Name: peptide scanning-assisted identification of a monoclonal antibody-recognized linear b-cell epitope
Uploaded: 2017-03-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope at JoVE.com

The authors thank Miss Ching-Chun Lin and Miss Diana Lin of the Core Facility of the Institute of Cellular and Organismic Biology (ICOB) of Academia Sinica for offering their expertise on peptide synthesis and DNA sequencing, respectively. This study was supported by Academia Sinica.

1. Приготовление моноклонального антитела <ol><li> Культура RG-M56 мышиные моноклональные гибридомные клетки 2 в среде без сыворотки в 175T колбах при температуре 37 ° С с 5% CO 2 дополнения. Собирают супернатант, когда цвет среды становится желтым после пяти дней инкубации. ...

<ol>
	<li>Milstein, C., Kohler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+variations+of+myelomatous+cells+(proceedings).">Clonal variations of myelomatous cells (proceedings).</a> Minerva Med. 68 (50), 3453 (1977).</li><li>Lai, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+neutralization+by+monoclonal+antibodies+against+yellow+grouper+nervous+necrosis+virus+(YGNNV)+and+immunolocalization+of+virus+infection+in+yellow+grouper+Epinephelus+awoara+(Temminck+&amp;+Schlegel).">In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper Epinephelus awoara (Temminck &amp; Schlegel).</a> J Fish Dis. 24 (4), 237-244 (2001).</li><li>Chen, C. W., Wu, M. S., Huang, Y. J., Cheng, C. A., Chang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+Linear+B-Cell+Epitope+of+Betanodavirus+Coat+Protein+by+RG-M18+Neutralizing+mAB+Inhibits+Giant+Grouper+Nervous+Necrosis+Virus+(GGNNV)+Infection.">Recognition of Linear B-Cell Epitope of Betanodavirus Coat Protein by RG-M18 Neutralizing mAB Inhibits Giant Grouper Nervous Necrosis Virus (GGNNV) Infection.</a> PLoS One. 10 (5), 0126121 (2015).</li><li>Lai, Y. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+yellow+grouper+nervous+necrosis+virus+(YGNNV)+in+a+new+nodavirus-susceptible+cell+line+from+yellow+grouper,+Epinephelus+awoara+(Temminck+&amp;+Schlegel),+brain+tissue.">Propagation of yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) in a new nodavirus-susceptible cell line from yellow grouper, Epinephelus awoara (Temminck &amp; Schlegel), brain tissue.</a> J Fish Dis. 24 (5), 299-309 (2001).</li><li>Lougee, E., Morjaria, S., Shaw, O., Collins, R., Vaughan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+HLA+typing+designed+for+solid+organ+transplantation:+epityping+and+its+application+to+the+HLA-A+locus.">A new approach to HLA typing designed for solid organ transplantation: epityping and its application to the HLA-A locus.</a> Int J Immunogenet. 40 (6), 445-452 (2013).</li><li>Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+gateway+system+for+double+shRNA+expression+and+Cre/lox+based+gene+expression.">Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression.</a> BMC Biotechnol. 11, 24 (2011).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method.">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> J Vis Exp. (6), e253 (2007).</li><li>Pronobis, M. I., Deuitch, N., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Miraprep:+A+Protocol+that+Uses+a+Miniprep+Kit+and+Provides+Maxiprep+Yields.">The Miraprep: A Protocol that Uses a Miniprep Kit and Provides Maxiprep Yields.</a> PLoS One. 11 (8), e0160509 (2016).</li><li>Metzker, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+technologies+in+DNA+sequencing.">Emerging technologies in DNA sequencing.</a> Genome Res. 15 (12), 1767-1776 (2005).</li><li>Chiu, C. C., John, J. A., Hseu, T. H., Chang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+ayu+(Plecoglossus+altivelis)+Pit-1+in+Escherichia+coli:+its+purification+and+immunohistochemical+detection+using+monoclonal+antibody.">Expression of ayu (Plecoglossus altivelis) Pit-1 in Escherichia coli: its purification and immunohistochemical detection using monoclonal antibody.</a> Protein Expr Purif. 24 (2), 292-301 (2002).</li><li>Atassi, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+structures+of+proteins.+Their+determination+has+revealed+important+aspects+of+immune+recognition+and+generated+strategies+for+synthetic+mimicking+of+protein+binding+sites.">Antigenic structures of proteins. Their determination has revealed important aspects of immune recognition and generated strategies for synthetic mimicking of protein binding sites.</a> Eur J Biochem. 145 (1), 1-20 (1984).</li><li>Opuni, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+epitope+mapping.">Mass spectrometric epitope mapping.</a> Mass Spectrom Rev. , (2016).</li><li>Chang, C. Y., Chiu, C. C., Christopher John, J. A., Liao, I. C., Lea&#241;o, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Aquaculture of Groupers. , 207-224 (2008).</li><li>Conti-Tronconi, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-bungarotoxin+and+the+competing+antibody+WF6+interact+with+different+amino+acids+within+the+same+cholinergic+subsite.">Alpha-bungarotoxin and the competing antibody WF6 interact with different amino acids within the same cholinergic subsite.</a> Biochemistry. 30 (10), 2575-2584 (1991).</li><li>Briggs, S., Price, M. R., Tendler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+specificity+of+antibody+recognition+of+carcinoma-associated+epithelial+mucins:+antibody+binding+to+synthetic+peptide+epitopes.">Fine specificity of antibody recognition of carcinoma-associated epithelial mucins: antibody binding to synthetic peptide epitopes.</a> Eur J Cancer. 29 (2), 230-237 (1993).</li><li>Chen, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structures+of+a+Piscine+Betanodavirus:+Mechanisms+of+Capsid+Assembly+and+Viral+Infection.">Crystal Structures of a Piscine Betanodavirus: Mechanisms of Capsid Assembly and Viral Infection.</a> PLoS Pathog. 11 (10), e1005203 (2015).</li><li>Badani, H., Garry, R. F., Wimley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+entry+inhibitors+of+enveloped+viruses:+The+importance+of+interfacial+hydrophobicity.">Peptide entry inhibitors of enveloped viruses: The importance of interfacial hydrophobicity.</a> Biochim Biophys Acta. , (2014).</li><li>Qureshi, N. M., Coy, D. H., Garry, R. F., Henderson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+putative+cellular+receptor+for+HIV-1+transmembrane+glycoprotein+using+synthetic+peptides.">Characterization of a putative cellular receptor for HIV-1 transmembrane glycoprotein using synthetic peptides.</a> AIDS. 4 (6), 553-558 (1990).</li></ol>

Этот протокол предлагает быстрый и простой метод для идентификации МАБ признан линейный эпитоп. Принимая во внимание стоимость пептидного синтеза и эффективности производства синтеза пептидов, антигенный участок белка вируса оболочки был уменьшен путем экспрессии последовательно ?...

В иммунной системе, рекомбинация сегментов V, D и J позволяет создавать антитела огромные вариации определяющие комплементарность области (CDR) , для связывания с различными антигенами , чтобы защитить хозяина от патогенных инфекций. Нейтрализатор защита антител против антигенов, зависит от пространственной комплементарности между CDRs антител и эпитопов антигенов. Таким образом, понимание этого молекулярного взаимодействия будет способствовать профилактический дизайн вакцин и терапевтический пептид наркотиков. Тем не менее, это взаимодействие нейтрализация может влиять как несколькими антигенные домены из одного антигена и множественными CDRs антител, которые, следовательно, делает процесс определения эпитопов более сложным. К счастью, развитие гибридомной технологии, которая плавит отдельные антитело-продуцирующих клеток с клетками миеломы, позволяет постоянно делящей партии клеток в сексплетение одно специфическое антитело, известное как моноклональное антитело (монАТ) 1. Клетки гибридомы производят эти чистые, высоким сродством мАт связываться с одного антигенного домена специфического антигена. При соотношении антиген-антитело, установленного несколько подходов, в том числе пептидов сканирования, могут быть использованы для определения эпитопа антигена с использованием его соответствующего мАт. Последние разработки в области синтетической пептидной технологии сделали метод пептидного сканирования более доступной и удобной для выполнения. Если коротко, то множество перекрывающихся синтетических пептидов, получают в соответствии с последовательностью антигена-мишени и связаны с твердой подложке мембраны для монАТ гибридизации. сканирование Пептид не только предлагает простой способ отображения антитела область связывания, но также облегчает аминокислоту (аа) мутагенеза с помощью сканирования остатка или замещения для оценки связывания взаимодействия между каждым аа остатком эпитопа пептида и CDR-антитела. <p cдеваха = &quot;jove_content&quot;&gt; Здесь, в настоящем исследовании описывается протокол для эффективной идентификации линейного эпитопа белка оболочки желтый группер вирус нервной некроз (YGNNV) с использованием нейтрализующего мАт 2, 3, 4. Протокол включает MAB подготовку, конструкции и экспрессии серийно усеченных рекомбинантных белков, синтетический перекрывающийся дизайн пептид, дот-блот-гибридизацию, сканирование аланин, а также заместительную мутагенеза. Принимая во внимание высокую стоимость синтеза пептидов, стадия последовательно усечения рекомбинантных белков желаемого целевого белка был изменен, и антигенную область была сужена до приблизительно 100 до 200 аминокислотных остатков, прежде чем синтетический пептид массив анализ дот-блот был проведен.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hybrid-SFM medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12045-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos&#39;s Phophate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21600-069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pfu DNA Polymerase&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>EP0502&#160;</td>
			<td>Including buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10799009001</td>
			<td>Including buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NdeI&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0111S</td>
			<td>Including buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td>Including buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-20b(+) vector</td>
			<td>Novagen, Merck Millipore</td>
			<td>69739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli DH-5&#945; competent cell</td>
			<td>RBC Bioscience</td>
			<td>RH617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli BL-21(DE3) competent cell</td>
			<td>RBC Bioscience</td>
			<td>RH217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0339-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth&#160;</td>
			<td>Invitrongen</td>
			<td>12780-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropylthio-&#946;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>MDBio, Inc.</td>
			<td>101-367-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>106009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20)</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>X251-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0167-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Affymetrix, USB</td>
			<td>75825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0241-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0105-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0854-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEL937001PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-055-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Agarose Fast Flow</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>16-266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVP BioSpectrum 600 Image System</td>
			<td>UVP</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8</td>
			<td>UVP</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyCycler thermal cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1709713</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

peptide scanning-assisted identification of a monoclonal antibody-recognized linear b-cell epitope

Идентификация антигенный эпитоп иммунной системой позволяет для понимания защитного механизма нейтрализующих антител, которые могут способствовать разработке вакцин и пептидных лекарственных средств. Сканирование Пептид представляет собой простой и эффективный метод, который отображает прямолинейно линейный эпитоп, распознаваемый моноклональным антителом (МАБ). Здесь авторы представляют методологию определения эпитопов с участием последовательно укороченные рекомбинантных белков, синтетический пептид дизайн и дот-блот-гибридизацию для антигенного распознавания нервного вируса некроза белка оболочки, используя нейтрализующий мАт. Этот метод основан на дот-блот-гибридизации синтетических пептидов и моноклональных антител на поливинилиденфторида (PVDF) мембрану. Минимальная антигенную область вирусного белка оболочки, признанной RG-М56 мАт может быть сужен на шаг за шагом отделан пептидный отображение на 6-мерный пептид эпитопа. Кроме того, аланин-сканирующий мутагенез и остаток субзаместительной может быть выполнена, чтобы характеризовать связывающую значимость каждого аминокислотного остатка, составляющих эпитоп. Были найдены остатки, фланкирующие сайт эпитоп играть решающую роль в регуляции пептидный конформации. Указанный эпитоп пептид может быть использован для образования кристаллов эпитипа пептидных-антитело для дифракции исследования рентгеновского и функциональной конкуренции, или для терапии.

Цель этого эксперимента заключалась в определении эпитоп через блоттинг с использованием мАт. Для того, чтобы быстро и эффективно сузить антигенный область признана мАт, полнометражный и серийно усеченные YGNNV рекомбинантные белки оболочки с слитого тегом 6xHis на С-кон...

Watch this Scientific Journal Video about Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope at JoVE.com

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

Here, the authors present a simple and efficient protocol to define a linear antigenic epitope using a purified monoclonal antibody and peptide scanning through dot-blot hybridization. The identified epitope can then be used in therapeutic and diagnostic applications.

Пептид Сканирование при содействии идентификации моноклональных антител узнаваемым Линейная B-клеточный эпитоп

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

The overall goal of this protocol is to identify a monoclonal antibody-recognized linear B-cell epitope using serially truncated recombinant proteins and peptide scanning by dot-blot hybridization. This method can help answer key questions concerning the molecule interaction between antigen and the antibody. The main advantages of this technique are its simplicity and efficiency.The identifying epitope can then be used in fuller investigations such as in therapeutical and diagnostic applications. Demonstrating the procedure will be Chien-Wen Chen, a post doctorate from my laboratory. To begin, grow RGM56 mouse monoclonal hybridoma cells in a hybrid serum free medium.Maintain cell cultures in 175 T flasks at 37 degrees Celsius 5%carbon dioxide. After five days of incubation, collect the culture medium after it has turned yellow and centrifuge the supernatant at 4, 500 times G for 30 minutes at four degrees Celsius. Then, discard the pelleted cell debris to obtain the antibody in solution.Next, add two milliliters of 50%protein G agro slurry to a five milliliter column and equilibrate the resin with 10 milliliters of ice cold PBS, equaling 10 volumes of preloaded resin. Load 200 milliliters of the previously prepared antibody solution onto the equilibrated column and discard the fraction that passes through the column. Using 10 milliliters of ice cold PBS, wash the column twice.Finally, to loot the antibody from the resin, add 10 milliliters of millimolar glycerin solution at pH 2.7 to the column. Collect 900 microliter fractions in microcentrifuge tubes previously filled with 100 microliters of 10X neutralization buffer. Store the purified antibody in 50%glycerol solution supplemented with sodium azide at minus 20 degrees Celsius.Prepare the constructs and transform E.coli BL21 cells as described in the text protocol. Then, transfer a single colony into a 15 milliliter tube containing three milliliters of LB broth supplemented with 100 micrograms per milliliter ampicillin and loosely cap the tube. Incubate the culture at 37 degrees Celsius with 150 RPM shaking.Monitor the optical density of the culture at 600 nanometers. When it reaches about 0.6, cool the culture to 25 degrees Celsius. Then, add IPTG at a final concentration of 0.4 millimolar to induce the expression of the recombinant protein.Incubate the culture for another four hours at 25 degrees Celsius with 200 RPM shaking. After incubation, transfer one milliliter of the bacterial culture into a microcentrifuge tube. Centrifuge the cells at 12, 000 times G for one minute and discard the supernatant.Pipetting up and down with a micropipette, resuspend the cell pellet in 100 microliters of denaturation buffer. And mix the resulting suspension by vigorous vortexing to obtain a ready to use recombinant protein sample. To proceed with dot-blot hybridization, dissolve each synthetic peptide in DMSO to obtain 10 milligram per milliliter solutions.Then, activate the PVDF membrane in methanol for two minutes and equilibrate it with modified Towbin buffer for another two minutes. Rinse a piece of chromatography paper with modified Towbin buffer and lay the equilibrated PVDF membrane on it. Let the membrane sit until the buffer disappears from its surface.Using a 10 microliter tip, add two microliters of each peptide or recombinant protein sample onto the membrane and let it air dry for 10 minutes. Spotting a symbol onto the membrane is the most critical step in this protocol. Loading a precise amount of a sample onto a small area of the PVDF membrane needs careful attention.Next, block the membrane in TBST buffer supplemented with 5%nonfat milk for 30 minutes at room temperature with gentle shaking. Dilute the RGM56 monoclonal antibody in TBST buffer supplemented with 5%nonfat milk. And add the antibody solution to the membrane.Incubate the membrane at 37 degrees Celsius for one hour with gentle shaking. After incubation, remove the antibody solution. And wash the membrane twice in TBST buffer for five minutes with gentle shaking.Then, add to the membrane the solution of the secondary antibody diluted in TBST buffer with 5%nonfat milk. Incubate the membrane for one hour at 37 degrees Celsius with gentle shaking. Upon incubation, discard the antibody solution and wash the membrane in TBST buffer twice for five minutes with gentle shaking.Then, develop the membrane with the substrate solution at room temperature for 15 minutes in the dark. When the signal appears, stop the reaction by washing the membrane with doubly distilled water. After air drying the membrane, capture the dot-blot image using an imaging system.Finally, using image analysis software measure the intensity of each dot-blot. Presented here is the full length nervous necrosis virus code protein comprising amino acids one through 338 along with its serially truncated variants. To confirm the expression of the proteins in the transformed bacterial cells, dot-blot analysis using anti-6XHis antibody was performed showing the presence of all the proteins under investigation.Then, the recombinant proteins were analyzed by dot-blot hybridization in which the RG-M56 monoclonal antibody was used. The analysis revealed that the protein epitope recognized by the antibody is found in peptide 195 to 338. Finally, an epitope consisting of 20 or eight amino acid residues was identified by peptide scanning.Alanine scanning showed that substitutions of valine residues at positions 197 and 199 as well as a cystine at 201 abolished the epitope's binding capability and dot-blot hybridization. Similarly, the decreased binding affinity was observed in binding intensity analysis confirming that the identified residues are essential for the epitope's binding to the RGM56 monoclonal antibody. This peptide identification technique can be used to develop therapeutical peptide drugs or peptide medicines.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

Пептиды: MHC тетрамеров на основе обогащения эпитопов Т-клеток

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

На основе пептидов идентификации функциональных мотивов и их партнерами по связыванию

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Выделение предшественника В-клеточных подмножеств из пуповинной крови

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Выделение, идентификация, и очистка мышиного тимуса эпителиальных клеток

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Генерация мышиных моноклональных антител с помощью гибридом технологии

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Анализ обезьяньего вируса иммунодефицита специфических CD8<sup&gt; +</sup&gt; Т-клетки в макак-резусов пептидными-MHC-I тетрамере Окрашивание

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Поколение побег вариантов нейтрализующих антител моноклональных вирус гриппа

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

Очистка вирусной ДНК для идентификации связанных вирусных и клеточных белков

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein

Перекрывающиеся пептид библиотека для сопоставления Qa-1 Epitopes в протеине

Qa-1 (HLA-E in human) belongs to a group of non-classical major histocompatibility complex 1b (MHC-Ib) molecules. Recent data suggest that Qa-1 molecules ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

Обнаружения диагностических Epitope Зика вирус

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...