Name: invasive behavior of human breast cancer cells in embryonic zebrafish
Uploaded: 2017-04-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish at JoVE.com

Исследования членов семьи TGF-β поддерживаются Cancer Genomics центр Нидерландов. Сиджия Лиу и Цзян Ren поддержаны Советом Стипендии Китая в течение 4 лет обучения в университете Лейдена. Мы благодарим доктора Фред Миллер (Барбара Энн Karmanos институт рака, Детройт, Мичиган, США) для клеточных линий MCF10A.

Все исследования с использованием трансгенных данио флуоресцентного Tg (FLI: EGFP) штамм, который обладает повышенными зеленым флуоресцентным белком (EGFP) меченных сосудистыми 20, в то числе жилья и экспериментов, были проведено в соответствии с международными руководящими принципами...

<ol>
	<li>Wan, L., Pantel, K., Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+metastasis:+moving+new+biological+insights+into+the+clinic.">Tumor metastasis: moving new biological insights into the clinic.</a> Nat. Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).</li><li>Obenauf, A. C., Massagu&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+at+a+distance:+Organ-specific+metastasis.">Surviving at a distance: Organ-specific metastasis.</a> Trends Cancer. 1 (1), 76-91 (2015).</li><li>Saxena, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebuilding+cancer+metastasis+in+the+mouse.">Rebuilding cancer metastasis in the mouse.</a> Mol. Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).</li><li>Teng, Y., Xie, X., Walker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+human+cancer+cell+metastasis+in+zebrafish.">Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish.</a> BMC cancer. 13 (1), 453 (2013).</li><li>Konantz, M., Balci, T. B., Hartwig, U. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+xenografts+as+a+tool+for+in+vivo+studies+on+human+cancer.">Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer.</a> Ann N Y Acad Sci. 1266 (1), 124-137 (2012).</li><li>Zhao, S., Huang, J., Ye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fresh+look+at+zebrafish+from+the+perspective+of+cancer+research.">A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research.</a> J Exp Clin Cancer Res. 34 (1), 80 (2015).</li><li>Stanton, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diethylnitrosamine-induced+hepatic+degeneration+and+neoplasia+in+the+aquarium+fish,+Brachydanio+rerio.">Diethylnitrosamine-induced hepatic degeneration and neoplasia in the aquarium fish, Brachydanio rerio.</a> J. Natl. Cancer Inst. 34 (1), 117-130 (1965).</li><li>Lam, S. H., Wu, Y. L., Vega, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+gene+expression+signatures+between+zebrafish+and+human+liver+tumors+and+tumor+progression.">Conservation of gene expression signatures between zebrafish and human liver tumors and tumor progression.</a> Nat. Biotechnol. 24 (1), 73-75 (2006).</li><li>Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+state+of+the+art+of+the+zebrafish+model+for+toxicology+and+toxicologic+pathology+research-advantages+and+current+limitations.">The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research-advantages and current limitations.</a> Toxicol. Pathol. 31, 62-87 (2003).</li><li>Stoletov, K., Klemke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catch+of+the+day:+zebrafish+as+a+human+cancer+model.">Catch of the day: zebrafish as a human cancer model.</a> Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).</li><li>Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+human+malignant+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+embryos:+assessment+of+migration+and+cell+division+in+the+absence+of+tumor+formation.">The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation.</a> Dev. Dynam. 233 (4), 1560-1570 (2005).</li><li>Mizgirev, I., Revskoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+clonal+zebrafish+lines+and+transplantable+hepatic+tumors.">Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors.</a> Nat. Protoc. 5 (3), 383-394 (2010).</li><li>Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantable+tumor+lines+generated+in+clonal+zebrafish.">Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish.</a> Cancer Res. 66 (6), 3120-3125 (2006).</li><li>Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+the+dynamic+tumor+cell-vascular+interface+in+transparent+zebrafish.">High-resolution imaging of the dynamic tumor cell-vascular interface in transparent zebrafish.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (44), 17406-17411 (2007).</li><li>Rouhi, P., Jensen, L. D., Cao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+metastasis+model+in+embryonic+zebrafish.">Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish.</a> Nat. Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).</li><li>Drabsch, Y., He, S., Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor-&#946;+signalling+controls+human+breast+cancer+metastasis+in+a+zebrafish+xenograft+model.">Transforming growth factor-&#946; signalling controls human breast cancer metastasis in a zebrafish xenograft model.</a> Breast Cancer Res. 15 (6), R106 (2013).</li><li>He, S., Lamers, G. E., Beenakker, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-mediated+experimental+metastasis+is+enhanced+by+VEGFR+inhibition+in+a+zebrafish+xenograft+model.">Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model.</a> J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).</li><li>Nicoli, S., Presta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish/tumor+xenograft+angiogenesis+assay.">The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay.</a> Nat. Protoc. 2 (11), 2918-2923 (2007).</li><li>de Boeck, M., Cui, C., Mulder, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smad6+determines+BMP-regulated+invasive+behaviour+of+breast+cancer+cells+in+a+zebrafish+xenograft+model.">Smad6 determines BMP-regulated invasive behaviour of breast cancer cells in a zebrafish xenograft model.</a> Sci. Rep. 6, 24968 (2016).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish.">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Dev. Biol. 248 (2), 307-318 (2002).</li><li>Stewart, S. A., Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-delivered+stable+gene+silencing+by+RNAi+in+primary+cells.">Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells.</a> RNA. 9 (4), 493-501 (2003).</li><li>Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system.">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J. Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arteries+and+veins:+making+a+difference+with+zebrafish.">Arteries and veins: making a difference with zebrafish.</a> Nat. Rev. Genet. 3 (9), 674-682 (2002).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 4 (1), 35-44 (2005).</li></ol>

Здесь мы описали два метода для исследования инвазивного поведения клеток рака молочной железы в Tg (FLI1: EGFP) эмбрионы данио, с перивителлиновым пространства и Doc инъекциями. Вводя раковые клетки, меченные химическим красителем или флуоресцентного белка в трансгенных эмбрионов дани...

Явная метастазы рака в клинике включает в себя ряд сложных и многоступенчатых событий, известных как «метастатического каскада». Каскада была широко рассмотрена и может быть разрезана на последовательные этапы: локальную инвазию, intravasation, распространение, арест, транссудацию и колонизацию 1, 2. Лучшее понимание патогенеза метастазирования рака и развития потенциальных стратегий лечения в естественных условиях необходимы надежные модели , принимающие распространения раковых клеток. Модели грызунов хорошо известны и широко используются для оценки метастаза 3, но эти подходы имеют низкую эффективность и этические ограничения и являются дорогостоящими в качестве модели первого плана , чтобы определить , может ли та или иная манипуляция влияет на метастатический фенотип. Другие модели эффективной, надежной, недорогой, необходимы для быстрого доступа потенциальных последствий (эпи) генетических изменений или pharmacologские соединения. Из - за их высокой генетической гомологии для человека и прозрачности их эмбрионов данио (Danio rerio) возникли в качестве важной модели позвоночных , и все чаще применяются для изучения процессов развития, микроб-хозяин взаимодействий, заболеваний человека, скрининга лекарственных средств и т.д. . 4. Модели метастазирования рака , установленные в данио могут дать ответ на недостатки моделей на грызунах 5, 6. Хотя спонтанная неоплазия едва видел в дикой данио 7, есть несколько давнишних методы , чтобы вызвать требуемый рак в данио. Вызванного канцероген генных мутации или сигнализация активация пути могут гистологический и молекулярно модель канцерогенез, имитируя заболевание человека в данио 7, 8, 9. По TakING преимущества разнообразно прямые и обратное генетические манипуляции онкогенов или опухолевых супрессоров, (трансгенный) данио также позволил потенциальным исследования формирования и поддержания 6, 10 рака. Индуцированные модели рака в данио охватывают широкий спектр, в том числе пищеварительной, репродуктивной, крови, нервной системы, и эпителиальной 6. Использование данио в исследовании рака расширилась в последнее время в связи с созданием моделей опухолевых клеток ксенотрансплантата человека в этом организме. Это было впервые сообщено с метастатическими клетками меланомы человека , которые были успешно прижились в данио эмбрионов на стадии бластулы в 2005 году 11. Несколько независимых лаборатории подтверждена целесообразность этой новаторской работы путем введения широкого спектра млекопитающих раковые клеточных линий в данио на различных участках и стадиях развития 5 &lt;/ SUP&gt;. Так, например, инъекции вблизи бластодиска и бластоцисты стадии бластулы; инъекции в желточный мешок, перивителлиновое пространства, протоков Кювье (Doc), и задней кардинальной вены 6-H- до 5-дневных эмбрионов; и инъекция в брюшную полость 30-дневных личинок иммуносупрессии была проведена 5, 12. Кроме того, аллогенных трансплантаций опухоли также были представлены в данио 12, 13. Одно из самых больших преимуществ использования ксенотрансплантатов является то, что привиты раковые клетки могут быть легко флуоресцентно меченных и отличаются от нормальных клеток. Следовательно, расследование динамических поведения формирования microtumor 14, инвазию и метастазирование клеток 15, 16, 17, 15 ангиогенез , индуцированный опухолью, 18, а также взаимодействие между раковыми клетками и хозяином факторами 17 могут быть четко визуализируются в живом организме рыбы, особенно , когда трансгенные линии данио применяется 5. Вдохновленный высоким потенциалом данио моделей ксенотрансплантатов оценить метастазирование, мы продемонстрировали transvascular Экстравазационным свойства различных клеточных линий рака молочной железы в области tailfin от Tg (FLI: EGFP) эмбрионов данио рерио через Doc инъекций 16. Роль трансформирующий фактор роста-бета (TGF-бета) 16 и костного морфогенетического белка (BMP) 19 сигнальных путей в про- / анти-молочной инвазии и метастазирование раковых клеток также были исследованы в этой модели. Кроме того, мы также перечислил основные направления intravasation способность различных клеток рака молочной железы линий в обращении с использованием ксенотрансплантатов данио модели с перивителлиновом космических инъекций. <p claсс = «jove_content»&gt; В этой статье представлены подробные протоколы для данио ксенотрансплантатных моделей, основанных на инъекции клеток рака молочной железы человека в перивителлиновое пространство или Док. С помощью флуоресцентной визуализации с высоким разрешением, мы показываем представительный процесс intravasation в кровеносные сосуды и инвазивного поведение различных клеток рака молочной железы человека, которые перемещаются из кровеносных сосудов в аваскулярную области tailfin.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>AGAF0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>300038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera enterotoxin&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>227035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP5 STED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-high glucose media containing L-glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 media containing L-glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21041025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>01-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165 FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>227035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>I-6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10A (M1) cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10Aras (M2) cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRM-HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual micromanipulator&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M3301R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-97&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-tip Pasteur pipette (0,5-20 ul)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>F276456I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-VSVG plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLV-mCherry plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>36084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic picoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>107689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 4 software</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-REV plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg (fli:EGFP) zebrafish strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base&#160;</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>11814273001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (3-aminobenzoic acid)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>A-5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.5%)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, polystyrene (60 &#215; 15 mm)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>P5481-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene dish with glass bottom</td>
			<td>WillCo</td>
			<td>GWST-5040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

invasive behavior of human breast cancer cells in embryonic zebrafish

Во многих случаях, больной раком не умирают от первичной опухоли, а скорее из-за метастаз. Несмотря на многочисленные модели на грызунах доступны для изучения метастазирования рака в естественных условиях, другие эффективные, надежные, недорогие модели необходимы для быстрого доступа потенциальных последствий (эпите) генетических изменения или фармакологических соединений. Таким образом, мы проиллюстрируем и объяснить целесообразность моделей ксенотрансплантата с использованием клеток рака молочной железы человека инжектированной в данио эмбрионов для поддержки этой цели. Под микроскопом, флуоресцентные белки или химически меченые клетки рака молочной железы человека пересаживают в трансгенных эмбрионов данио, Тд (FLI: EGFP), в пространстве или перивителлинового канале Cuvier (Doc) 48 ч после оплодотворения. Вскоре после этого, височно-пространственного процесс инвазии раковых клеток, распространения и метастаза в живом организме рыбы визуализируется под флуоресцентным микроскопом. Модели , использующие различные инъекции сайты, то есть, вivitelline пространство или док дополняют друг друга, что отражает раннюю стадию (intravasation шаг) и поздней стадии (этап экстравазации) в многостадийной метастатического каскада событий. Кроме того, перитуморальный и внутриопухолевый ангиогенез может наблюдаться при инъекции в перивителлиновом пространство. не весь экспериментальный период составляет не более 8 дней. Эти две модели сочетают маркировки клеток, микро-трансплантации, а также методы флуоресцентной визуализации, что позволяет быструю оценку метастазов рака в ответ на генетических и фармакологических манипуляций.

В эмбриональном ксенотрансплантате данио модели с перивителлиновым пространством инъекцией гематогенной диссеминация меченых раковых клеток в организме рыбы считаются активной миграцией. Этот процесс может быть обнаружен и количественно под флуоресцентным микро...

Watch this Scientific Journal Video about Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish at JoVE.com

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Здесь мы опишем ксенотрансплантаты данио модели , используя два различных места инъекций, то есть, перивителлиновое пространство и протоки Кювья, исследовать инвазивное поведение и оценить intravasation и экстравазационный потенциал клеток рака молочной железы человека, соответственно.

Инвазивные поведение клеток рака молочной железы человека в эмбриональном данио рерио

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

The overall goal of this microinjection of human breast cancer cells into embryonic zebrafish is to investigate the invasive behavior and assess the metastatic potential of human breast cancer cells. This method can help to answer key questions regarding intravasation and extravasation to critical processes in cancer metastasis. The main advantage of this technique is that it provides an elegant, rapid, and cheap in vivo model to measure the ability of cancer cells to invade and metastasize.The implications of this technique extend towards the development of new pharmacological compounds with anti-metastatic activity. Though this measure can provide insight into cancer emission and the metastasis, it can also be applied to study some other phenomena, such as peritumoral angiogenesis and cancer cell dormancy. To begin, culture transduced human breast cancer MDA-MB-231 cells, breast epithelial MCF10A cells, and breast epithelial MCF10A-Ras cells in a T75 flask.Once the transduced cells reach 80%confluence, remove the medium from the T75 flask, wash the cells with phosphate-buffered saline, and detach the cells with 0.5%Trypsin-EDTA solution. Then neutralize the Trypsin with medium. Next, centrifuge the cells at 1, 000 RPM for five minutes to remove the medium, wash them with PBS, and centrifuge the sample one more time.After washing, resuspend the cells in approximately 200 microliters of PBS to obtain a suspension of no more than 1 x 10 to the eighth cells per milliliter. Store the cell suspension in four degrees Celsius for no longer than five hours. To prepare zebrafish embryos for implantation, incubate approximately 60 embryos in a petri dish filled with egg water, supplemented with 60 micrograms per milliliter of sea salts at 28 degrees Celsius.Then, using fine tweezers, remove the coriands from the embryos at 48 hours post-fertilization. To anesthetize the embryos for the implantation procedure, transfer them to a 40 microgram per milliliter solution of tricaine in egg water. Prior to the implantation, prepare injection needles.To do this, load a borosilicate microcapillary tube into a micro-pipette puller and pull the needle. Store the prepared needles in a needle-holder plate until needed. Aspirate 15 microliters of the prepared cell suspension into an injection needle.Next, attach the needle to a micromanipulator, and, using fine tweezers, break its tip to five to 10 microns. Adjust the pneumatic PICO pump and inject cells onto the petri dish pre-coated with sterile 1%agarose. Then, transfer approximately 10 anesthetized embryos at two to three days post-fertilization onto a flat injecting plate coated with 1%agarose.Arrange the position of the embryos with a hair loop tool so that they are oriented in the same direction. While injecting, manually adjust the injection plate position to place the embryos in a diagonal orientation, which is preferred for a precise needle insertion. Direct the needle tip at the injection site and gently insert it into the perivitelline space localized between the yolk sac and the paraderm of the zebrafish embryo.Lastly, inject approximately 400 tumor cells labeled with mCherry. Make sure not to rupture the yolk sac to avoid a misplaced implantation. To inject the cells into the duct of Cuvier, approach the vein from the dorsal side of the embryo with the needle kept at a 45-degree angle.Insert the needle at the starting point of the duct of Cuvier, localized dorsally to the point where the duct starts broadening over the yolk sac. Then, inject approximately 400 cells. Finally, transfer the injected zebrafish embryos to the egg water, and incubate them at 33 degrees Celsius until further analysis.To visualize metastasis, with a Pasteur pipette, transfer the injected zebrafish embryo to a glass-bottom polystyrene dish and remove excess egg water. Image the whole body of the embryo with a confocal microscope set to low magnification to obtain a general pattern of tumor cell dissemination. Use a 488 nanometer laser to visualize the zebrafish embryo vasculature, and a 543 nanometer laser to visualize implanted tumor cells labeled with red fluorescent marker.Next, scan the embryo in eight to 10 steps to acquire a high-quality image. Presented here are photographs of zebrafish embryos that were taken with a confocal microscope three days after perivitelline injection of MDA-MB-231 cells. MDA-MB-231 cells widely disseminated within the zebrafish body, manifesting highly invasive potential.MCF10A-Ras cells, when implanted to zebrafish embryos, revealed moderate invasive capacity with only a few cells spread to distant parts of the body. Upon transplantation, MCF10A cells remained non-invasive and concentrated within the injection site, confirming that all studied cells reveal different invasive potential. The highly invasive character of MDA-MB-231 cells was reflected in their enhanced migration capacity observed within the perivitelline space.To some extent, such migration was also observed for MCF10A-Ras cells. On the contrary, MCF10A cells did not migrate in the perivitelline space. Distinct metastatic behavior of MDA-MB-231 and MCF10A-Ras cells was also observed when both cell types were implanted into the embryos'duct of Cuvier.As shown, MDA-MB-231 cells migrated independently of one another, while MCF10A-Ras were prone to migrate in clusters. Following this procedure, other measures like immunofluorescence can be performed in order to answer additional questions, such as how cancer cells proliferate in the zebrafish, and how they affect the surrounding host of cells. After watching this video, you will have a good understanding of how to use zebrafish model to study an invasive behavior and assize intravasation and extravasation capacity of human breast cancer cells.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

Intra-подвздошной артерией Инъекции для эффективного и селективного моделирования Микроскопическое костными метастазами

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Использование функциональной геномики скрининг для выявления потенциально новых целей наркотиком в сфероида культур раковых клеток

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio)

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish Danio Rerio

Тестирование Сосудистый инвазивным способность раковых клеток в данио рерио (<em&gt; Danio Rerio</em&gt;)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression.  Traditional in vitro models of cancer cell invasion of ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Продольная интравитальная визуализация поведения опухолевых клеток головного мозга в ответ на инвазивную хирургическую биопсию

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Изучение Тройной отрицательный рак молочной железы Использование ортотопической модели рака молочной железы

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

В Vivo Ориентация Ксенотрансплантированных раковых клеток человека с функциональными флуоресцентными наночастицами кремнезема в Зебрафиш

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro Оценка онкогенной трансформации в эпителиальных клетках молочной железы человека

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Выделение и функциональная оценка стволовых клеток рака молочной железы человека из образцов клеток и тканей

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

Моделирование рака молочной железы в ткани молочной железы человека с использованием микрофизиологической системы

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

Моделирование метастазирования в головной мозг с помощью инъекции воспалительных клеток рака молочной железы в хвостовую вену

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...