Name: live imaging of antifungal activity by human primary neutrophils and monocytes in response to a. fumigatus
Uploaded: 2017-04-19T15:00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus at JoVE.com

मेडिकल माइकोलॉजी फफूंद इम्यूनोलॉजी (SFB, जेएमबी, जे, ऐडवर्ड्स) - यह काम एमआरसी और एबरडीन विश्वविद्यालय (मेडिकल माइकोलॉजी के लिए एमआरसी केंद्र) द्वारा और वेलकम ट्रस्ट सामरिक पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया है। एक विशेष धन्यवाद क्लो निधि से समर्थन करने के लिए दिया जाता है। टीएमएच स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (एनआईएच, कोड RO1 093,808) और मेमोरियल स्लोन केटरिंग कैंसर सेंटर से अनुदान एनआईएच अनुदान P30 CA008748 द्वारा समर्थित है द्वारा समर्थित है। साथ ही, टीएमएच संक्रामक रोग के रोगजनन बरोज़ वेलकम फंड द्वारा समर्थित में एक अन्वेषक है। हम उनकी मदद और समर्थन के लिए एबरडीन माइक्रोस्कोपी और प्रोटोकॉल सुविधा का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।

<ol>
	<li>Kosmidis, C., Denning, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+spectrum+of+pulmonary+aspergillosis.">The clinical spectrum of pulmonary aspergillosis.</a> Thorax. 70 (3), 270-277 (2015).</li><li>Warris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+pulmonary+Aspergillus+infections.">The biology of pulmonary Aspergillus infections.</a> J Infect. 69 (Suppl 1), S36-S41 (2014).</li><li>Henriet, S. 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B., Stockinger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+monocytes+and+derived+subsets+of+macrophages+and+dendritic+cells+by+the+HLDA10+monoclonal+antibody+panel.">Differentiation of human monocytes and derived subsets of macrophages and dendritic cells by the HLDA10 monoclonal antibody panel.</a> Clin Transl Immunology. 5 (1), e55 (2016).</li><li>Lewis, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage+specific+assessment+of+Candida+albicans+phagocytosis+by+macrophages+identifies+cell+wall+composition+and+morphogenesis+as+key+determinants.">Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants.</a> PLoS Pathog. 8 (3), e1002578 (2012).</li><li>Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+protection+against+conidia+by+mononuclear+and+against+mycelia+by+polymorphonuclear+phagocytes+in+resistance+to+Aspergillus.+Observations+on+these+two+lines+of+defense+in+vivo+and+in+vitro+with+human+and+mouse+phagocytes.">Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes.</a> J Clin Invest. 69 (3), 617-631 (1982).</li></ol>

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

इस विधि फ्लोरोसेंट एस्परजिलस रिपोर्टर (चमक) conidia, लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग ए fumigatus के खिलाफ मानव प्राथमिक फ़ैगोसाइट की ऐंटिफंगल गतिविधि का अध्ययन करने और प्रवाह cytometry के लिए इन विट्रो विधि में एक अभिनव वर्णन करता है। पिछले अध्ययनों से दोनों murine प्रयोगात्मक फंगल संक्रमण में विवो में और ऐंटिफंगल प्रतिरक्षा 6, 7 की इन विट्रो मूल्यांकन में चमक conidia का उपयोग करने का भी अतिरिक्त मूल्य का प्रदर्शन किया है। इस अगली पीढ़ी को लाइव सेल इमेजिंग तकनीक के साथ चमक conidia के संयोजन इन विट्रो में गतिशील बातचीत के दौरान अलग-अलग conidia की व्यवहार्यता को मापने के लिए एक सेटअप के लिए अनुमति देता है। वर्णित विधि संभावित उनके ऐंटिफंगल प्रतिक्रियाओं पर विशिष्ट भूमिकाओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के कुछ कोशिकीय प्रक्रियाओं के महत्व की जांच के लिए है। इसके अलावा, से पीड़ित विशिष्ट रोगियों से फ़ैगोसाइट की ऐंटिफंगल प्रतिक्रियाएंउनकी प्रतिरक्षा प्रणाली में परिभाषित एकल घटक दोष अधिक विस्तार में मूल्यांकन किया जा सकता। बहुत जल्दी और प्रारंभिक ऐंटिफंगल प्रतिक्रियाओं निरंतर इमेजिंग के 6 घंटे से अधिक महान विस्तार से अध्ययन किया जा सकता है। , Internalization दरों, कवकनाशी घटनाओं 12 है, जो पारंपरिक phagocytosis तरीकों का उपयोग कर समाधान के अयोग्य हो जाएगा की गतिशीलता इस तरह के कवक की ओर भक्षककोशिकीय प्रवास के वेग के रूप में, यहां तक कि सूक्ष्म अंतर का पता लगाया जा करने के लिए अनुमति देता है। किसी भी प्रकार की कोशिका इस विधि के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है; क्योंकि इन फ़ैगोसाइट ए fumigatus 13 के खिलाफ मानव वायुमार्ग में रक्षा की पहली और दूसरी लाइनों का गठन सेल यहां इस्तेमाल किया प्रकार चयन किया गया था। दिलचस्प बात यह है बहुत स्पष्ट मतभेद कैसे monocytes और न्यूट्रोफिल आराम और सूजन conidia और हाईफे के साथ संलग्न के बीच मनाया जा सकता है। Monocytes शायद ही जबकि न्यूट्रोफिल और अधिक प्रवासी गतिविधि प्रदर्शित, conidia के लिए चले जाते हैं। अतिरिक्त फ्लोरोसेंट मार्चइस तरह के प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर लाइव मृत मार्कर के रूप में kers भक्षककोशिकीय अस्तित्व एस्परजिलस के साथ बातचीत निम्नलिखित में अंतर्दृष्टि प्रदान करने परख में शामिल किया जा सकता है। इस तकनीक के लिए दिलचस्प संभावित भविष्य के अनुप्रयोगों विभिन्न प्रकार मेजबान सेल के सह संस्कृति, ऐंटिफंगल प्रतिक्रिया के लिए परिणाम शामिल हैं (उदाहरण के लिए, एक उपकला monolayer, monocyte व्युत्पन्न वृक्ष के समान न्यूट्रोफिल के साथ एक साथ कोशिकाओं पर मैक्रोफेज), और प्रतिक्रियाशील के वास्तविक समय माप ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन या न्युट्रोफिल कोशिकी जाल गठन एस्परजिलस साथ उत्तेजना के बाद। एक औंधा चरण के साथ एक खुर्दबीन, 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पर्यावरण कक्ष स्थिर, और उत्तेजना / dsRed (532/561 एनएम) और AF633 (के लिए उत्सर्जन फिल्टर: कुछ अंक इस प्रोटोकॉल, सबसे महत्वपूर्ण प्रयोगशाला आवश्यक सेटअप का उपयोग करने पर ध्यान दिया जाना करने की जरूरत है 633 एनएम)। माइक्रोस्कोप की क्षमता मीटर के दौरान विशेष रूप से प्रासंगिक ध्यान में कोशिकाओं रखने के लिए और तेल विसर्जन बनाए रखने के लिए (ulti सूत्री अधिग्रहण) इमेजिंग की लंबी अवधि के कारण समय-समय पर निगरानी की जानी चाहिए। कवकनाशी गतिविधि की मात्रा के लिए प्रवाह cytometry सुविधाओं की आवश्यकता है। साथ ही, उचित संस्थागत और नैतिक अनुमोदन जगह स्वस्थ दाता और रोगी व्युत्पन्न रक्त के नमूनों और आनुवंशिक रूप से चालाकी से कवक के साथ काम करने में होने की जरूरत है। यह दृढ़ता से ताजा रक्त के नमूने (एक ही दिन में उपयोग) का उपयोग करने के लिए सेल व्यवहार्यता बढ़ाने के लिए और कार्यक्षमता संरक्षित करने के लिए सिफारिश की है। आदर्श रूप में, कोशिकाओं के अलगाव रक्त के नमूने ड्राइंग के तुरंत बाद किया जाता है और neutrophils अलगाव के बाद तुरंत imaged कर रहे हैं। अंत में, एक अगली पीढ़ी को लाइव सेल इमेजिंग तकनीक काफी विस्तार भक्षककोशिकीय ऐंटिफंगल गतिविधि में आकलन करने के लिए के खिलाफ ए fumigatus वर्णन किया गया है। यह तकनीक एस्परजिलस के खिलाफ जल्दी सहज प्रतिरक्षा गढ़ में अलग-अलग सेल कवक बातचीत में एक अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं।

Aspergillus fumigatus एक अवसरवादी कवक रोगज़नक़ और प्रतिरक्षा में अक्षम मेजबान 1, 2 में आक्रामक फेफड़ों में संक्रमण का सबसे आम कवक कारण है। समझना कैसे मेजबान प्रतिरक्षा कोशिकाओं को पहचानने और एस्परजिलस को समाप्त फंगल अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र है, तथापि, वर्तमान में उपलब्ध कवकनाशी assays महत्वपूर्ण सीमाओं की है। कवकनाशी गतिविधि को मापने का आमतौर पर इस्तेमाल किया तरीकों वर्णमिति assays और कॉलोनी के गठन इकाइयों 3, 4 के निर्धारण में शामिल हैं। हालांकि, इस तरह के तरीकों से एक ही बार बिंदु पर नहीं बल्कि मेजबान और रोगज़नक़ के बीच गतिशील बातचीत को देखने की तुलना में फंगल व्यवहार्यता के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं। तदनुसार, इन तरीकों है कि क्या एक कवक मार दिया गया है या बस (अस्थायी) विकास या चयापचय गतिविधि में प्रतिबंधित खाते में नहीं ले सकते। हम एक विधि को देख fungici करने में सक्षम विकसित किया हैसीधे दाल गतिविधि, जबकि एक साथ phagocytosis, भक्षककोशिकीय प्रवास और कवक विकास के निषेध से संबंधित विस्तृत जानकारी पर कब्जा। इससे पहले, एक प्रोटोकॉल एक माउस बृहतभक्षककोशिका सेल लाइन 5 से कैंडिडा एल्बीकैंस के phagocytosis को मापने के लिए एक साधन के रूप में वास्तविक समय इमेजिंग का उपयोग प्रकाशित हुआ था। इस अवधारणा को अब फ्लोरोसेंट एस्परजिलस रिपोर्टर (चमक) conidia 6, 7, 8 का उपयोग करके प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ एस्परजिलस बातचीत की हमारी समझ में ज्ञान अंतर को पाटने का आगे विकसित किया गया। ये conidia एक लाल फ्लोरोफोरे (dsRed) व्यक्त करने और एक दूसरे फ्लोरोफोरे (एलेक्सा Fluor 633) के साथ लेबल रहे हैं। एक बार एक चमक conidium मार दिया जाता है, यह dsRed उत्पादन बंद हो जाता है और शेष dsRed fades, जबकि AF633 फ्लोरोसेंट और conidia के लिए बाध्य बनी हुई है। इस लाइव और मृत फू के बीच स्पष्ट अंतर पैदा करता हैलाइव सेल इमेजिंग के दौरान ngal कोशिकाओं और प्रवाह cytometry, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ उनकी बातचीत निम्न अलग-अलग conidia के भाग्य की ट्रैकिंग सक्षम बनाता है। वर्णित assays मेजबान प्रतिरक्षा कोशिकाओं और एस्परजिलस के बीच बातचीत के चित्रण के एक प्रभावी तरीका प्रदान करते हैं और सेलुलर संकेत दे रास्ते में सहज प्रतिरक्षक कोशिकाओं में ऐंटिफंगल प्रेरक तंत्र के लिए जिम्मेदार नहीं पायें में काफी मूल्य का होगा। अन्य अनुप्रयोगों visualizing कैसे इस तरह के सूजन conidia के लिए, या सूजन conidia से हाईफे के लिए आराम कर रहा से स्विच के रूप में एस्परजिलस विकास में परिवर्तन,, भक्षककोशिकीय मान्यता और समारोह को प्रभावित शामिल हैं। निम्नलिखित प्रोटोकॉल विस्तार मानव monocytes और neutrophils प्राप्त करने के लिए कैसे में वर्णन करता है; कैसे चमक conidia तैयार करने के लिए; और कैसे वीडियो माइक्रोस्कोपी के साथ अपनी प्रतिक्रिया पर कब्जा और प्रवाह cytometry के लिए। हालांकि मानव प्रतिरक्षा दाता रक्त से अलग कोशिकाओं के उपयोग यहाँ, इस वर्णन किया गया हैतकनीक murine सेल आबादी की एक किस्म का उपयोग समान रूप से प्रभावी साबित कर दी है।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="913">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G6279</td>
			<td style="width:411px;">http://www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T75 flask</td>
			<td style="width:167px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>658 175</td>
			<td>http://www.greinerbioone.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:167px;">Gibco</td>
			<td>20012-019</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween-80</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10592955</td>
			<td>https://nl.fishersci.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">40 &#181;m filter</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22363547</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">15 ml Falcon tube</td>
			<td style="width:167px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>188 261</td>
			<td>http://www.greinerbioone.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 ml Falcon tube</td>
			<td style="width:167px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>227 261</td>
			<td>http://www.greinerbioone.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MilliQ</td>
			<td style="width:167px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">QGARD00R1</td>
			<td>Nanopure water works similarly. http://www.merckmillipore.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biotin</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">B-6352</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D5879</td>
			<td style="width:411px;">http://www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Streptavidin-AF633</td>
			<td>Molecular Probes&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S-21375</td>
			<td>AF633 is the only tested fluorophore so far that remains visible in phagosomes. https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA blood tubes</td>
			<td style="width:167px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>455036</td>
			<td>Any blood tubes with an anti-coagulating agent should work. http://www.greinerbioone.com/en/start/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-1440-03</td>
			<td>http://www3.gehealthcare.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SV3008401</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HBSS</td>
			<td style="width:167px;">Gibco</td>
			<td>14170112&#160;</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:216px;">CD14 microbeads</td>
			<td style="width:167px;">Myltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-050-201</td>
			<td>Other monocyte isolation methods can be used as well, we prefer this method as it gives a consistent high purity of monocytes without being labor intensive. http://www.miltenyibiotec.com/en/</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:216px;">MS Columns</td>
			<td style="width:167px;">Myltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-201</td>
			<td>See comment at CD14 microbeads. http://www.miltenyibiotec.com/en/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RPMI + Glutamax</td>
			<td style="width:167px;">Gibco</td>
			<td>72400-021</td>
			<td style="width:411px;">https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CO2 independent medium</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18045054</td>
			<td>Necessary if there is not sufficient CO2 exchange during imaging. https://www.thermofisher.com/uk/en/home</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#181;-slide 8 well glass bottom</td>
			<td style="width:167px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">80827</td>
			<td>This is the imaging dish that we use, however any glass imaging dish of proper size should work. http://ibidi.com/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UltraVIEW VoX 3D Live Cell Imaging System</td>
			<td style="width:167px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">L7267000</td>
			<td>Includes volocity software for acquisition and analysis. http://www.perkinelmer.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Calcofluor white</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td>18909</td>
			<td style="width:411px;">http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Voriconazole</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td>PZ0005</td>
			<td style="width:411px;">http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BD LSRII</td>
			<td style="width:167px;">BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flowcytometer used. https://www.bdbiosciences.com/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of antifungal activity by human primary neutrophils and monocytes in response to a. fumigatus

Aspergillus fumigatus एक अवसरवादी कवक एक उच्च केस-मृत्यु दर के साथ प्रतिरक्षा में अक्षम मेजबान में आक्रामक संक्रमण के कारण रोगज़नक़ है। ए fumigatus के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की जांच रिसर्च इन विट्रो में विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिकाओं के ऐंटिफंगल गतिविधि को मापने के लिए सुसंगत और विश्वसनीय परीक्षणों की कमी के द्वारा सीमित किया गया है। एक नई विधि प्राथमिक monocytes और फ्लोरोसेंट एस्परजिलस रिपोर्टर (चमक) conidia का उपयोग कर ए fumigatus के खिलाफ मानव दाताओं से न्यूट्रोफिल की ऐंटिफंगल गतिविधि का आकलन करने के वर्णन किया गया है। ये conidia एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग dsRed संवाददाता, जो constitutively लाइव चमक conidia द्वारा व्यक्त किया जाता है, और बाह्य एलेक्सा Fluor 633 है, जो phagolysosome भीतर गिरावट के लिए प्रतिरोधी है, इस प्रकार लाइव और मृत ए fumigatus conidia के बीच एक अंतर की इजाजत दी का लेबल लगा होता है। वीडियो माइक्रोस्कोपी और फ्लो बाद में सहभागिता कल्पना करने के लिए उपयोग किया जाता हैconidia और सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच आयन, जबकि भी भक्षककोशिकीय प्रवास, phagocytosis और कवक विकास के निषेध पर जानकारी का खजाना उपलब्ध कराने कवकनाशी गतिविधि का आकलन। इस उपन्यास तकनीक पहले से ही ए fumigatus के खिलाफ प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं के मेजबान रोगज़नक़ बातचीत में रोमांचक नए अंतर्दृष्टि प्रदान की है। यह प्रयोगशाला इस परख करते हैं, आवश्यक माइक्रोस्कोपी सहित और सुविधाओं प्रवाह cytometry के लिए आवश्यक सेटअप, और क्षमता मानव दाता रक्त और आनुवंशिक रूप से चालाकी से कवक के साथ काम करने के लिए नोट करना महत्वपूर्ण है। हालांकि, इस परख डेटा की बड़ी मात्रा पैदा करने में सक्षम है और ऐंटिफंगल प्रतिक्रिया में विस्तृत जानकारी प्रकट कर सकते हैं। यह प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक ए fumigatus के खिलाफ प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं के मेजबान रोगज़नक़ बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। यह प्रयोगशाला आवश्यक माइक्रोस्कोपी सहित इस परख करने के लिए आवश्यक सेटअप, ध्यान दें और च प्रवाह cytometry के लिए महत्वपूर्ण हैacilities, और क्षमता मानव दाता रक्त और आनुवंशिक रूप से चालाकी से कवक के साथ काम करने के लिए। हालांकि, इस परख डेटा की बड़ी मात्रा पैदा करने में सक्षम है और ऐंटिफंगल प्रतिक्रिया में विस्तृत जानकारी प्रकट कर सकते हैं। यह प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक ए fumigatus के खिलाफ प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं के मेजबान रोगज़नक़ बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।

प्रतिनिधि परिणाम वर्णित प्रोटोकॉल निम्नलिखित दिखाए जाते हैं। चित्रा 1 मानव न्यूट्रोफिल और चमक conidia साथ एक प्रतिनिधि 6 घंटे लाइव सेल वीडियो दिखाता है। dsRed (लाल) conidia खुद को द्वारा व्यक्त की, जबकि वे AF633 (मैजेंटा) के साथ लेबल किया गया है है। चित्र 2 के रूप में चित्रा 1 में दिखाया गया है, लाइव और मृत चमक conidia के बीच अंतर को दर्शाता हुआ एक समान फिल्म से एक ही समय बिंदु से एक छवि है। मृत conidia उनके dsRed (लाल) संकेत खोने जबकि एक उज्ज्वल AF633 (मैजंटा) प्रतिदीप्ति बनाए रखने के द्वारा लाइव conidia से प्रतिष्ठित किया जाता है। ए fumigatus conidia अक्सर 6 घंटे के लिए फ़ैगोसाइट भीतर जीवित रहते हैं। इसलिए, प्रभावी ढंग से मौत हो गई अंदाजा लगाना, प्रवाह cytometry भूखंडों 3 चित्र में एक 16 घंटे ऊष्मायन अवधि के लिए दिखाए जाते हैं। यह आंकड़ा एक वायुकोशीय बृहतभक्षककोशिका ce साथ प्राप्त हुई थीलेकिन एक उदाहरण के रूप ll लाइन किसी भी प्रकार की कोशिका के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है। चित्रा 4 में प्रवास मानव न्यूट्रोफिल के लिए उत्तेजना के साथ ही उनके वेग और दिशात्मक आंदोलन के पहले घंटे में दिखाया गया है। चित्रा 5 न्यूट्रोफिल और monocytes कि 1, 2, 3 या उससे अधिक conidia किया जाता है चित्रा 6 कि हाईफे में उगना conidia की संख्या प्रदर्शित करता है, जबकि का प्रतिशत दिखाता है। <img alt="आकृति 1" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig1.jpg" /> चित्रा 1: लाइव सेल मानव न्यूट्रोफिल और चमक conidia की वीडियो माइक्रोस्कोपी फिल्म। न्यूट्रोफिल मानव रक्त से अलग और 1 के अनुपात में सीओ 2 स्वतंत्र माध्यम में चमक conidia साथ एक साथ वरीयता प्राप्त गया: क्रमश: 3,। इमेजिंग एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सीधे शुरू किया गया था। छवियाँ 6 घंटे की अवधि में 1 मिनट और 55 रों अंतराल पर कब्जा कर लिया गया। स्केल बार 10 सुक्ष्ममापी =।वीडियो में ज़ूम इन किया एक चैनल ऊपर बाईं ओर स्थित डीआईसी के साथ चमक conidia की भूमिका स्पष्ट करने के लिए अलग से दिखाया गया है, ऊपरी दाएँ भाग में dsRed (लाल), AF633 तल में (हरा) को छोड़ दिया और नीचे दाईं ओर मर्ज किए गए वीडियो । <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/Fig_1.avi">इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।</a> <img alt="चित्र 2" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig2.jpg" /> चित्र 2: एकल समय बिंदु छवि को लाइव और मृत चमक conidia के बीच अंतर का प्रदर्शन है। मानव न्यूट्रोफिल चमक conidia साथ प्रेरित और एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन के साथ imaged किया गया। एक छवि उत्पन्न फिल्मों से लिया गया था। संकेत करते हुए उनके AF633 प्रतिदीप्ति (: निचले-बाएं हरा) को बनाए रखने: मरे conidia उनके dsRed (ऊपरी दाएं लाल) खो रही द्वारा हाईफे से प्रतिष्ठित किया जाता है। <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig2large.jpg">कृपया यहाँ क्लिक करें</a><html> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने। <img alt="चित्र तीन" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig3.jpg" /> चित्र 3: मात्रा और phagocytosis और ए fumigatus conidia की हत्या के सत्यापन। voriconazole की उपस्थिति में 16 घंटे के लिए 1 अनुपात: माउस वायुकोशीय बृहतभक्षककोशिका कोशिकाओं (MH-एस) एक 1 पर चमक conidia साथ इनक्यूबेट रहे थे। MH-एस को लाइव conidia के साथ जुड़े कोशिकाओं लाल फाटक (dsRed + AF633 +) में दिखाया जाता है। MH-एस मृत conidia के साथ जुड़े कोशिकाओं नीले गेट (dsRed-AF633 +) में दिखाया जाता है। दर्शक MH-एस कोशिकाओं सोने गेट में दिखाया जाता है। Calcofluor सफेद, एक सेल अभेद्य फ्लोरोसेंट डाई कि कवक सेल दीवार को बांधता है, बाह्य conidia intracellular conidia से (Calcofluor व्हाइट +) (Calcofluor सफेद) भेद करने के लिए प्रयोग किया जाता है। विधि के लिए एक अतिरिक्त सत्यापन रूप में, यह 2 माइक्रोन cytochalasin डी के साथ कि इलाज MH-एस कोशिकाओं द्वारा conidial तेज रोकता दिखाया गया है।e.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig3large.jpg&quot;&gt;Please यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। <img alt="चित्रा 4" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig4.jpg" /> चित्र 4: मानव न्यूट्रोफिल और ए fumigatus conidia के खिलाफ monocytes के प्रवासन। न्यूट्रोफिल मानव रक्त से अलग और 1 के अनुपात में सीओ 2 स्वतंत्र माध्यम में चमक conidia साथ एक साथ वरीयता प्राप्त गया: क्रमश: 3,। इमेजिंग एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सीधे शुरू किया गया था। छवियाँ 6 घंटे की अवधि में 1 मिनट और 55 रों अंतराल पर कब्जा कर लिया गया। क्षेत्र के अनुसार सभी व्यक्तिगत मानव न्यूट्रोफिल के प्रवासन मैन्युअल 1 घंटे के लिए (ए) और सूजन (बी) conidia आराम के खिलाफ ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर का प्रयोग करके ट्रैक किया गया था। डाटा एक ही दाता से प्रत्येक हालत के लिए कोशिकाओं की 1 फ्रेम प्रतिनिधित्व करता है। घुमावदार कारक (सी), directio का एक उपायएनएएल आंदोलन, और वेग (डी) तो थे ही सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मात्रा निर्धारित। ± SEM मतलब 3 दाताओं के लिए 2 स्वतंत्र प्रयोगों से अधिक दाता प्रति 30 कोशिकाओं के साथ दिखाए जाते हैं। *: P &lt;0.05 (वेल्श की सुधारा टी परीक्षण)। <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig4large.jpg">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> <img alt="चित्रा 5" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig5.jpg" /> चित्र 5: मानव न्यूट्रोफिल और monocytes द्वारा ए fumigatus conidia के phagocytosis। , 3 क्रमश: न्यूट्रोफिल और monocytes मानव रक्त से अलग और सीओ 2 स्वतंत्र माध्यम में चमक conidia साथ एक साथ वरीयता प्राप्त 1 के अनुपात में किया गया। इमेजिंग एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सीधे शुरू किया गया था। छवियाँ 6 घंटे की अवधि में 1 मिनट और 55 रों अंतराल पर कब्जा कर लिया गया। Phagocytosis कोशिकाओं होते हैं की राशि के रूप में मापा गया थाउत्तेजना के 4 घंटे के बाद चमक conidia ing। डाटा 3 दाताओं और 2 स्वतंत्र प्रयोगों से अधिक दाता प्रति 3 फ्रेम से SEM ± मतलब के रूप में प्रस्तुत किया है। <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig5large.jpg">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> <img alt="चित्रा 5" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig6.jpg" /> चित्र 6: न्यूट्रोफिल और monocytes द्वारा ए fumigatus conidia के अंकुरण का निषेध। , 3 क्रमश: न्यूट्रोफिल और monocytes मानव रक्त से अलग और सीओ 2 स्वतंत्र माध्यम में चमक conidia साथ एक साथ वरीयता प्राप्त 1 के अनुपात में किया गया। इमेजिंग एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सीधे शुरू किया गया था। छवियाँ 6 घंटे की अवधि में 1 मिनट और 55 रों अंतराल पर कब्जा कर लिया गया। फंगल अंकुरण के निषेध कि रोगाणु था conidia के प्रतिशत को मापने के द्वारा जांच की गईके बाद सह संस्कृति के 2, 4 और 6 ज inated। डाटा 3 दाताओं और 2 स्वतंत्र प्रयोगों से अधिक दाता प्रति 3 फ्रेम से SEM ± मतलब के रूप में प्रस्तुत किया है। <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig6large.jpg">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>

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Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

यहाँ, हम लाइव सेल वीडियो माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन के रूप में फ्लोरोसेंट एस्परजिलस संवाददाता conidia का उपयोग कर वास्तविक समय में प्राथमिक मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं के ऐंटिफंगल गतिविधि का आकलन और प्रवाह cytometry के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन। उत्पन्न डेटा ऐसे कवकनाशी गतिविधि, phagocytosis, सेल प्रवास और कवक विकास के निषेध के रूप में मेजबान सेल एस्परजिलस बातचीत में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं।

के जवाब में मानव प्राथमिक न्यूट्रोफिल और Monocytes द्वारा रोधी गतिविधि का लाइव इमेजिंग<em&gt; एक। fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

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