Name: live imaging of antifungal activity by human primary neutrophils and monocytes in response to a. fumigatus
Uploaded: 2017-04-19T15:00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus at JoVE.com

Эта работа была поддержана MRC и Университета Абердина (MRC Центр медицинской микологии) и в Wellcome Trust Стратегическим Award - медицинской микологии грибной Immunology (SFB, JMB, JK, AW). Особую благодарность уделяется поддержке фонда Chloe. TMH поддерживается грантом Национального института здоровья (NIH, код RO1 093808) и Кеттеринг онкологического центра Memorial Sloan поддерживается NIH грант P30 CA008748. Кроме того, ТМЙ является исследователем в патогенезе инфекционных заболеваний при поддержке Wellcome Фонда Burroughs. Мы хотели бы поблагодарить Aberdeen Микроскопия и гистология фонд за их помощь и поддержку.

<ol>
	<li>Kosmidis, C., Denning, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+spectrum+of+pulmonary+aspergillosis.">The clinical spectrum of pulmonary aspergillosis.</a> Thorax. 70 (3), 270-277 (2015).</li><li>Warris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+pulmonary+Aspergillus+infections.">The biology of pulmonary Aspergillus infections.</a> J Infect. 69 (Suppl 1), S36-S41 (2014).</li><li>Henriet, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+leukocytes+kill+Aspergillus+nidulans+by+reactive+oxygen+species-independent+mechanisms.">Human leukocytes kill Aspergillus nidulans by reactive oxygen species-independent mechanisms.</a> Infect Immun. 79 (2), 767-773 (2010).</li><li>Sheppard, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+methodologies+for+the+determination+of+pulmonary+fungal+burden+in+experimental+murine+aspergillosis.">Comparison of three methodologies for the determination of pulmonary fungal burden in experimental murine aspergillosis.</a> Clin Microbiol Infect. 12 (4), 376-380 (2006).</li><li>Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+video+microscopy+of+fungal+pathogen+phagocytosis.">Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis.</a> J Vis Exp. (71), e50196 (2013).</li><li>Heung, L. J., Jhingran, A., Hohl, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deploying+FLAREs+to+Visualize+Functional+Outcomes+of+Host-Pathogen+Encounters.">Deploying FLAREs to Visualize Functional Outcomes of Host-Pathogen Encounters.</a> PLoS Pathog. 11 (7), e1004912 (2015).</li><li>Jhingran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+conidial+fate+and+measuring+host+cell+antifungal+activity+using+a+reporter+of+microbial+viability+in+the+lung.">Tracing conidial fate and measuring host cell antifungal activity using a reporter of microbial viability in the lung.</a> Cell Rep. 2 (6), 1762-1773 (2012).</li><li>Espinosa, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+orchestrate+innate+antifungal+immunity+in+the+lung.">Inflammatory monocytes orchestrate innate antifungal immunity in the lung.</a> PLoS Pathog. 10 (2), e1003940 (2014).</li><li>English, D., Andersen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+step+separation+of+red+blood+cells,+granulocytes+and+mononuclear+leukocytes+on+discontinuous+density+gradient+of+ficoll+hypaque.">Single step separation of red blood cells, granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradient of ficoll hypaque.</a> J Immunol Met. 5 (3), 249-252 (1974).</li><li>Shimizu, K., Keller, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+involvement+of+a+cAMP-dependent+protein+kinase+in+a+G+protein+signaling+pathway+regulating+morphological+and+chemical+transitions+in+Aspergillus+nidulans.">Genetic involvement of a cAMP-dependent protein kinase in a G protein signaling pathway regulating morphological and chemical transitions in Aspergillus nidulans.</a> Genetics. 157 (2), 591-600 (2001).</li><li>Ohradanova-Repic, A., Machacek, C., Fischer, M. B., Stockinger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+monocytes+and+derived+subsets+of+macrophages+and+dendritic+cells+by+the+HLDA10+monoclonal+antibody+panel.">Differentiation of human monocytes and derived subsets of macrophages and dendritic cells by the HLDA10 monoclonal antibody panel.</a> Clin Transl Immunology. 5 (1), e55 (2016).</li><li>Lewis, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage+specific+assessment+of+Candida+albicans+phagocytosis+by+macrophages+identifies+cell+wall+composition+and+morphogenesis+as+key+determinants.">Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants.</a> PLoS Pathog. 8 (3), e1002578 (2012).</li><li>Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+protection+against+conidia+by+mononuclear+and+against+mycelia+by+polymorphonuclear+phagocytes+in+resistance+to+Aspergillus.+Observations+on+these+two+lines+of+defense+in+vivo+and+in+vitro+with+human+and+mouse+phagocytes.">Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes.</a> J Clin Invest. 69 (3), 617-631 (1982).</li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Этот метод описывает инновационный метод в пробирке для изучения противогрибковой активности первичных фагоцитов человека против A. fumigatus с использованием флуоресцентного Aspergillus репортерного (FLARE) конидии, изображений живых клеток и проточной цитометрией. Предыдущие исследования продемонстрировали добавленную стоимость использования FLARE конидии как в естественных условиях в мышиной экспериментальной грибковой инфекции и в пробирке оценки противогрибкового иммунитета 6, 7. Сочетание FLARE конидии с этой техникой визуализации клеток следующего поколения живой позволяет задать для измерения жизнеспособности индивидуальных конидий во время динамических взаимодействий в пробирке. Описанный метод имеет потенциал, чтобы исследовать конкретные роли и важность определенных клеточных процессов иммунных клеток на их противогрибковых ответы. Кроме того, противогрибковые реакции фагоцитов от конкретных пациентов, страдающих отопределенные единичные дефекты компонентов в их иммунной системе могут быть оценены более подробно. Очень ранние и начальные противогрибковые ответы могут быть подробно изучены в течение 6 часов непрерывной съемки. Это позволяет даже тонкие различия , чтобы быть обнаружены, например, скорость миграции фагоцитов к грибку, скорость интернализации, динамика фунгицидных событий 12, которые были бы неотличимо с использованием традиционных методов фагоцитоза. Любой тип клеток может быть использован с помощью этого метода; типы клеток , используемые здесь , были выбраны потому , что эти фагоциты представляют собой первую и вторую линию обороны в человеческих дыхательных путях против A. fumigatus 13. Интересно, что очень четкие различия можно наблюдать между тем, как моноциты и нейтрофилы заниматься с отдыха и опухшие конидий и гиф. Моноциты едва ли переходить на конидии, в то время как нейтрофилы отображать гораздо больше миграционную активность. Дополнительный флуоресцентный МарKERS , такие как живые умерших маркеры на иммунные клетки может быть включен в анализе , чтобы дать ответ на выживание фагоцитарного следующего взаимодействия с Aspergillus. Интересные возможности применения в будущем для этой технологии включают в себя совместное культивирование различных типов клеток хозяина, последствия для противогрибковых реакций (например, макрофаги на эпителиального монослоя, моноцитов дендритные клетки вместе с нейтрофилами), а также измерения в реальном масштабе времени реактивная производство форм кислорода или нейтрофилы образование внеклеточной ловушки после стимуляции Aspergillus. Несколько моментов необходимо отметить, чтобы использовать этот протокол, в первую очередь лабораторной установки требуемого: микроскоп с инвертированной стадии, климатическую камеру стабильной при температуре 37 ° C, и возбуждение / фильтры выбросов для DsRed (532/561 нм) и AF633 ( 633 нм). Способность микроскопа, чтобы сохранить клетки в фокусе и сохранить масло погружения (особенно актуально в мUlti-точка сбора) следует периодически контролировать из-за большой продолжительности визуализации. Для количественного определения фунгицидной активности проточной цитометрии средства требуются. Кроме того, соответствующие институциональные и этические допуски должны быть на месте, чтобы работать с здоровым донором и пациентом получены образцами крови и генетически измененными грибами. Настоятельно рекомендуется использовать свежие образцы крови (использование в тот же день), чтобы повысить жизнеспособность клеток и сохранить функциональность. В идеале, изоляция клеток выполняются сразу же после нанесения образцов крови и нейтрофилы изображаются сразу после изоляции. В заключении следует отметить, метод визуализации живых клеток следующего поколения для оценки в большой противогрибковой активности подробно фагоцитов против A. fumigatus описано. Эта технология может обеспечить уникальное понимание отдельных клеточными грибковыми взаимодействий в ранней врожденной иммунной защите против Aspergillus.

Аспергилл дымящийся является оппортунистическим грибковым патогеном и наиболее распространенной причиной грибковой инвазивных легочных инфекций в ослабленном иммунитете хост 1, 2. Понимание того, как клетки иммунной системы хозяина распознавать и элиминировать Aspergillus является важной областью грибкового исследования, однако, имеющиеся в настоящее время фунгицидных анализы имеют существенные ограничения. Обычно используемые способы измерения фунгицидной активности , включают колориметрические анализы и определение колониеобразующих единиц 3, 4. Однако такие методы дают информацию о грибковой жизнеспособности в одной точке времени, а не просмотр динамического взаимодействия между хостом и патогеном. Соответственно, эти методы не могут принимать во внимание, был ли грибок был убит или просто (временно) ограничены в росте или метаболической активности. Мы разработали метод, способный наблюдающей fungiciДаль деятельность непосредственно и одновременно захватывая подробную информацию о фагоцитозе, миграции фагоцитов и ингибирование роста грибов. Ранее протокол был опубликован с помощью визуализации в режиме реального времени в качестве средства для измерения фагоцитоз Candida Albicans с помощью клеточной линии мыши макрофагальной 5. Эта концепция в настоящее время разработана для решения дополнительно разрыва в знаниях в нашем понимании Aspergillus взаимодействия с иммунными клетками с использованием флуоресцентного Aspergillus репортерного (FLARE) конидии 6, 7, 8. Эти конидии выражают красный флуорофор (DsRed) и помечены со вторым флуорофоры (Alexa Fluor 633). После того, как FLARE конидии убита, он прекращает производить Dsred и остальной Dsred затухает, в то время как AF633 остается флуоресцентным и связанным с конидиями. Это создает четкое различие между живой и мертвой фуNGAL клетки во время получения изображений живых клеток и проточная цитометрии, а также позволяет отслеживать судьбы отдельных конидий после их взаимодействия с иммунными клетками. Описанные анализы обеспечивают эффективный метод визуализации взаимодействия между принимающей иммунными клетками и Aspergillus , и будут иметь существенное значение в разгадке пути клеточной сигнализации , ответственный за противогрибковые эффекторные механизмы в врожденных иммунных клетках. Другие приложения включают визуализации , как изменения в росте Aspergillus, такие как переход от покоя к набухшим конидиям, или из набухших конидий гифа, влияют на распознавание и фагоцитарной функцию. Следующий протокол подробно описывает, как получить человеческие моноциты и нейтрофилы; как подготовить FLARE конидии; и как захватить их ответы с видеомикроскопии и проточной цитометрии. Хотя использование иммунных клеток человека, выделенные из донорской крови, описано здесь, этометодика доказала одинаково эффективна с использованием различных популяций мышиных клеток.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="913">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G6279</td>
			<td style="width:411px;">http://www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T75 flask</td>
			<td style="width:167px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>658 175</td>
			<td>http://www.greinerbioone.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:167px;">Gibco</td>
			<td>20012-019</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween-80</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10592955</td>
			<td>https://nl.fishersci.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">40 &#181;m filter</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22363547</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">15 ml Falcon tube</td>
			<td style="width:167px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>188 261</td>
			<td>http://www.greinerbioone.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 ml Falcon tube</td>
			<td style="width:167px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>227 261</td>
			<td>http://www.greinerbioone.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MilliQ</td>
			<td style="width:167px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">QGARD00R1</td>
			<td>Nanopure water works similarly. http://www.merckmillipore.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biotin</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">B-6352</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D5879</td>
			<td style="width:411px;">http://www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Streptavidin-AF633</td>
			<td>Molecular Probes&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S-21375</td>
			<td>AF633 is the only tested fluorophore so far that remains visible in phagosomes. https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA blood tubes</td>
			<td style="width:167px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>455036</td>
			<td>Any blood tubes with an anti-coagulating agent should work. http://www.greinerbioone.com/en/start/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-1440-03</td>
			<td>http://www3.gehealthcare.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SV3008401</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HBSS</td>
			<td style="width:167px;">Gibco</td>
			<td>14170112&#160;</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:216px;">CD14 microbeads</td>
			<td style="width:167px;">Myltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-050-201</td>
			<td>Other monocyte isolation methods can be used as well, we prefer this method as it gives a consistent high purity of monocytes without being labor intensive. http://www.miltenyibiotec.com/en/</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:216px;">MS Columns</td>
			<td style="width:167px;">Myltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-201</td>
			<td>See comment at CD14 microbeads. http://www.miltenyibiotec.com/en/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RPMI + Glutamax</td>
			<td style="width:167px;">Gibco</td>
			<td>72400-021</td>
			<td style="width:411px;">https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CO2 independent medium</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18045054</td>
			<td>Necessary if there is not sufficient CO2 exchange during imaging. https://www.thermofisher.com/uk/en/home</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#181;-slide 8 well glass bottom</td>
			<td style="width:167px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">80827</td>
			<td>This is the imaging dish that we use, however any glass imaging dish of proper size should work. http://ibidi.com/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UltraVIEW VoX 3D Live Cell Imaging System</td>
			<td style="width:167px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">L7267000</td>
			<td>Includes volocity software for acquisition and analysis. http://www.perkinelmer.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Calcofluor white</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td>18909</td>
			<td style="width:411px;">http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Voriconazole</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td>PZ0005</td>
			<td style="width:411px;">http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BD LSRII</td>
			<td style="width:167px;">BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flowcytometer used. https://www.bdbiosciences.com/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of antifungal activity by human primary neutrophils and monocytes in response to a. fumigatus

Аспергилл дымящийся является оппортунистическим грибковым возбудителем инвазивных инфекций у иммунодефицитов с высокой летальностью. Исследования исследования иммунологических реакций против А. fumigatus было ограничено отсутствием последовательных и надежных тестов для измерения противогрибковой активности специфических иммунных клеток в пробирке. Новый метод описан для оценки противогрибковой активности первичных моноцитов и нейтрофилов у людей - доноров против A. fumigatus с использованием флуоресцентного Aspergillus репортерной (FLARE) конидии. Эти конидии содержат генетически кодируемый репортер DsRed, который экспрессируется живыми FLARE конидий и внешне меченный Alexa Fluor 633, который является устойчивым к деградации в пределах фаголизосомы, что позволяет проводить различие между живой и мертвой А. fumigatus конидиями. Видео микроскопии и проточной цитометрии впоследствии используется для визуализации взаимодействуютиона между конидий и врожденных иммунных клеток, оценка фунгицидной активностью в то же время обеспечивая большое количество информации о миграции фагоцитов, фагоцитоз и ингибирования грибкового роста. Этот новый метод уже представил новые захватывающие идеи в хост-патоген взаимодействия первичных иммунных клеток против A. fumigatus. Важно отметить установку лаборатории, необходимые для выполнения этого анализа, в том числе необходимые микроскопии и проточной цитометрии объектов, а также способность работать с кровью человека-донора и генетически измененных грибов. Тем не менее, этот анализ может генерировать большие объемы данных и может выявить подробное понимание противогрибкового ответ. Этот протокол был успешно использован для изучения хозяин-патоген взаимодействия первичных иммунных клеток против A. fumigatus. Важно отметить установку лабораторного, необходимое для выполнения этого анализа, в том числе необходимой микроскопии и проточной цитометрии Facilities, а также способность работать с кровью человека-донора и генетически измененных грибов. Тем не менее, этот анализ может генерировать большие объемы данных и может выявить подробное понимание противогрибкового ответ. Этот протокол был успешно использован для изучения хозяин-патоген взаимодействия первичных иммунных клеток против A. fumigatus.

Типичные результаты показаны после описанного протокола. Рисунок 1 иллюстрирует типичную 6 ч видео живых клеток с человеческими нейтрофилами и гиперемии конидий. Dsred (красный) выражается сами конидий в то время как они были помечены AF633 (Magenta). Фиг.2 представляет собой изображение с одной точки времени от аналогичного фильма , как показано на рисунке 1, иллюстрирующий разницу между живой и мертвой FLARE конидий. Мертвые конидии отличаются от живых конидий, теряя их сигнал DsRed (красный), сохраняя при этом ярко-AF633 (пурпурный) флуоресценции. A. fumigatus конидий часто выживают в фагоцитах для более 6 ч. Поэтому, чтобы эффективно убить количественно, проточной цитометрии участки показаны на 16 ч периода инкубации на рисунке 3. Эти данные были получены с альвеолярного макрофага сеLL линия в качестве примера, но может быть выполнена с любым типом клеток. На рисунке 4 показана миграция в первый час стимуляции для нейтрофилов человека, а также их скорости и направленного движения. На фиг.5 показан процент нейтрофилов и моноцитов , которые глотавшие 1, 2, 3 или более конидии , а на рис 6 показывают количество конидий , которые прорастают в гифы. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig1.jpg" /> Рисунок 1: Live-клеточной видеомикроскопия фильм нейтрофилов человека и FLARE конидий. Нейтрофилы были выделены из человеческой крови и высевали совместно с FLARE конидиями в CO 2 , независимой среде при соотношении 1: 3, соответственно. Визуализация инициировали непосредственно при температуре 37 ° C с вращающимся диском конфокальной микроскопией. Изображения были получены с интервалом 1 мин и 55 сек в течение 6 ч. Шкала бар = 10 мкм.Увеличенной в видео показано с каналами, разделенными уточнить роль FLARE конидий с DIC в верхнем левом углу, DsRed (красный) в правом верхнем углу, AF633 (зеленый) в нижнем левом углу, и объединенное видео в правом нижнем углу , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/Fig_1.avi">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/Fig_1.avi">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/Fig_1.avi">чтобы загрузить это видео.</a> <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig2.jpg" /> Рисунок 2: Один момент времени изображение демонстрирует разницу между живой и мертвой FLARE конидий. Человеческие нейтрофилы стимулировали FLARE конидий и визуализируют с помощью вращающегося диска конфокальной микроскопии. Изображение было взято из сгенерированных фильмов. Мертвые конидии отличаются от гиф путем потеряв DsRed (красный: верхний правый) сигнала при сохранении их флуоресценции AF633 (зеленый: внизу слева). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig2large.jpg">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig2large.jpg">нажмите здесь</a><html> просмотреть большую версию этой фигуры. <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig3.jpg" /> Рисунок 3: Количественные и проверка фагоцитоза и уничтожению А. fumigatus конидий. Mouse альвеолярных макрофагов клетки (MH-S), инкубировали с FLARE конидий в соотношении 1: 1 в течение 16 ч в присутствии вориконазола. MH-S клетка, связанная с живыми конидий показана в красных воротах (DsRed + AF633 +). MH-S клетка, связанная с мертвыми конидий показана в синих воротах (DsRed-AF633 +). Bystander MH-S клетки показаны в золотой ворот. Calcofluor Белые, клетка непроницаемой флуоресцентный краситель, который связывается с грибковой клеточной стенкой, используются, чтобы отличить внеклеточные конидии (Calcofluor белый +) из внутриклеточных конидий (Calcofluor Белый-). В качестве дополнительной проверки на метод, было показано, что лечение с 2 мкМ цитохалазина D ингибирует конидии поглощения клеток МН-S.e.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig3large.jpg&quot;&gt;Please нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig4.jpg" /> Рисунок 4: Миграция человека нейтрофилов и моноцитов против А. fumigatus конидий. Нейтрофилы были выделены из человеческой крови и высевали совместно с FLARE конидиями в CO 2 , независимой среде при соотношении 1: 3, соответственно. Визуализация инициировали непосредственно при температуре 37 ° C с вращающимся диском конфокальной микроскопией. Изображения были получены с интервалом 1 мин и 55 сек в течение 6 часов. Миграция всех индивидуальных человеческих нейтрофилов в поле было вручную с помощью отслеживания программного обеспечения против покоя (А) и набухший (B) конидии в течение 1 часа. Данные представляют 1 кадр ячеек для каждого состояния одного и того же донора. Извилистый фактор (С), меры directioNAL движение, и скорость (D) , затем были количественно с использованием того же программного обеспечения. Среднее ± SEM для 3 доноров, показаны с 30 клетками на донор более 2-х независимых экспериментов. *: Р &lt;0,05 (Уэлч исправлены т тест). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig4large.jpg">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig4large.jpg">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig4large.jpg">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 5" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig5.jpg" /> Рисунок 5: Фагоцитоз А. fumigatus конидий человеческих нейтрофилов и моноцитами. Нейтрофилы и моноциты выдел ли из крови человека и высевали совместно с FLARE конидий в CO 2 , независимой среде при соотношении 1: 3, соответственно. Визуализация инициировали непосредственно при температуре 37 ° C с вращающимся диском конфокальной микроскопией. Изображения были получены с интервалом 1 мин и 55 сек в течение 6 ч. Фагоцитоз измеряли как количество клеток содержатING FLARE конидии через 4 ч после стимуляции. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM от 3 доноров и 3 кадра в донор более 2-х независимых экспериментов. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig5large.jpg">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig5large.jpg">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig5large.jpg">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 5" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig6.jpg" /> Рисунок 6: Ингибирование прорастания конидий A. fumigatus нейтрофилами и моноцитами. Нейтрофилы и моноциты выдел ли из крови человека и высевали совместно с FLARE конидий в CO 2 , независимой среде при соотношении 1: 3, соответственно. Визуализация инициировали непосредственно при температуре 37 ° C с вращающимся диском конфокальной микроскопией. Изображения были получены с интервалом 1 мин и 55 сек в течение 6 часов. Ингибирование грибного прорастания исследовали путем измерения процентного содержания конидий, которые имели зародышщаемые после 2, 4 и 6 ч совместной культуры. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM от 3 доноров и 3 кадра в донор более 2-х независимых экспериментов. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig6large.jpg">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig6large.jpg">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig6large.jpg">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus at JoVE.com

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Здесь мы опишем протокол для оценки противогрибковой активности первичных иммунных клеток человека в режиме реального времени с использованием флуоресцентного Aspergillus репортера конидии в сочетании с живой клеткой видеомикроскопией и проточной цитометрией. Сгенерированные данные дают представление о хозяине клеточно Aspergillus взаимодействий , таких как фунгицидная активность, фагоцитоз, миграции клеток и ингибирование роста грибов.

Живая съемка противогрибковой активности на человеке первичных нейтрофилов и моноцитах в ответ на<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Оценка устьичного Ответ на живые бактериальные клетки с использованием полного изображения листьев

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Простой и эффективный метод для обнаружения ядерных активация фактора в человеческих нейтрофилов с помощью проточной цитометрии

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Выделение моноцитов человека, дважды градиентного центрифугирования и их дифференциации с макрофагами в тефлоновым покрытием культуре клеток Сумки

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Выделение и внутривенное введение мышиных костного мозга моноцитов

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Воображение нейтрофилов и моноцитов в брыжеечных вен Прижизненное микроскопии на наркотизированных мышей в реальном времени

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Фагосоме Миграция и скорость, измеренная в живых первичных макрофагах человека, инфицированных ВИЧ-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flow Cytometric Анализ естественных клеток-киллеров литической активности в человеческой цельной крови

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Малые РНК Трансфекция в первичных человеческих Th17 клеток с помощью следующего поколения электропорации

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Изоляция, Трансфекция и культура первичных человеческих моноцитов

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...

Implantation and Monitoring by PET/CT of an Orthotopic Model of Human Pleural Mesothelioma in Athymic Mice

Имплантация и мониторинг ПЭТ/КТ ортотопической модели плевральной мезотелиомы человека у атимических мышей

Malignant pleural mesothelioma (MPM) is a rare and aggressive tumor arising in the mesothelium that covers the lungs, the heart, and the thoracic cavity. ...