Name: enhanced sample multiplexing of tissues using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cpilot)
Uploaded: 2017-05-01T10:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT at JoVE.com

著者はRASRにピッツバーグ大学のスタート・アップ・ファンドおよびNIH、NIGMS R01の助成金（GM 117191から01）を認めます。

倫理文：マウスは、独立した非営利生物医学研究機関から購入し、ピッツバーグ大学の実験動物資源部門に収容しました。全ての動物プロトコルは、ピッツバーグ大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。 化学タギング1.タンパク質抽出およびペプチドの生成<ol><li> 組織、細胞、または体液からタンパク質を抽出します。 <ol><li>機械式ホ?...

<ol>
	<li>Ong, S. -. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Isotope+Labeling+by+Amino+Acids+in+Cell+Culture,+SILAC,+as+a+Simple+and+Accurate+Approach+to+Expression+Proteomics.">Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).</li><li>Koehler, C. J., Arntzen, M. &. #. 2. 1. 6. ;., de Souza, G. A., Thiede, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Approach+for+Triplex-Isobaric+Peptide+Termini+Labeling+(Triplex-IPTL).">An Approach for Triplex-Isobaric Peptide Termini Labeling (Triplex-IPTL).</a> Anal. Chem. 85 (4), 2478-2485 (2013).</li><li>Langen, H. F., Evers, M., Wipf, S., Berndt, B., P, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> From Genome to Proteome 3rd Siena 2D Electrophoresis Meeting. , (1998).</li><li>Yao, X., Freas, A., Ramirez, J., Demirev, P. A., Fenselau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+18O+Labeling+for+Comparative+Proteomics:+Model+Studies+with+Two+Serotypes+of+Adenovirus.">Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Model Studies with Two Serotypes of Adenovirus.</a> Anal. Chem. 73 (13), 2836-2842 (2001).</li><li>Reynolds, K. J., Yao, X., Fenselau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+18O+Labeling+for+Comparative+Proteomics:+Evaluation+of+Endoprotease+Glu-C+as+the+Catalytic+Agent.">Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Evaluation of Endoprotease Glu-C as the Catalytic Agent.</a> J. Proteome Res. 1 (1), 27-33 (2002).</li><li>Gygi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags.">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nat Biotech. 17 (10), 994-999 (1999).</li><li>Schmidt, A., Kellermann, J., Lottspeich, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+strategy+for+quantitative+proteomics+using+isotope-coded+protein+labels.">A novel strategy for quantitative proteomics using isotope-coded protein labels.</a> PROTEOMICS. 5 (1), 4-15 (2005).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+Mass+Tags:+A+Novel+Quantification+Strategy+for+Comparative+Analysis+of+Complex+Protein+Mixtures+by+MS/MS.">Tandem Mass Tags: A Novel Quantification Strategy for Comparative Analysis of Complex Protein Mixtures by MS/MS.</a> Anal. Chem. 75 (8), 1895-1904 (2003).</li><li>Ross, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Protein+Quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+Using+Amine-reactive+Isobaric+Tagging+Reagents.">Multiplexed Protein Quantitation in Saccharomyces cerevisiae Using Amine-reactive Isobaric Tagging Reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li><li>Xiang, F., Ye, H., Chen, R., Fu, Q., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N,N-Dimethyl+Leucines+as+Novel+Isobaric+Tandem+Mass+Tags+for+Quantitative+Proteomics+and+Peptidomics.">N,N-Dimethyl Leucines as Novel Isobaric Tandem Mass Tags for Quantitative Proteomics and Peptidomics.</a> Anal. Chem. 82 (7), 2817-2825 (2010).</li><li>Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS3+eliminates+ratio+distortion+in+isobaric+multiplexed+quantitative+proteomics.">MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics.</a> Nat Meth. 8 (11), 937-940 (2011).</li><li>McAlister, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+Multiplexing+Capacity+of+TMTs+Using+Reporter+Ion+Isotopologues+with+Isobaric+Masses.">Increasing the Multiplexing Capacity of TMTs Using Reporter Ion Isotopologues with Isobaric Masses.</a> Anal. Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).</li><li>Frost, D. C., Greer, T., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+Enabled+12-Plex+DiLeu+Isobaric+Tags+for+Quantitative+Proteomics.">High-Resolution Enabled 12-Plex DiLeu Isobaric Tags for Quantitative Proteomics.</a> Anal. Chem. 87 (3), 1646-1654 (2015).</li><li>Robinson, R. A. S., Evans, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Sample+Multiplexing+for+Nitrotyrosine-Modified+Proteins+Using+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging.">Enhanced Sample Multiplexing for Nitrotyrosine-Modified Proteins Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging.</a> Anal. Chem. 84 (11), 4677-4686 (2012).</li><li>Evans, A. R., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+combined+precursor+isotopic+labeling+and+isobaric+tagging+(cPILOT)+approach+with+selective+MS(3)+acquisition.">Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition.</a> Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).</li><li>Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cPILOT+analysis+of+the+APP/PS-1+mouse+liver+proteome.">Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome.</a> PROTEOMICS - Clin Appl. 9 (9-10), 872-884 (2015).</li><li>Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Multiplexing+with+Cysteine-Selective+Approaches:+cysDML+and+cPILOT.">Sample Multiplexing with Cysteine-Selective Approaches: cysDML and cPILOT.</a> J. Am. Soc Mass Spectrom. 26 (4), 615-630 (2015).</li><li>Dephoure, N., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperplexing:+A+Method+for+Higher-Order+Multiplexed+Quantitative+Proteomics+Provides+a+Map+of+the+Dynamic+Response+to+Rapamycin+in+Yeast.">Hyperplexing: A Method for Higher-Order Multiplexed Quantitative Proteomics Provides a Map of the Dynamic Response to Rapamycin in Yeast.</a> Sci Signal. 5 (217), rs2 (2012).</li><li>Hebert, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutron-encoded+mass+signatures+for+multiplexed+proteome+quantification.">Neutron-encoded mass signatures for multiplexed proteome quantification.</a> Nat Meth. 10 (4), 332-334 (2013).</li><li>Merrill, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NeuCode+Labels+for+Relative+Protein+Quantification.">NeuCode Labels for Relative Protein Quantification.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (9), 2503-2512 (2014).</li><li>Braun, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Multiple+Reporter+Ions+from+a+Single+Isobaric+Reagent+Increases+Multiplexing+Capacity+for+Quantitative+Proteomics.">Generation of Multiple Reporter Ions from a Single Isobaric Reagent Increases Multiplexing Capacity for Quantitative Proteomics.</a> Analytical Chemistry. 87 (19), 9855-9863 (2015).</li><li>Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+Throughput+in+Targeted+Proteomics+Assays:+54-Plex+Quantitation+in+a+Single+Mass+Spectrometry+Run.">Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run.</a> Anal. Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).</li><li>Gu, L., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+endogenous+measurement+of+S-nitrosylation+in+Alzheimer's+disease+using+oxidized+cysteine-selective+cPILOT.">High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT.</a> Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).</li><li>Cao, Z., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS3-based+quantitative+proteomics+using+pulsed-Q+dissociation.">MS3-based quantitative proteomics using pulsed-Q dissociation.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (11), 1025-1030 (2015).</li><li>Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Value+of+Using+Multiple+Proteases+for+Large-Scale+Mass+Spectrometry-Based+Proteomics.">Value of Using Multiple Proteases for Large-Scale Mass Spectrometry-Based Proteomics.</a> J. Proteome Res. 9 (3), 1323-1329 (2010).</li><li>McAlister, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiNotch+MS3+Enables+Accurate,+Sensitive,+and+Multiplexed+Detection+of+Differential+Expression+across+Cancer+Cell+Line+Proteomes.">MultiNotch MS3 Enables Accurate, Sensitive, and Multiplexed Detection of Differential Expression across Cancer Cell Line Proteomes.</a> Anal. Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).</li></ol>

cPILOTは12個の以上のユニークなサンプルの同時測定が可能になります。ペプチドの両方のN末端及びリジン残基で成功したタグを確保するためには、反応の各セットのための正しいpHを有し、かつ第一のペプチド標識のためのジメチル化反応を行うことが不可欠です。 N末端での選択的ジメチル化は、（±0.2）〜2.5でpHを有することによって行われます。これは、リジンおよびN末端にアミノ基の...

プロテオミクスは、多くの場合、より良い疾患プロセスを理解するために使用される多くのサンプルを、酵素反応速度、翻訳後修飾、環境刺激に反応し、治療処置、バイオマーカーの発見、または薬物のメカニズムへの応答の分析を含みます。定量的な方法は、サンプルを横切るタンパク質レベルの相対的差異を測定するために使用することができ、ラベルフリーであるか、または同位体標識（代謝的、化学的、または酵素）を含むことができます。彼らは多くのサンプルを同時に分析することを可能にし、異なる細胞、組織、体液、または生物全体からのサンプルに適しているので、安定同位体標識法は、人気が成長しています。同位体標識法1、2、3、4、5、6、7増加実験スループット、取得時間、コスト、および実験誤差を低減します。これらの方法は、ペプチドピークからのタンパク質の相対存在量を測定するために、前駆体の質量スペクトルを使用します。対照的に、同重体標識試薬は、8、9、10は、いずれかのMS / MS又はMS 3スペクトル11で検出され、これらのピークは、タンパク質の相対存在量について報告するために使用されるレポーターイオンを生成します。 現在の最先端のプロテオミクス多重では、10プレックス12または12重アイソバリックタグの分析13のいずれかです。強化サンプル多重化（ すなわち &gt; 10個のサンプル）の方法は、セル18の分析のために他の人が組織14、15、16、17のために我々の研究室によって開発された、とされています</SUP&gt;、19、20、21、または標的化ペプチド22を組織します。私たちは、アイソバリックタグ（cPILOT）との組み合わせ前駆同位体標識と呼ばれる強化多重化技術を開発しました。グローバルcPILOTは、異なる試料条件（≥12）14を横切る全てのタンパク質の相対濃度に関する情報を取得するために有用です。 図1は、一般的cPILOTワークフローを示します。トリプシンまたはLys-Cペプチドは、選択的に低pH 2を用いてジメチル化とN末端と高いpHを使用して6-プレックス試薬とリジン残基で標識されます。この戦略は、実験的なコストを削減するのに役立ち、さらに、実験の手順や時間を削減するアイソバリック試薬を用いて分析することができ、サンプルの数が2倍になります。 我々は、酸化翻訳後MODIを研究するために他の方法を開発してきたようcPILOTは柔軟性があります3-ニトロチロシン修飾タンパク質14およびS-ニトロシル化（oxcyscPILOT）23とシステインを含むペプチドを含むfications、。我々はまた、アミノ酸の選択的アプローチ、システインcPILOT（cyscPILOT）17を開発しました。トップイオン11または選択-Y 1 -イオン法15とMS 3獲得は、レポーターイオンの干渉を軽減し、cPILOTの定量精度を向上させることができます。低解像度のイオントラップ機器は、24を動作することができるものの、取得方法におけるMS 3の使用は、オービトラップ質量分析器と高分解能機器を必要とします。 以前は、cPILOTは、アルツハイマー病のモデルマウスからの肝臓タンパク質16を研究するために使用されてきました。ここでは、peripheの役割を研究するために、脳、心臓、肝臓ホモジネートを使用してグローバルcPILOT分析を実行する方法について説明しますアルツハイマー病におけるRY。この実験は、生物学的複製を内蔵しています。そのためcPILOTの汎用性、興味のあるユーザーは、生物学的な問題やシステムの範囲のために他の組織を研究するために技術を使用することができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Water - MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile - MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
			<td>4 L quantity is not necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9508-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution (28 - 30%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320145-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>208-753-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>94318-250ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Pierce Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreiotol (DTT)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAM)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>144-48-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>168149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>T1426-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>F8775-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13 C</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>596388-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>156159-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>190020-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kit</td>
			<td>Protea BioSciences</td>
			<td>SP-155-24kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich, Life Science</td>
			<td>T7408-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) - 6 reactions (1 x 0.8 mg)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>90061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich, Chemistry</td>
			<td>255580-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td>any mixer can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB 1cc (10 mg) &#160;&#160;extraction cartridges</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000383</td>
			<td>These are C18 cartridges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port model</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>57265</td>
			<td>A 12 port model is also sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed-vac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD1010</td>
			<td>any brand of speed vac is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath chamber</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2825/2826</td>
			<td>Any brand of&#160; a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116005500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eksigent Nano LC - Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosampler</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>-</td>
			<td>This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein software (e.g. Proteome Discoverer)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGABSFAKJMAUH&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>AL54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12365-382</td>
			<td>Any brand of stir plates are sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter (Tris compatiable)</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific (Accumet)</td>
			<td>13-620-183</td>
			<td>Any brand of a ph meter is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 10 buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-664-261</td>
			<td>Any brand of ph buffer 10 is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 7 buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-664-260</td>
			<td>Any brand ph buffer 7&#160; is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes, 500pk</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mL eppendorf tubes, 500pk</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-408-120</td>
			<td>Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.65&#181;m Ultrafree MC DV centrifugal filter units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC30DV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microcentrifuge tubes, 72 units</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 packing material (5 &#181;m, 100 &#197;)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>PM5/61100/000</td>
			<td>This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 packing material (5 &#181;m, 200 &#197;)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>PM5/61200/000</td>
			<td>This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced sample multiplexing of tissues using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cpilot)

病気の理解とバイオマーカー探索のために多くの生物学的サンプルを分析するための需要が高まっています。複数のサンプルの同時測定を可能に定量プロテオミクス戦略が普及し、大幅に実験的なコストと時間を削減しています。私たちの研究室では、伝統的な同位体ラベルまたはアイソバリックタグ付けアプローチのサンプル多重化を強化する同位体標識およびアイソバリックタグ（cPILOT）を組み合わせ、前駆体と呼ばれる技術を開発しました。グローバルcPILOTは、細胞、組織、体液、または生物全体に由来するサンプルに適用し、異なる試料条件を横切る相対タンパク質存在量に関する情報を提供することができます。 cPILOTは（ 材料/試薬の表を参照） を選択dimethylateペプチドのN末端に低pH緩衝液条件を使用し、2）市販のアイソバリック試薬とリジン残基の一級アミンを標識するために高pH緩衝液条件を使用して）1によって働きます。度利用可能なサンプルの多重化が使用される前駆体ラベルおよび同重体標識試薬の数に依存します。ここでは、1回の分析でのマウス組織からの12個のサンプルを分析するために六プレックスアイソバリック試薬と組み合わせ軽および重ジメチル化を使用して、12プレックス分析を提示します。強化多重化は、実験の時間とコストを削減し、より重要なことには、より少ない実験バイアスとエラーを有する多くのサンプル条件を横断比較（生物学的複製、病期、薬物治療、遺伝子型、又は長手方向時点）を可能にするために有用です。この作品では、グローバルcPILOTアプローチは、アルツハイマー病のモデルマウスと野生型対照からの生物学的複製を越え、脳、心臓、および肝臓組織を分析するために使用されます。グローバルcPILOTは、他の生物学的プロセスを研究するために適用され、20個の以上のサンプルにサンプル多重化を増大させるために適合させることができます。

cPILOTは、N末端およびリジン残基のラベルペプチドを化学的にアミン系化学物質を使用し、サンプル多重化機能を強化します。 図2は、アルツハイマー病のマウスモデルおよび野生型対照からの脳、心臓、および肝臓組織の12プレックスcPILOT分析から得られた代表的なMSデータを示します。 表1に示されているように、アルツハイマー病および?...

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Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

組み合わせ前駆同位体標識およびアイソバリックタグ（cPILOT）は、アイソバリックタグのサンプル多重化機能を強化し、定量プロテオミクス戦略です。このプロトコルは、アルツハイマー病のモデルマウスと野生型対照からの組織へのcPILOTの適用を説明しています。

拡張サンプル複合前駆同位体標識と同重体タグ付けを使用して組織の多重化（cPILOT）

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

タンパク質-RNA複合体の検出を向上させるための水平ゲル電気泳動

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

定圧ラベリング、豊富な液体クロマトグラフィー、質量分析法、およびソフトウェアによる定量化して深いプロテオームをプロファイリング

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

腎糸球体と腎糸球体細胞表面タンパク質の標識体内の分離

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

プロテオーム的分類の単一分子レベルでの均一性の定量化

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

タンパク質レベルの組織や標準化された定量ウェスタンブロットによる開発全体の堅牢な比較

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

背景散乱を最小限に抑えた高分子X線結晶学用オールインワンサンプルホルダー

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

自動ワークステーションを用いた質量分析のためのプラズマサンプル調製

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

細胞および組織におけるコエンザイムAの定量

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

哺乳類組織の富化とコレステロールを伴うゼノプス卵母細胞

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

支持浮遊ブロックを用いた透過電子顕微鏡におけるサンプル支持膜の作製

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...