+Proteomics.">Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).</li><li>Koehler, C. J., Arntzen, M. &. #. 2. 1. 6. ;., de Souza, G. A., Thiede, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Approach+for+Triplex-Isobaric+Peptide+Termini+Labeling+(Triplex-IPTL).">An Approach for Triplex-Isobaric Peptide Termini Labeling (Triplex-IPTL).</a> Anal. Chem. 85 (4), 2478-2485 (2013).</li><li>Langen, H. 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J., Yao, X., Fenselau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+18O+Labeling+for+Comparative+Proteomics:+Evaluation+of+Endoprotease+Glu-C+as+the+Catalytic+Agent.">Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Evaluation of Endoprotease Glu-C as the Catalytic Agent.</a> J. Proteome Res. 1 (1), 27-33 (2002).</li><li>Gygi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags.">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nat Biotech. 17 (10), 994-999 (1999).</li><li>Schmidt, A., Kellermann, J., Lottspeich, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+strategy+for+quantitative+proteomics+using+isotope-coded+protein+labels.">A novel strategy for quantitative proteomics using isotope-coded protein labels.</a> PROTEOMICS. 5 (1), 4-15 (2005).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+Mass+Tags:+A+Novel+Quantification+Strategy+for+Comparative+Analysis+of+Complex+Protein+Mixtures+by+MS/MS.">Tandem Mass Tags: A Novel Quantification Strategy for Comparative Analysis of Complex Protein Mixtures by MS/MS.</a> Anal. Chem. 75 (8), 1895-1904 (2003).</li><li>Ross, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Protein+Quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+Using+Amine-reactive+Isobaric+Tagging+Reagents.">Multiplexed Protein Quantitation in Saccharomyces cerevisiae Using Amine-reactive Isobaric Tagging Reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li><li>Xiang, F., Ye, H., Chen, R., Fu, Q., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N,N-Dimethyl+Leucines+as+Novel+Isobaric+Tandem+Mass+Tags+for+Quantitative+Proteomics+and+Peptidomics.">N,N-Dimethyl Leucines as Novel Isobaric Tandem Mass Tags for Quantitative Proteomics and Peptidomics.</a> Anal. Chem. 82 (7), 2817-2825 (2010).</li><li>Ting, L., Rad, R., Gygi, S. 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C., Greer, T., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+Enabled+12-Plex+DiLeu+Isobaric+Tags+for+Quantitative+Proteomics.">High-Resolution Enabled 12-Plex DiLeu Isobaric Tags for Quantitative Proteomics.</a> Anal. Chem. 87 (3), 1646-1654 (2015).</li><li>Robinson, R. A. S., Evans, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Sample+Multiplexing+for+Nitrotyrosine-Modified+Proteins+Using+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging.">Enhanced Sample Multiplexing for Nitrotyrosine-Modified Proteins Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging.</a> Anal. Chem. 84 (11), 4677-4686 (2012).</li><li>Evans, A. R., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+combined+precursor+isotopic+labeling+and+isobaric+tagging+(cPILOT)+approach+with+selective+MS(3)+acquisition.">Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition.</a> Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).</li><li>Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cPILOT+analysis+of+the+APP/PS-1+mouse+liver+proteome.">Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome.</a> PROTEOMICS - Clin Appl. 9 (9-10), 872-884 (2015).</li><li>Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Multiplexing+with+Cysteine-Selective+Approaches:+cysDML+and+cPILOT.">Sample Multiplexing with Cysteine-Selective Approaches: cysDML and cPILOT.</a> J. Am. Soc Mass Spectrom. 26 (4), 615-630 (2015).</li><li>Dephoure, N., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperplexing:+A+Method+for+Higher-Order+Multiplexed+Quantitative+Proteomics+Provides+a+Map+of+the+Dynamic+Response+to+Rapamycin+in+Yeast.">Hyperplexing: A Method for Higher-Order Multiplexed Quantitative Proteomics Provides a Map of the Dynamic Response to Rapamycin in Yeast.</a> Sci Signal. 5 (217), rs2 (2012).</li><li>Hebert, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutron-encoded+mass+signatures+for+multiplexed+proteome+quantification.">Neutron-encoded mass signatures for multiplexed proteome quantification.</a> Nat Meth. 10 (4), 332-334 (2013).</li><li>Merrill, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NeuCode+Labels+for+Relative+Protein+Quantification.">NeuCode Labels for Relative Protein Quantification.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (9), 2503-2512 (2014).</li><li>Braun, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Multiple+Reporter+Ions+from+a+Single+Isobaric+Reagent+Increases+Multiplexing+Capacity+for+Quantitative+Proteomics.">Generation of Multiple Reporter Ions from a Single Isobaric Reagent Increases Multiplexing Capacity for Quantitative Proteomics.</a> Analytical Chemistry. 87 (19), 9855-9863 (2015).</li><li>Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+Throughput+in+Targeted+Proteomics+Assays:+54-Plex+Quantitation+in+a+Single+Mass+Spectrometry+Run.">Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run.</a> Anal. Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).</li><li>Gu, L., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+endogenous+measurement+of+S-nitrosylation+in+Alzheimer's+disease+using+oxidized+cysteine-selective+cPILOT.">High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT.</a> Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).</li><li>Cao, Z., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS3-based+quantitative+proteomics+using+pulsed-Q+dissociation.">MS3-based quantitative proteomics using pulsed-Q dissociation.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (11), 1025-1030 (2015).</li><li>Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Value+of+Using+Multiple+Proteases+for+Large-Scale+Mass+Spectrometry-Based+Proteomics.">Value of Using Multiple Proteases for Large-Scale Mass Spectrometry-Based Proteomics.</a> J. Proteome Res. 9 (3), 1323-1329 (2010).</li><li>McAlister, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiNotch+MS3+Enables+Accurate,+Sensitive,+and+Multiplexed+Detection+of+Differential+Expression+across+Cancer+Cell+Line+Proteomes.">MultiNotch MS3 Enables Accurate, Sensitive, and Multiplexed Detection of Differential Expression across Cancer Cell Line Proteomes.</a> Anal. Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).</li></ol>

CPilot consente la misura simultanea di più di 12 campioni unici. Al fine di garantire il tagging di successo sia a N-terminale e lisina residui di peptidi, è indispensabile avere il pH corretto per ogni serie di reazioni e di eseguire la reazione dimethylation prima per l&#39;etichettatura peptide. dimethylation selettivo del N-terminale è effettuata da avere un pH a ~ 2,5 (± 0,2). Questo risultato è ottenuto sfruttando le differenze dei PKA del dei gruppi amminici sulla lisina e N-terminale. A pH 2,5, la lisina ?...

Proteomica spesso comporta l&#39;analisi di molti campioni utilizzati per comprendere meglio i processi patologici, cinetica enzimatica, modificazioni post-traduzionali, risposta a stimoli ambientali, risposta ai trattamenti terapeutici, scoperta biomarker, o meccanismi di droga. metodi quantitativi possono essere impiegati per misurare differenze relative dei livelli delle proteine ​​nei campioni di e può essere privo di etichetta o coinvolgere etichettatura isotopica (metabolica, chimica o enzimatica). Stabili metodi di etichettatura isotopo sono cresciuti in popolarità perché consentono molti campioni da analizzare simultaneamente e sono adatti per i campioni da cellule, tessuti, fluidi corporei, o organismi interi. Metodi 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, aumentare la produttività sperimentale, marcatura isotopicariducendo il tempo di acquisizione, i costi, e l&#39;errore sperimentale. Questi metodi utilizzano spettri di massa precursore per misurare abbondanze relative delle proteine ​​da picchi peptide. Al contrario, i reagenti codifica isobariche 8, 9, 10 generano ioni giornalista che sono o rilevati in MS / MS o MS 3 11 spettri e questi picchi sono utilizzate per rilevare l&#39;abbondanze relative di proteine. L&#39;attuale stato-of-the-art in proteomica multiplazione o è un 10-plex 12 o 12-plex analisi tag isobarica 13. Multiplexing campione maggiore (cioè&gt; 10 campioni) metodi sono stati sviluppati dal nostro laboratorio per tessuti 14, 15, 16, 17, e da altri per l&#39;analisi di cellule 18 </sup&gt;, 19, 20, 21 tessuti, o peptidi mirati 22. Abbiamo sviluppato una tecnica di multiplexing migliorato chiamato combinato precursore etichettatura isotopica con marcatura isobarica (CPilot). CPilot globale è utile per ottenere informazioni sulle concentrazioni relative di tutte le proteine attraverso differenti condizioni del campione (≥12) 14. La figura 1 mostra una schema generale CPilot. Triptici o Lys-C peptidi sono selettivamente etichettati all&#39;estremità N-terminale con dimethylation con bassi pH 2 ed a residui di lisina con 6-plex reagenti utilizzando pH elevato. Questa strategia raddoppia il numero di campioni che possono essere analizzati con reagenti isobariche che aiuta a ridurre i costi sperimentali e, inoltre, riduce i passaggi e il tempo sperimentali. CPilot è flessibile abbiamo sviluppato altri metodi per studiare modi ossidativo post-traduzionalefiche, comprese le proteine 3-nitrotirosina modificati 14 e cisteina contenenti peptidi con S-nitrosylation (oxcyscPILOT) 23. Abbiamo anche sviluppato un aminoacido approccio selettivo, cisteina CPilot (cyscPILOT) 17. MS 3 acquisizione con un top-ione 11 o selettiva-y 1 ione metodo 15 può contribuire a ridurre l&#39;interferenza degli ioni reporter e migliorare la precisione quantitativa di CPilot. L&#39;uso di MS 3 nel metodo di acquisizione richiede uno strumento ad alta risoluzione con un analizzatore di massa Orbitrap sebbene bassa risoluzione strumenti trappola ionica possono anche funzionare 24. In precedenza, CPilot è stato utilizzato per studiare le proteine del fegato 16 dal modello murino della malattia di Alzheimer. Qui, descriviamo come eseguire l&#39;analisi CPilot globale utilizzando cervello, cuore, fegato e omogenati per studiare il ruolo del periphery nella malattia di Alzheimer. Questo esperimento incorpora replica biologica. A causa della versatilità di CPilot, gli utenti interessati possono utilizzare la tecnica per studiare altri tessuti per una serie di problemi e sistemi biologici.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Water - MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile - MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9508-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution (28 - 30%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320145-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>208-753-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>94318-250ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Pierce Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreiotol (DTT)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAM)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>144-48-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>168149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>T1426-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>F8775-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13 C</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>596388-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>156159-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>190020-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kit</td>
			<td>Protea BioSciences</td>
			<td>SP-155-24kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>T7408-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) - 6 reactions (1 x 0.8 mg)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>90061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>255580-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td>any mixer can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB 1cc (10 mg) &#160;&#160;extraction cartridges</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000383</td>
			<td>These are C18 cartridges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port model</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>57265</td>
			<td>A 12 port model is also sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed-vac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD1010</td>
			<td>any brand of speed vac is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath chamber</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2825/2826</td>
			<td>Any brand of&#160; a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116005500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eksigent Nano LC - Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosampler</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>-</td>
			<td>This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein software (e.g. Proteome Discoverer)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGABSFAKJMAUH&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>AL54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12365-382</td>
			<td>Any brand of stir plates are sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter (Tris compatiable)</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific (Accumet)</td>
			<td>13-620-183</td>
			<td>Any brand of a ph meter is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 10 buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-664-261</td>
			<td>Any brand of ph buffer 10 is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 7 buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-664-260</td>
			<td>Any brand ph buffer 7&#160; is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes, 500pk</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mL eppendorf tubes, 500pk</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-408-120</td>
			<td>Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.65&#181;m Ultrafree MC DV centrifugal filter units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC30DV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microcentrifuge tubes, 72 units</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 packing material (5 &#181;m, 100 &#197;)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>PM5/61100/000</td>
			<td>This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 packing material (5 &#181;m, 200 &#197;)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>PM5/61200/000</td>
			<td>This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced sample multiplexing of tissues using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cpilot)

V&#39;è una crescente domanda di analizzare molti campioni biologici per la malattia di comprensione e di scoperta di biomarcatori. proteomica strategie quantitative che consentono la misurazione simultanea di più campioni sono diffusi e ridurre notevolmente i costi ei tempi sperimentali. Il nostro laboratorio ha sviluppato una tecnica chiamata precursore combinato etichettatura isotopica e tagging isobarica (CPilot), che migliora campione multiplazione di etichettatura isotopica tradizionale o approcci di tagging isobariche. CPilot globale può essere applicato a campioni provenienti da cellule, tessuti, fluidi corporei, o organismi interi e fornisce informazioni sulla abbondanza relativa proteina attraverso diverse condizioni del campione. CPilot funziona 1) usando condizioni di bassa tampone pH selettivamente peptide dimethylate N-terminali e 2) utilizzando condizioni tampone pH elevato etichettare ammine primarie di residui di lisina con reagenti isobariche commercialmente disponibili (vedere Tabella dei materiali / reagenti). Il grado dimultiplexing campione disponibile dipende dal numero di etichette precursori utilizzati e il reagente di marcatura isobarica. Qui, presentiamo un&#39;analisi 12-plex usando la luce e dimethylation pesante combinato con sei-plex reagenti isobariche per analizzare 12 campioni di tessuti di topo in una singola analisi. multiplazione avanzata è utile per ridurre il tempo sperimentale e costi e, soprattutto, permettendo un confronto in molte condizioni del campione (repliche biologiche, stadio della malattia, trattamenti farmacologici, genotipi, o longitudinali time-punti) con pregiudizi meno sperimentale e l&#39;errore. In questo lavoro, l&#39;approccio globale CPilot viene utilizzato per analizzare il cervello, cuore e tessuti del fegato attraverso repliche biologiche dal modello murino della malattia e wild-type controlli di Alzheimer. Globale CPilot può essere applicato per studiare altri processi biologici e atta ad aumentare campione multiplexing a più di 20 campioni.

CPilot utilizza la chimica ammina-based per chimicamente peptidi dell&#39;etichetta lungo la N-terminale e residui di lisina e migliora le capacità multiplexing campione. La figura 2 mostra dati rappresentativi MS che si ottiene da un 12-plex analisi CPilot di cervello, cuore, fegato e tessuti da topo modello di malattia e di tipo selvatico controlli di Alzheimer. Come indicato nella tabella 1, due repliche biologiche per topi malattia e wild-type di Al...

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Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Combinato precursore etichettatura isotopica e tagging isobarica (CPilot) è una strategia proteomica quantitativa che migliora le capacità di multiplazione campione di tag isobariche. Questo protocollo descrive l&#39;applicazione di CPilot ai tessuti dal modello murino della malattia e wild-type controlli di Alzheimer.

Maggiore Campione Multiplexing dei tessuti utilizzando combinata Precursore isotopica etichettatura e isobarica Tagging (CPilot)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Elettroforesi gel orizzontale per la rilevazione avanzata dei complessi proteina-RNA

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Ricerca

Biochimica

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Proteoma profonda profilatura di etichettatura isobarico, vasto cromatografia liquida, spettrometria di massa e quantificazione assistita da Software

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolamento dei Glomeruli e In Vivo di etichettatura delle proteine di superficie delle cellule glomerulari

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Quantificazione di tutto il proteoma di etichettatura omogeneità a livello di singola molecola

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robusto confronto dei livelli della proteina attraverso tessuti e sviluppo utilizzando standardizzati quantitativa Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Un portacampioni all-in-one per la cristallografia a raggi X macromolecolare con una dispersione minima dello sfondo

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Preparazione di un campione di plasma per la spettrometria di massa mediante una workstation automatizzata

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Quantificazione del Coenzevia A nelle cellule e nei tessuti

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Arricchimento dei tessuti mammiferi e Xenopus Oocytes con colesterolo

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Preparazione di film di supporto campione in microscopia elettronica a trasmissione utilizzando un blocco di galleggiamento di supporto

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...