Name: invasive behavior of human breast cancer cells in embryonic zebrafish
Uploaded: 2017-04-25T15:00:00
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Untersuchungen an TGF-β-Familie Mitglieder werden vom Cancer Genomics Center Niederlanden unterstützt. Sijia Liu und Jiang Ren werden von der China Scholarship Council für 4 Jahre Studium an der Universität von Leiden unterstützt. Wir danken Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) für die MCF10A Zelllinien.

Alle Forschung , um den transgenen fluoreszierenden Zebrabärbling Tg unter Verwendung (fli: EGFP) Stamm, der die grün fluoreszierendes Protein (EGFP) -markierten Gefäß 20, einschließlich Gehäuse und Experimenten verbessert hat, wurde nach den internationalen Richtlinien durchgeführt und wurde von dem lokalen institutionellen Ausschuß genehmigt Tierschutz (Dier Ethische Commissie (DEC) der Leiden University Medical Center. HINWEIS: Wie in Figur 1 zusammengefaßt, wird das Prot...

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	<li>Wan, L., Pantel, K., Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+metastasis:+moving+new+biological+insights+into+the+clinic.">Tumor metastasis: moving new biological insights into the clinic.</a> Nat. Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).</li><li>Obenauf, A. C., Massagu&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+at+a+distance:+Organ-specific+metastasis.">Surviving at a distance: Organ-specific metastasis.</a> Trends Cancer. 1 (1), 76-91 (2015).</li><li>Saxena, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebuilding+cancer+metastasis+in+the+mouse.">Rebuilding cancer metastasis in the mouse.</a> Mol. Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).</li><li>Teng, Y., Xie, X., Walker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+human+cancer+cell+metastasis+in+zebrafish.">Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish.</a> BMC cancer. 13 (1), 453 (2013).</li><li>Konantz, M., Balci, T. B., Hartwig, U. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+xenografts+as+a+tool+for+in+vivo+studies+on+human+cancer.">Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer.</a> Ann N Y Acad Sci. 1266 (1), 124-137 (2012).</li><li>Zhao, S., Huang, J., Ye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fresh+look+at+zebrafish+from+the+perspective+of+cancer+research.">A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research.</a> J Exp Clin Cancer Res. 34 (1), 80 (2015).</li><li>Stanton, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diethylnitrosamine-induced+hepatic+degeneration+and+neoplasia+in+the+aquarium+fish,+Brachydanio+rerio.">Diethylnitrosamine-induced hepatic degeneration and neoplasia in the aquarium fish, Brachydanio rerio.</a> J. Natl. Cancer Inst. 34 (1), 117-130 (1965).</li><li>Lam, S. H., Wu, Y. L., Vega, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+gene+expression+signatures+between+zebrafish+and+human+liver+tumors+and+tumor+progression.">Conservation of gene expression signatures between zebrafish and human liver tumors and tumor progression.</a> Nat. Biotechnol. 24 (1), 73-75 (2006).</li><li>Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+state+of+the+art+of+the+zebrafish+model+for+toxicology+and+toxicologic+pathology+research-advantages+and+current+limitations.">The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research-advantages and current limitations.</a> Toxicol. Pathol. 31, 62-87 (2003).</li><li>Stoletov, K., Klemke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catch+of+the+day:+zebrafish+as+a+human+cancer+model.">Catch of the day: zebrafish as a human cancer model.</a> Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).</li><li>Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+human+malignant+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+embryos:+assessment+of+migration+and+cell+division+in+the+absence+of+tumor+formation.">The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation.</a> Dev. Dynam. 233 (4), 1560-1570 (2005).</li><li>Mizgirev, I., Revskoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+clonal+zebrafish+lines+and+transplantable+hepatic+tumors.">Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors.</a> Nat. Protoc. 5 (3), 383-394 (2010).</li><li>Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantable+tumor+lines+generated+in+clonal+zebrafish.">Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish.</a> Cancer Res. 66 (6), 3120-3125 (2006).</li><li>Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+the+dynamic+tumor+cell-vascular+interface+in+transparent+zebrafish.">High-resolution imaging of the dynamic tumor cell-vascular interface in transparent zebrafish.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (44), 17406-17411 (2007).</li><li>Rouhi, P., Jensen, L. D., Cao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+metastasis+model+in+embryonic+zebrafish.">Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish.</a> Nat. Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).</li><li>Drabsch, Y., He, S., Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor-&#946;+signalling+controls+human+breast+cancer+metastasis+in+a+zebrafish+xenograft+model.">Transforming growth factor-&#946; signalling controls human breast cancer metastasis in a zebrafish xenograft model.</a> Breast Cancer Res. 15 (6), R106 (2013).</li><li>He, S., Lamers, G. E., Beenakker, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-mediated+experimental+metastasis+is+enhanced+by+VEGFR+inhibition+in+a+zebrafish+xenograft+model.">Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model.</a> J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).</li><li>Nicoli, S., Presta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish/tumor+xenograft+angiogenesis+assay.">The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay.</a> Nat. Protoc. 2 (11), 2918-2923 (2007).</li><li>de Boeck, M., Cui, C., Mulder, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smad6+determines+BMP-regulated+invasive+behaviour+of+breast+cancer+cells+in+a+zebrafish+xenograft+model.">Smad6 determines BMP-regulated invasive behaviour of breast cancer cells in a zebrafish xenograft model.</a> Sci. Rep. 6, 24968 (2016).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish.">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Dev. Biol. 248 (2), 307-318 (2002).</li><li>Stewart, S. A., Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-delivered+stable+gene+silencing+by+RNAi+in+primary+cells.">Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells.</a> RNA. 9 (4), 493-501 (2003).</li><li>Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system.">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J. Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arteries+and+veins:+making+a+difference+with+zebrafish.">Arteries and veins: making a difference with zebrafish.</a> Nat. Rev. Genet. 3 (9), 674-682 (2002).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 4 (1), 35-44 (2005).</li></ol>

Hier haben wir beschrieben , zwei Methoden , um das invasive Verhalten von Brustkrebszellen in Tg (FLI1: EGFP) zu untersuchen Zebrabärblingembryonen, mit perivitellinen Raum und Doc - Injektionen. Durch die Injektion mit chemischen Farbstoff markiert Krebszellen oder fluoreszierendem Protein in transgene Zebrafischembryonen, die dynamischen und räumlichen Eigenschaften der Invasion und Metastasierung können deutlich an der Einzelzelle oder Clusterebene unter einem Fluoreszenzmikroskop in Echtzeit verfolgt we...

Offenkundige Krebsmetastasen in der Klinik weisen eine Reihe von komplexen und mehrstufiges Ereignissen als „metastatic cascade“ bekannt. Die Kaskade wurde ausführlich überprüft und können in aufeinanderfolgende Schritte zerlegt werden: lokale Invasion, intravasation, Verbreitung, Festnahme, Extravasation und Kolonisierung 1, 2. Ein besseres Verständnis der Pathogenese von Krebsmetastasen und der Entwicklung von möglichen Behandlungsstrategien in vivo erfordert robuste Host - Modelle von Krebszellen zu verbreiten. Nagetiermodelle sind gut etabliert und werden verwendet , weit Metastasierung 3 zu bewerten, aber diese Ansätze haben eine geringe Effizienz und ethische Grenzen und sind teuer als Vordergrund Modell zu bestimmen , ob eine bestimmte Manipulation des metastatischen Phänotyp beeinflussen könnte. Andere effiziente, zuverlässige, kostengünstige Modelle sind notwendig, um schnell die möglichen Auswirkungen des Zugangs (epi) genetische Veränderungen oder pharmacologische Verbindungen. Aufgrund ihrer hohen genetischen Homologie zu den Menschen und die Transparenz ihrer Embryonen Zebrabärbling (Danio rerio) haben als ein wichtiges wirbel Modell entstanden und zunehmend auf die Untersuchung von Entwicklungsprozessen angewendet werden, mikroben Wirt - Interaktionen, menschliche Krankheiten, Drogen - Screening, etc. . 4. Die Krebsmetastasen Modelle in Zebrabärbling erstellt wurden, können eine Antwort auf die Mängel von Nagetiermodellen bieten 5, 6. Obwohl spontaner Neoplasie kaum in Wild Zebrabärbling 7 zu sehen ist gibt es mehr Techniken seit langem des gewünschten Krebs in Zebrabärbling zu induzieren. Karzinogen-induzierte Gen - Mutationen oder Signalwegs - Aktivierung können in menschliche Krankheit Zebrabärbling 7, 8, 9 und histologisch molekular Modell des Karzinogenese, nachahmt. durch taking Vorteil von verschiedenen Vorwärts- und Rückwärts genetische Manipulationen von Onkogenen oder Tumorsuppressoren, (transgene) Zebrabärbling hat auch potentielle Studien der Krebsentstehung und Wartung 6, 10 aktiviert. Die induzierten Krebsmodelle in Zebrabärbling decken ein breites Spektrum, einschließlich Verdauungs-, Fortpflanzungs-, Blut, Nervensystem, und epithelialen 6. Die Nutzung von Zebrabärbling in der Krebsforschung hat sich durch die Etablierung von humanen Tumorzell Xenograftmodellen in diesem Organismus vor kurzem erweitert. Dies wurde zuerst mit humanen metastasierenden Melanom - Zellen berichtet , dass im Jahr 2005 11 an dem Blastulastadium in Zebrabärblingembryonen erfolgreich transplantiert wurden. Mehrere unabhängigen Labors haben die Machbarkeit dieser Pionierarbeit validiert durch ein breites Spektrum von Säugetierkrebszelllinien in Zebrabärbling an verschiedenen Standorten und Entwicklungsstadien der Einführung 5 &lt;/ Sup&gt;. Zum Beispiel Injektionen in der Nähe der Blastulascheiben und Blastozyste der Blastulastadium; Injektionen in den Dottersack, perivitellinen Raum, Kanal von Cuvier (Doc) und posterioren Kardinalvene von 6-h- bis 5 Tage alten Embryonen; und Injektionen in die Bauchhöhle von 30 Tage alten immunsupprimierten Larven wurden 5 durchgeführt, 12. Zusätzlich wurden allogenen Tumor Transplantationen auch in Zebrabärbling berichtet 12, 13. Einer der großen Vorteile von Xenotransplantaten ist, dass die transplantierten Krebszellen fluoreszenz kann leicht gekennzeichnet und unterscheiden sich von normalen Zellen. Daher Untersuchungen über das dynamische Verhalten von microtumor Bildung 14, Zellinvasion und Metastasierung 15, 16, 17, tumorinduzierte Angiogenese 15, 18, und die Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und Wirtsfaktoren 17 in lebenden Fischen Körper deutlich sichtbar gemacht werden, vor allem , wenn transgene Zebrabärbling Linien 5 angewendet werden. Angeregt durch das hohe Potential von Zebrabärbling Xenograftmodellen Metastasierung zu bewerten, haben wir gezeigt , die transvaskulärer Extravasation Eigenschaften verschiedener Brustkrebszelllinien in dem tailfin Bereich von Tg (FLI: EGFP) Zebrabärbling - Embryonen durch Doc Injektionen 16. Die Rolle von transformierendem Wachstumsfaktor-β (TGF-β) 16 und bone morphogenetic protein (BMP) 19 Signalweg in pro- / Anti-Brustkrebs-Zellinvasion und Metastasierung wurden auch in diesem Modell untersucht. Darüber hinaus haben wir rekapituliert auch die intravasation Fähigkeit verschiedener Brustkrebszelllinien in Umlauf Xenotransplantat Zebrabärbling Modelle mit perivitellinen Raum Injektionen. <p class = „jove_content“&gt; Dieser Artikel stellt detaillierte Protokolle für Zebrabärbling Xenograftmodellen basiert auf der Injektion von menschlichen Brustkrebszellen in den perivitellinen Raum oder Doc. Verwendung von hochauflösenden Fluoreszenzabbildung zeigen wir den repräsentativen Prozess der intravasation in Blutgefäße und das invasiven Verhaltens von verschiedenen menschlichen Brustkrebszellen, die aus den Blutgefäßen in den avaskuläre tailfin Bereich bewegen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>AGAF0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>300038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera enterotoxin&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>227035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP5 STED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-high glucose media containing L-glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 media containing L-glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21041025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>01-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165 FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>227035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>I-6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10A (M1) cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10Aras (M2) cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRM-HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual micromanipulator&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M3301R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-97&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-tip Pasteur pipette (0,5-20 ul)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>F276456I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-VSVG plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLV-mCherry plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>36084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic picoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>107689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 4 software</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-REV plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg (fli:EGFP) zebrafish strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base&#160;</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>11814273001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (3-aminobenzoic acid)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>A-5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.5%)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, polystyrene (60 &#215; 15 mm)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>P5481-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene dish with glass bottom</td>
			<td>WillCo</td>
			<td>GWST-5040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

invasive behavior of human breast cancer cells in embryonic zebrafish

In vielen Fällen Krebspatienten sterben nicht von einem Primärtumor, sondern wegen der Metastasierung. Obwohl zahlreiche Nagetiermodelle zur Untersuchung von Krebsmetastasen in vivo zur Verfügung stehen, andere effizient, zuverlässig, sind Low-Cost - Modelle benötigt , um schnell die möglichen Auswirkungen von (epi) genetischen Veränderungen oder pharmakologischer Verbindungen zugreifen. Als solche wir veranschaulichen und die Machbarkeit der Xenograftmodellen mit menschlichen Brustkrebszellen injiziert in Zebrabärblingembryonen erklären, dieses Ziel zu unterstützen. Unter dem Mikroskop sind in transgene Zebrafischembryonen transplantiert fluoreszierende Proteine oder chemisch markierte menschliche Brustkrebszellen, Tg (FLI: EGFP), am perivitellinen Raum oder Kanal Cuviers (DOC) 48 h nach der Befruchtung. Kurz darauf der räumlich-zeitliche Prozess der Invasion von Krebszellen, die Verbreitung und die Metastasierung im lebenden Fischkörper wird unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht. Die Modelle mit unterschiedlichen Injektionsstellen, dh proivitelline Raum oder Doc ist komplementär zueinander, was das frühe Stadium (intravasation Schritt) und Spätstadium (Extravasation Schritt) der vielstufigen metastatischen Kaskade von Ereignissen. Darüber hinaus kann peritumoralen und intratumorale Angiogenese mit der Injektion in den perivitellinen Raum beobachtet werden. Die gesamte Versuchsdauer nicht mehr als 8 Tage. Diese beiden Modelle kombinieren Zellmarkierung, Mikro-Transplantation, und Fluoreszenz-Bildgebungstechniken, ermöglicht die schnelle Auswertung von Krebsmetastasen in Reaktion auf genetische und pharmakologische Manipulationen.

Im embryonalen Xenotransplantat Zebrabärbling-Modell mit einer perivitellinen Raum Injektion, die hämatogene Verbreitung von markierten Krebszellen im Fischkörper als aktive Migration betrachtet. Dieser Prozess kann unter einem Fluoreszenzmikroskop nachgewiesen und quantifiziert werden, wie oben bei den Verfahren beschrieben. Um dieses Xenograftmodell veranschaulicht, folgten wir den Verbreitungsprozess verschiedener Brustkrebs-Zelllinien mit bekannter (oder ohne) invasion / Metastasi...

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Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Hier beschreiben wir Xenotransplantat Zebrabärbling Modelle mit zwei verschiedenen Injektionsstellen, dh perivitellinen Raum und Kanal von Cuvier, das invasive Verhalten zu untersuchen und die intravasation und Extravasation Potential von menschlichen Brustkrebszellen zu bewerten sind.

Invasive Verhalten von menschlichen Brustkrebszellen in embryonalem Zebrabärbling

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

The overall goal of this microinjection of human breast cancer cells into embryonic zebrafish is to investigate the invasive behavior and assess the metastatic potential of human breast cancer cells. This method can help to answer key questions regarding intravasation and extravasation to critical processes in cancer metastasis. The main advantage of this technique is that it provides an elegant, rapid, and cheap in vivo model to measure the ability of cancer cells to invade and metastasize.The implications of this technique extend towards the development of new pharmacological compounds with anti-metastatic activity. Though this measure can provide insight into cancer emission and the metastasis, it can also be applied to study some other phenomena, such as peritumoral angiogenesis and cancer cell dormancy. To begin, culture transduced human breast cancer MDA-MB-231 cells, breast epithelial MCF10A cells, and breast epithelial MCF10A-Ras cells in a T75 flask.Once the transduced cells reach 80%confluence, remove the medium from the T75 flask, wash the cells with phosphate-buffered saline, and detach the cells with 0.5%Trypsin-EDTA solution. Then neutralize the Trypsin with medium. Next, centrifuge the cells at 1, 000 RPM for five minutes to remove the medium, wash them with PBS, and centrifuge the sample one more time.After washing, resuspend the cells in approximately 200 microliters of PBS to obtain a suspension of no more than 1 x 10 to the eighth cells per milliliter. Store the cell suspension in four degrees Celsius for no longer than five hours. To prepare zebrafish embryos for implantation, incubate approximately 60 embryos in a petri dish filled with egg water, supplemented with 60 micrograms per milliliter of sea salts at 28 degrees Celsius.Then, using fine tweezers, remove the coriands from the embryos at 48 hours post-fertilization. To anesthetize the embryos for the implantation procedure, transfer them to a 40 microgram per milliliter solution of tricaine in egg water. Prior to the implantation, prepare injection needles.To do this, load a borosilicate microcapillary tube into a micro-pipette puller and pull the needle. Store the prepared needles in a needle-holder plate until needed. Aspirate 15 microliters of the prepared cell suspension into an injection needle.Next, attach the needle to a micromanipulator, and, using fine tweezers, break its tip to five to 10 microns. Adjust the pneumatic PICO pump and inject cells onto the petri dish pre-coated with sterile 1%agarose. Then, transfer approximately 10 anesthetized embryos at two to three days post-fertilization onto a flat injecting plate coated with 1%agarose.Arrange the position of the embryos with a hair loop tool so that they are oriented in the same direction. While injecting, manually adjust the injection plate position to place the embryos in a diagonal orientation, which is preferred for a precise needle insertion. Direct the needle tip at the injection site and gently insert it into the perivitelline space localized between the yolk sac and the paraderm of the zebrafish embryo.Lastly, inject approximately 400 tumor cells labeled with mCherry. Make sure not to rupture the yolk sac to avoid a misplaced implantation. To inject the cells into the duct of Cuvier, approach the vein from the dorsal side of the embryo with the needle kept at a 45-degree angle.Insert the needle at the starting point of the duct of Cuvier, localized dorsally to the point where the duct starts broadening over the yolk sac. Then, inject approximately 400 cells. Finally, transfer the injected zebrafish embryos to the egg water, and incubate them at 33 degrees Celsius until further analysis.To visualize metastasis, with a Pasteur pipette, transfer the injected zebrafish embryo to a glass-bottom polystyrene dish and remove excess egg water. Image the whole body of the embryo with a confocal microscope set to low magnification to obtain a general pattern of tumor cell dissemination. Use a 488 nanometer laser to visualize the zebrafish embryo vasculature, and a 543 nanometer laser to visualize implanted tumor cells labeled with red fluorescent marker.Next, scan the embryo in eight to 10 steps to acquire a high-quality image. Presented here are photographs of zebrafish embryos that were taken with a confocal microscope three days after perivitelline injection of MDA-MB-231 cells. MDA-MB-231 cells widely disseminated within the zebrafish body, manifesting highly invasive potential.MCF10A-Ras cells, when implanted to zebrafish embryos, revealed moderate invasive capacity with only a few cells spread to distant parts of the body. Upon transplantation, MCF10A cells remained non-invasive and concentrated within the injection site, confirming that all studied cells reveal different invasive potential. The highly invasive character of MDA-MB-231 cells was reflected in their enhanced migration capacity observed within the perivitelline space.To some extent, such migration was also observed for MCF10A-Ras cells. On the contrary, MCF10A cells did not migrate in the perivitelline space. Distinct metastatic behavior of MDA-MB-231 and MCF10A-Ras cells was also observed when both cell types were implanted into the embryos'duct of Cuvier.As shown, MDA-MB-231 cells migrated independently of one another, while MCF10A-Ras were prone to migrate in clusters. Following this procedure, other measures like immunofluorescence can be performed in order to answer additional questions, such as how cancer cells proliferate in the zebrafish, and how they affect the surrounding host of cells. After watching this video, you will have a good understanding of how to use zebrafish model to study an invasive behavior and assize intravasation and extravasation capacity of human breast cancer cells.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

Intra-Beckenarterie Injection für effiziente und selektive Modellierung von Mikroskopische Knochenmetastasen

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

Forschung

Krebsforschung

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Functional Genomics Screening Verwendung zur Identifizierung möglicher neuer Wirkstoff-Targets in Cancer Cell Sphäroid-Kulturen

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio)

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish Danio Rerio

Testen des Vascular Invasive Fähigkeit von Krebszellen in Zebrabärbling (<em&gt; Danio rerio</em&gt;)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression.  Traditional in vitro models of cancer cell invasion of ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Längsschnitt-Intravital-Bildgebung des Hirntumorzellverhaltens als Reaktion auf eine invasive chirurgische Biopsie

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Studieren von dreifach negativem Brustkrebs mit orthotopischem Brustkrebsmodell

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

In Vivo Targeting von xenografierten menschlichen Krebszellen mit funktionalisierten fluoreszierenden Kieselsäure-Nanopartikeln in Zebrafischen

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro-Bewertung der onkogenen Transformation in menschlichen Mammaepithelzellen

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolierung und funktionelle Beurteilung menschlicher Brustkrebsstammzellen aus Zell- und Gewebeproben

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

Modellierung von Brustkrebs im menschlichen Brustgewebe mit einem mikrophysiologischen System

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

Modellierung der Hirnmetastasierung durch Injektion von entzündlichen Brustkrebszellen in die Schwanzvene

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...