Name: invasive behavior of human breast cancer cells in embryonic zebrafish
Uploaded: 2017-04-25T15:00:00
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Los estudios sobre miembros de la familia TGF-β son apoyados por el Centro de Genómica del Cáncer Países Bajos. Sijia Liu y Jiang Ren son apoyados por el Consejo de Becas de China durante 4 años de estudio en la Universidad de Leiden. Agradecemos al Dr. Fred Miller (Ann Instituto del Cáncer Karmanos Bárbara, Detroit, MI, EE.UU.) para las líneas de células MCF10A.

Toda la investigación usando el transgénico fluorescente Tg pez cebra (fli: EGFP) cepa, que ha mejorado la proteína verde fluorescente (EGFP) marcado con vasculatura 20, incluida la vivienda y los experimentos, se llevó a cabo de acuerdo con las directrices internacionales y fue aprobado por el Comité institucional local para el Bienestar Animal (de Dier ethische Commissie (DEC) del Centro Médico de la Universidad de Leiden. NOTA: Tal como se resume en la Figura 1, el protocolo...

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	<li>Wan, L., Pantel, K., Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+metastasis:+moving+new+biological+insights+into+the+clinic.">Tumor metastasis: moving new biological insights into the clinic.</a> Nat. Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).</li><li>Obenauf, A. C., Massagu&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+at+a+distance:+Organ-specific+metastasis.">Surviving at a distance: Organ-specific metastasis.</a> Trends Cancer. 1 (1), 76-91 (2015).</li><li>Saxena, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebuilding+cancer+metastasis+in+the+mouse.">Rebuilding cancer metastasis in the mouse.</a> Mol. Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).</li><li>Teng, Y., Xie, X., Walker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+human+cancer+cell+metastasis+in+zebrafish.">Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish.</a> BMC cancer. 13 (1), 453 (2013).</li><li>Konantz, M., Balci, T. B., Hartwig, U. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+xenografts+as+a+tool+for+in+vivo+studies+on+human+cancer.">Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer.</a> Ann N Y Acad Sci. 1266 (1), 124-137 (2012).</li><li>Zhao, S., Huang, J., Ye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fresh+look+at+zebrafish+from+the+perspective+of+cancer+research.">A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research.</a> J Exp Clin Cancer Res. 34 (1), 80 (2015).</li><li>Stanton, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diethylnitrosamine-induced+hepatic+degeneration+and+neoplasia+in+the+aquarium+fish,+Brachydanio+rerio.">Diethylnitrosamine-induced hepatic degeneration and neoplasia in the aquarium fish, Brachydanio rerio.</a> J. Natl. Cancer Inst. 34 (1), 117-130 (1965).</li><li>Lam, S. H., Wu, Y. L., Vega, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+gene+expression+signatures+between+zebrafish+and+human+liver+tumors+and+tumor+progression.">Conservation of gene expression signatures between zebrafish and human liver tumors and tumor progression.</a> Nat. Biotechnol. 24 (1), 73-75 (2006).</li><li>Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+state+of+the+art+of+the+zebrafish+model+for+toxicology+and+toxicologic+pathology+research-advantages+and+current+limitations.">The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research-advantages and current limitations.</a> Toxicol. Pathol. 31, 62-87 (2003).</li><li>Stoletov, K., Klemke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catch+of+the+day:+zebrafish+as+a+human+cancer+model.">Catch of the day: zebrafish as a human cancer model.</a> Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).</li><li>Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+human+malignant+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+embryos:+assessment+of+migration+and+cell+division+in+the+absence+of+tumor+formation.">The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation.</a> Dev. Dynam. 233 (4), 1560-1570 (2005).</li><li>Mizgirev, I., Revskoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+clonal+zebrafish+lines+and+transplantable+hepatic+tumors.">Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors.</a> Nat. Protoc. 5 (3), 383-394 (2010).</li><li>Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantable+tumor+lines+generated+in+clonal+zebrafish.">Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish.</a> Cancer Res. 66 (6), 3120-3125 (2006).</li><li>Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+the+dynamic+tumor+cell-vascular+interface+in+transparent+zebrafish.">High-resolution imaging of the dynamic tumor cell-vascular interface in transparent zebrafish.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (44), 17406-17411 (2007).</li><li>Rouhi, P., Jensen, L. D., Cao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+metastasis+model+in+embryonic+zebrafish.">Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish.</a> Nat. Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).</li><li>Drabsch, Y., He, S., Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor-&#946;+signalling+controls+human+breast+cancer+metastasis+in+a+zebrafish+xenograft+model.">Transforming growth factor-&#946; signalling controls human breast cancer metastasis in a zebrafish xenograft model.</a> Breast Cancer Res. 15 (6), R106 (2013).</li><li>He, S., Lamers, G. E., Beenakker, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-mediated+experimental+metastasis+is+enhanced+by+VEGFR+inhibition+in+a+zebrafish+xenograft+model.">Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model.</a> J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).</li><li>Nicoli, S., Presta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish/tumor+xenograft+angiogenesis+assay.">The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay.</a> Nat. Protoc. 2 (11), 2918-2923 (2007).</li><li>de Boeck, M., Cui, C., Mulder, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smad6+determines+BMP-regulated+invasive+behaviour+of+breast+cancer+cells+in+a+zebrafish+xenograft+model.">Smad6 determines BMP-regulated invasive behaviour of breast cancer cells in a zebrafish xenograft model.</a> Sci. Rep. 6, 24968 (2016).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish.">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Dev. Biol. 248 (2), 307-318 (2002).</li><li>Stewart, S. A., Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-delivered+stable+gene+silencing+by+RNAi+in+primary+cells.">Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells.</a> RNA. 9 (4), 493-501 (2003).</li><li>Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system.">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J. Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arteries+and+veins:+making+a+difference+with+zebrafish.">Arteries and veins: making a difference with zebrafish.</a> Nat. Rev. Genet. 3 (9), 674-682 (2002).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 4 (1), 35-44 (2005).</li></ol>

Aquí, describimos dos métodos para investigar el comportamiento invasivo de las células de cáncer de mama en Tg (FLI1: EGFP) embriones de pez cebra, con el espacio perivitelino y Doc inyecciones. Mediante la inyección de células cancerosas marcadas con colorante químico o proteína fluorescente en embriones de pez cebra transgénico, las características dinámicas y espaciales de la invasión y la metástasis pueden ser claramente un seguimiento en tiempo real en el de una sola célula o nivel de clúst...

metástasis del cáncer Overt en la clínica comprende una serie de eventos complejos y de múltiples pasos conocidos como la &quot;cascada metastásica&quot;. La cascada ha sido extensamente revisada y puede ser diseccionada en etapas sucesivas: la invasión local, intravasación, la difusión, la detención, la extravasación y la colonización 1, 2. Una mejor comprensión de la patogénesis de la metástasis del cáncer y el desarrollo de estrategias potenciales de tratamiento in vivo requieren robustos modelos de acogida de la propagación de las células cancerosas. Modelos de roedores están bien establecidos y son ampliamente utilizados para evaluar la metástasis 3, pero estos enfoques tienen una baja eficacia y limitaciones éticas y son costosos como un modelo de vanguardia para determinar si una manipulación particular podría afectar el fenotipo metastásico. Se necesitan otros modelos eficientes, y de bajo costo confiable para acceder rápidamente a los posibles efectos de (epi) cambios genéticos o Pharmacologcompuestos iCal. Debido a su alta homología genética para los seres humanos y la transparencia de su embriones de pez cebra (Danio rerio) han surgido como un modelo vertebrado importante y se están aplicando cada vez más para el estudio de los procesos de desarrollo, interacciones microbio-huésped, enfermedades humanas, la detección de drogas, etc . 4. Los modelos de metástasis de cáncer establecidas en el pez cebra puede proporcionar una respuesta a las deficiencias de los modelos de roedores 5, 6. Aunque neoplasia espontánea apenas se ve en el pez cebra salvaje 7, hay varias técnicas de larga data para inducir el cáncer deseada en el pez cebra. Mutaciones de genes inducidos por carcinógenos o señalización activación de la vía pueden histológicamente y modelo de carcinogénesis molecularmente, imitando la enfermedad humana en el pez cebra 7, 8, 9. por taking ventaja de diversa avance y retroceso manipulaciones genéticas de oncogenes o supresores tumorales, (transgénicos) pez cebra también han permitido estudios potenciales de la formación de cáncer y de mantenimiento 6, 10. Los modelos de cáncer inducidos en el pez cebra cubren un amplio espectro, incluyendo digestivo, reproductivo, sangre, sistema nervioso y epitelial 6. La utilización del pez cebra en la investigación del cáncer se ha expandido recientemente debido a la creación de modelos de xenoinjertos de células tumorales humanas en este organismo. Esto fue informado primero con células de melanoma metastásicos humanos que fueron arraigado con éxito en embriones de pez cebra en la etapa de blástula en 2005 11. Varios laboratorios independientes han validado la viabilidad de este trabajo pionero mediante la introducción de una amplia gama de mamíferos líneas de células cancerosas en el pez cebra en diversos sitios y etapas de desarrollo 5 &lt;/ Sup&gt;. Por ejemplo, las inyecciones de cerca el blastodisco y blastocisto de la blástula; inyecciones en el saco vitelino, el espacio perivitelino, conducto de Cuvier (Doc), y la vena cardinal posterior de 6-h- a los embriones 5 días de edad; y las inyecciones en la cavidad peritoneal de larvas inmunosuprimidos 30 días de edad, se han realizado 5, 12. Además, también se informó de trasplantes tumorales alogénicas en el pez cebra 12, 13. Una de las grandes ventajas del uso de xenoinjertos es que las células de cáncer de injertado pueden ser fácilmente marcadas fluorescentemente y se distinguen de las células normales. Por lo tanto, las investigaciones sobre los comportamientos dinámicos de formación microtumor 14, la invasión de células y la metástasis 15, 16, 17, la angiogénesis inducida por el tumor 15, 18, y las interacciones entre las células cancerosas y factores del huésped 17 puede visualizarse claramente en el cuerpo de pescado vivo, especialmente cuando se aplican líneas de pez cebra transgénico 5. Inspirado por el alto potencial de modelos de xenoinjerto de pez cebra para evaluar la metástasis, hemos demostrado las propiedades de extravasación transvascular de diferentes líneas celulares de cáncer de mama en la zona tailfin de Tg (fli: EGFP) embriones de pez cebra a través de inyecciones Doc 16. El papel de factor de crecimiento transformante-β (TGF-β) proteína 16 y morfogenética ósea (BMP) 19 vías de señalización en la invasión de células del cáncer de pro- / anti-mama y la metástasis se investigó también en este modelo. Por otra parte, también recapitulado la capacidad intravasación de diversas líneas celulares de cáncer de mama en circulación utilizando modelos de pez cebra de xenoinjerto con inyecciones espacio perivitelino. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Este artículo presenta los protocolos detallados para modelos de xenoinjertos de pez cebra en base a la inyección de células de cáncer de mama humano en el espacio perivitelino o Doc. El uso de imágenes de fluorescencia de alta resolución, se muestra el proceso de representante de intravasación en los vasos sanguíneos y el comportamiento invasivo de las diferentes células de cáncer de mama humano, que se mueven de los vasos sanguíneos en el área de tailfin avascular.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>AGAF0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>300038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera enterotoxin&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>227035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP5 STED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-high glucose media containing L-glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 media containing L-glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21041025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools Inc</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>01-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165 FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>227035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>I-6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10A (M1) cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10Aras (M2) cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRM-HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual micromanipulator&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M3301R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-97&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-tip Pasteur pipette (0,5-20 ul)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>F276456I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-VSVG plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLV-mCherry plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>36084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic picoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>107689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 4 software</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-REV plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg (fli:EGFP) zebrafish strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base&#160;</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>11814273001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (3-aminobenzoic acid)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>A-5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.5%)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, polystyrene (60 &#215; 15 mm)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>P5481-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene dish with glass bottom</td>
			<td>WillCo</td>
			<td>GWST-5040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

invasive behavior of human breast cancer cells in embryonic zebrafish

En muchos casos, los pacientes con cáncer no mueren de un tumor primario, sino más bien debido a la metástasis. Aunque numerosos modelos de roedores están disponibles para el estudio de la metástasis del cáncer in vivo, se necesitan otros, modelos de bajo costo eficientes y fiables para acceder rápidamente a los efectos potenciales de (epi) cambios genéticos o compuestos farmacológicos. Como tal, ilustrar y explicar la viabilidad de modelos de xenoinjertos utilizando células de cáncer de mama humanas inyectadas en embriones de pez cebra para apoyar este objetivo. Bajo el microscopio, proteínas fluorescentes o células de cáncer de mama humano marcado químicamente se trasplantan en embriones de pez cebra transgénico, Tg (fli: EGFP), en el espacio perivitelino o conducto de Cuvier (Doc) 48 h después de la fertilización. Poco después, el proceso temporal-espacial de la invasión de células cancerosas, la difusión y la metástasis en el cuerpo de los peces que viven se visualizó en un microscopio fluorescente. Los modelos usando diferentes sitios de inyección, es decir, porespacio ivitelline o Doc son complementarios entre sí, lo que refleja la etapa temprana (etapa intravasación) y la etapa tardía (etapa extravasación) de la cascada metastásica de múltiples etapas de los acontecimientos. Por otra parte, la angiogénesis peritumoral y intratumoral se puede observar con la inyección en el espacio perivitelino. todo el período experimental no más de 8 días es. Estos dos modelos combinan el etiquetado celular, micro-trasplante, y las técnicas de imagen de fluorescencia, lo que permite la rápida evaluación de la metástasis del cáncer en respuesta a las manipulaciones genéticas y farmacológicas.

En el modelo de pez cebra xenoinjerto embrionario con una inyección espacio perivitelino, la diseminación hematógena de células cancerosas marcadas en el cuerpo de pescado se considera como la migración activa. Este proceso puede ser detectado y cuantificado en un microscopio fluorescente, como se describe en los métodos anteriores. Para ilustrar este modelo de xenoinjerto, seguimos el proceso de difusión de diferentes líneas celulares de cáncer de mama con conocida (o sin) inva...

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Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

A continuación, describimos los modelos de pez cebra de xenoinjerto utilizando dos sitios de inyección diferentes, es decir, espacio perivitelino y el conducto de Cuvier, para investigar el comportamiento invasivo y para evaluar el potencial intravasación y la extravasación de células de cáncer de mama humano, respectivamente.

El comportamiento invasivo de las células del cáncer de mama humano en embriones de pez cebra

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

The overall goal of this microinjection of human breast cancer cells into embryonic zebrafish is to investigate the invasive behavior and assess the metastatic potential of human breast cancer cells. This method can help to answer key questions regarding intravasation and extravasation to critical processes in cancer metastasis. The main advantage of this technique is that it provides an elegant, rapid, and cheap in vivo model to measure the ability of cancer cells to invade and metastasize.The implications of this technique extend towards the development of new pharmacological compounds with anti-metastatic activity. Though this measure can provide insight into cancer emission and the metastasis, it can also be applied to study some other phenomena, such as peritumoral angiogenesis and cancer cell dormancy. To begin, culture transduced human breast cancer MDA-MB-231 cells, breast epithelial MCF10A cells, and breast epithelial MCF10A-Ras cells in a T75 flask.Once the transduced cells reach 80%confluence, remove the medium from the T75 flask, wash the cells with phosphate-buffered saline, and detach the cells with 0.5%Trypsin-EDTA solution. Then neutralize the Trypsin with medium. Next, centrifuge the cells at 1, 000 RPM for five minutes to remove the medium, wash them with PBS, and centrifuge the sample one more time.After washing, resuspend the cells in approximately 200 microliters of PBS to obtain a suspension of no more than 1 x 10 to the eighth cells per milliliter. Store the cell suspension in four degrees Celsius for no longer than five hours. To prepare zebrafish embryos for implantation, incubate approximately 60 embryos in a petri dish filled with egg water, supplemented with 60 micrograms per milliliter of sea salts at 28 degrees Celsius.Then, using fine tweezers, remove the coriands from the embryos at 48 hours post-fertilization. To anesthetize the embryos for the implantation procedure, transfer them to a 40 microgram per milliliter solution of tricaine in egg water. Prior to the implantation, prepare injection needles.To do this, load a borosilicate microcapillary tube into a micro-pipette puller and pull the needle. Store the prepared needles in a needle-holder plate until needed. Aspirate 15 microliters of the prepared cell suspension into an injection needle.Next, attach the needle to a micromanipulator, and, using fine tweezers, break its tip to five to 10 microns. Adjust the pneumatic PICO pump and inject cells onto the petri dish pre-coated with sterile 1%agarose. Then, transfer approximately 10 anesthetized embryos at two to three days post-fertilization onto a flat injecting plate coated with 1%agarose.Arrange the position of the embryos with a hair loop tool so that they are oriented in the same direction. While injecting, manually adjust the injection plate position to place the embryos in a diagonal orientation, which is preferred for a precise needle insertion. Direct the needle tip at the injection site and gently insert it into the perivitelline space localized between the yolk sac and the paraderm of the zebrafish embryo.Lastly, inject approximately 400 tumor cells labeled with mCherry. Make sure not to rupture the yolk sac to avoid a misplaced implantation. To inject the cells into the duct of Cuvier, approach the vein from the dorsal side of the embryo with the needle kept at a 45-degree angle.Insert the needle at the starting point of the duct of Cuvier, localized dorsally to the point where the duct starts broadening over the yolk sac. Then, inject approximately 400 cells. Finally, transfer the injected zebrafish embryos to the egg water, and incubate them at 33 degrees Celsius until further analysis.To visualize metastasis, with a Pasteur pipette, transfer the injected zebrafish embryo to a glass-bottom polystyrene dish and remove excess egg water. Image the whole body of the embryo with a confocal microscope set to low magnification to obtain a general pattern of tumor cell dissemination. Use a 488 nanometer laser to visualize the zebrafish embryo vasculature, and a 543 nanometer laser to visualize implanted tumor cells labeled with red fluorescent marker.Next, scan the embryo in eight to 10 steps to acquire a high-quality image. Presented here are photographs of zebrafish embryos that were taken with a confocal microscope three days after perivitelline injection of MDA-MB-231 cells. MDA-MB-231 cells widely disseminated within the zebrafish body, manifesting highly invasive potential.MCF10A-Ras cells, when implanted to zebrafish embryos, revealed moderate invasive capacity with only a few cells spread to distant parts of the body. Upon transplantation, MCF10A cells remained non-invasive and concentrated within the injection site, confirming that all studied cells reveal different invasive potential. The highly invasive character of MDA-MB-231 cells was reflected in their enhanced migration capacity observed within the perivitelline space.To some extent, such migration was also observed for MCF10A-Ras cells. On the contrary, MCF10A cells did not migrate in the perivitelline space. Distinct metastatic behavior of MDA-MB-231 and MCF10A-Ras cells was also observed when both cell types were implanted into the embryos'duct of Cuvier.As shown, MDA-MB-231 cells migrated independently of one another, while MCF10A-Ras were prone to migrate in clusters. Following this procedure, other measures like immunofluorescence can be performed in order to answer additional questions, such as how cancer cells proliferate in the zebrafish, and how they affect the surrounding host of cells. After watching this video, you will have a good understanding of how to use zebrafish model to study an invasive behavior and assize intravasation and extravasation capacity of human breast cancer cells.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

Intra-ilíaca Arteria inyección de Modelamiento eficiente y selectiva de microscópico metástasis en los huesos

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

La utilización de la genómica funcional de selección para identificar dianas farmacológicas potencialmente nueva en la celda cáncer culturas Esferoide

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio)

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish Danio Rerio

Prueba de la capacidad vascular invasiva de células cancerosas en el pez cebra (<em&gt; Danio rerio</em&gt;)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression.  Traditional in vitro models of cancer cell invasion of ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Imagen intravital longitudinal del comportamiento de las células tumorales cerebrales en respuesta a una biopsia quirúrgica invasiva

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Estudio del triple cáncer de mama negativo con el modelo de cáncer de mama ortotópico

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Evaluación In Vitro de la Transformación Oncogénica en Células Epiteliales Mamarias Humanas

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Aislamiento y evaluación funcional de células madre de cáncer de mama humano a partir de muestras de células y tejidos

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

Modelado del cáncer de mama en el tejido mamario humano utilizando un sistema microfisiológico

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

Modelado de metástasis cerebral mediante inyección en la vena de cola de células inflamatorias de cáncer de mama

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...