Name: open-source single-particle analysis for super-resolution microscopy with virusmapper
Uploaded: 2017-04-09T13:00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить Корина Бирли Джерзи Самолеж, Педро Матос Pereira, Кристофер Блек и Катрин Шерер за их вклад в первоначальную разработку и валидацию VirusMapper. Мы хотели бы также поблагодарить Артур Якимович за критическое прочтение рукописи. Эта работа финансируется за счет грантов от биотехнологии и биологических наук Исследовательского Совета (BB / M022374 / 1) (RH); Основное финансирование в лаборатории MRC для молекулярной биологии клетки, University College London (JM); Исследовательский Совет Европы (649101-UbiProPox) (JM); и Совет по медицинским исследованиям (MR / K015826 / 1) (RH и JM). RG финансируется инженерных и физических наук Исследовательского Совета (EP / M506448 / 1).

<ol>
	<li>Henriques, R., Griffiths, C., Rego, E. H., Mhlanga, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PALM+and+STORM:+Unlocking+live-cell+super-resolution.">PALM and STORM: Unlocking live-cell super-resolution.</a> Biopolymers. 95 (5), 322-331 (2011).</li><li>Gustafsson, N., Culley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+live-cell+conventional+fluorophore+nanoscopy+with+ImageJ+through+super-resolution+radial+fluctuations.">Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations.</a> Nat Commun. 7, 12471 (2016).</li><li>Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Primer+to+Single-Particle+Cryo-Electron+Microscopy.">A Primer to Single-Particle Cryo-Electron Microscopy.</a> Cell. 161 (3), 438-449 (2015).</li><li>Szymborska, A., de Marco, A., Daigle, N., Cordes, V. C., Briggs, J. A. G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+pore+scaffold+structure+analyzed+by+super-resolution+microscopy+and+particle+averaging.">Nuclear pore scaffold structure analyzed by super-resolution microscopy and particle averaging.</a> Science. 341 (6146), 655-658 (2013).</li><li>Broeken, J., Johnson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+improvement+by+3D+particle+averaging+in+localization+microscopy.">Resolution improvement by 3D particle averaging in localization microscopy.</a> Methods Appl Fluoresc. 3 (1), 14003 (2015).</li><li>Burns, S., Avena, J., Unruh, J., Yu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structured+illumination+with+particle+averaging+reveals+novel+roles+for+yeast+centrosome+components+during+duplication.">Structured illumination with particle averaging reveals novel roles for yeast centrosome components during duplication.</a> Elife. , (2015).</li><li>Lelek, M., Di Nunzio, F., Henriques, R., Charneau, P., Arhel, N., Zimmer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+imaging+of+HIV+in+infected+cells+with+FlAsH-PALM.">Superresolution imaging of HIV in infected cells with FlAsH-PALM.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 109 (22), 8564-8569 (2012).</li><li>Laine, R. F., Albecka, A., Svan de Linde, ., Rees, E. J., Crump, C. M., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+herpes+simplex+virus+by+optical+super-resolution+imaging.">Structural analysis of herpes simplex virus by optical super-resolution imaging.</a> Nat Commun. 6, 5980 (2015).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Gray, R. D. M., Beerli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VirusMapper:+open-source+nanoscale+mapping+of+viral+architecture+through+super-resolution+microscopy.">VirusMapper: open-source nanoscale mapping of viral architecture through super-resolution microscopy.</a> Sci Rep. 6, 29132 (2016).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J of Micros. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission:+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy.">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt Let. 19 (11), 780 (1994).</li><li>Chung, C. -. S., Chen, C. -. H., Ho, M. -. Y., Huang, C. -. Y., Liao, C. -. L., Chang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+proteome:+identification+of+proteins+in+vaccinia+virus+intracellular+mature+virion+particles.">Vaccinia virus proteome: identification of proteins in vaccinia virus intracellular mature virion particles.</a> J Virol. 80 (5), 2127-2140 (2006).</li><li>Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxviridae:+the+viruses+and+their+replication.">Poxviridae: the viruses and their replication.</a> Fields virology. , (2010).</li><li>Condit, R. C., Moussatche, N., Traktman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+a+nutshell:+structure+and+assembly+of+the+vaccinia+virion.">In a nutshell: structure and assembly of the vaccinia virion.</a> Adv Virus Res. 66 (6), 31-124 (2006).</li><li>Schmidt, F. I., Bleck, C. K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+entry+is+followed+by+core+activation+and+proteasome-mediated+release+of+the+immunomodulatory+effector+VH1+from+lateral+bodies.">Vaccinia virus entry is followed by core activation and proteasome-mediated release of the immunomodulatory effector VH1 from lateral bodies.</a> Cell Rep. 4 (3), 464-476 (2013).</li><li>. Nanoj-virusmapper Available from: <a target="_blank" href="https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper">https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper</a> (2016)</li><li>Fortun, D., Guichard, P., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+From+Multiple+Poses+in+Fluorescence+Imaging:+Proof+of+Concept.">Reconstruction From Multiple Poses in Fluorescence Imaging: Proof of Concept.</a> IEEE J Sel Topics Signal Process. 10 (1), 61-70 (2016).</li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

С помощью этого метода исследователи оснащены, чтобы объединить мощь SPA и SR микроскопии с целью получения высокой точности, многоканальные 2D модели архитектуры белков вирусов и других макромолекулярных комплексов. Тем не менее, некоторые важные соображения должны быть приняты во внимание. Семена должны быть выбраны, чтобы представить структуру, которая последовательно видел. Таким образом, исходные данные должны быть проверены тщательно перед выбраны семенами. Это важно для предотвращения предвзятых моделей. Выбор может быть подтвержден рассмотрением минимального пороговых значений подобия, необходимых для включения определенного количества частиц в моделях. Ясно, что при выборе семян, тем выше этот порог должен быть для заданного числа частиц, тем более, что структура является очевидной в данных. Концепция согласования шаблона является особенно полезной, когда существует гетерогенность в данных. Все различные структуры, которые VIsible должна быть определена и различные модели созданы для каждого случая. При разделении гетерогенных структур в одном канале, но одновременно создавая модели во втором канале, узоры могут возникнуть, что бы не было сразу видно. Еще одно соображения необходимо учитывать при использовании этого алгоритма является то, что итерационная процедура будет максимально стохастическая асимметрия. Например, при моделировании структуры с двумя симметричными максимумами, все небольшие асимметрии между максимумами будут выровнены друг с другом во время итерации, и окончательная модель будет, таким образом, максимально асимметрична. Если это не отражает известную симметрию в структуре моделируемого, то это должно быть принято во внимание. В настоящее время единственный способ избежать этого максимизации, чтобы ограничить число итераций 1, хотя потенциал развитие будет для VirusMapper включать ось симметрии в процесс генерации модели. Любые новые версии VirusMapper будет AvaiКонтрактное на который ссылается веб - сайт (см Материалы таблицу). Кроме того, пользователи найдут FAQ здесь, чтобы ответить на любые общие запросы. Программное обеспечение, как описано применимо к любой структуре, которая может быть отображена с достаточным разрешением, чтобы визуализировать функции, которые пользователь желает, чтобы смоделировать. Хотя SPA может улучшить разрешение, это явно не улучшит видимость компонентов, которые в противном случае не видны. Этот протокол не является, следовательно, способом улучшения качества данных. Как и с любой техникой, тщательной подготовки проб и оптимизации стратегии формирования изображения обеспечит чистейшие данные и лучшие модели результирующие. Выбор метода визуализации SR также имеет важное значение и, в целом, будет зависеть от образца под рукой. VirusMapper была подтверждена хорошо работать с SIM - картой и STED 10, и она также может быть использована с данными локализации микроскопии высокого качества, но следует соблюдать осторожность в этом случае,как разреженная маркировка может вызвать проблемы, аналогичные асимметрии максимизации. В настоящее время VirusMapper является единственным в свободном доступе алгоритма для анализа одночастичного флуоресцентных изображений и только общего назначение 2D SPA усреднения программного обеспечения. Другие исследования , которые сделали использование одних и тех же принципов , 4, 6, 8 использовали специальное программное обеспечение специализированное для каждого конкретного исследования. Алгоритмы общего назначения для реконструкции 3D данных были опубликованы 5, 18, хотя программное обеспечение не было. При использовании, как описаны в этой статье, VirusMapper может быть использован для получения точных, точные и надежных моделей макромолекулы архитектуры белков вирусов и других комплексов. С помощью этих моделей исследователи могут принимать точные измерения средних размеров структурыУРЭС изучаемые, потенциально позволяя им достичь биологические выводы, которые иначе не могли бы было возможно. Кроме того, с возможностями многоканальных этой техники, можно сопоставить неограниченное количество белков и компонентов внутри комплексов и обнаружить новую организацию белка. Изучение изменений в наноразмерных структурах в различных биологически соответствующих условиях, например, разные стадиях жизненного цикла вируса, имеет потенциал, чтобы предложить ценную информацию в биологию.

Супер-разрешение (SR) микроскопия оказала большое влияние на клеточной биологии, предоставляя возможность для изображения основных молекулярных процессов наряду с молекулярной конкретной маркировкой решающей значения для их понимания. SR теперь позволяет световой микроскопии , чтобы приблизиться к разрешения (20-150 нм) ранее только достижимые с электронной микроскопии (ЭМ), сохраняя при этом основные преимущества световой микроскопии, такие как потенциал для изображения живых клеток 1, 2. Кроме того, структурное сохранение найти на наноуровне позволяет применение анализа одночастичного (SPA) -SR данных, концепция широко используется в электронной микроскопии 3. Используя SPA, многие высоко консервативны копии структуры могут быть отображены и в среднем вместе, чтобы улучшить разрешение, точность, или отношение сигнал-шум визуализируемого объекта. При использовании в сочетании с SR, СП был продемонстрирован, чтобы быть мощным инструментом для высокого рrecision отображение компонентов комплекса пор ядерной 4, 5, 6, центросомах и вирусы, такие как ВИЧ , 7 и HSV-1 8. Однако, процедура комбинированное применение SR и SPA была поставлена ​​под сомнение из-за отсутствия доступного программного обеспечения. По этой причине мы разработали VirusMapper, плагин для популярного программного обеспечения для обработки изображений ImageJ / Фиджи 9. Это первый свободно доступный пакет программного обеспечения для обобщенной SPA с флуоресцентными изображениями 10 , предназначенных для обеспечения быстрого, удобный, многоканальное наивное усреднения структур изображаемых с SR микроскопией. Несмотря на то, предназначены для вирусов, он может быть применен к любому макромолекулярному комплексу, в котором различные молекулярные частицы могут быть отображены, идентифицированный и локализованным. VirusMapper может быть использован для получения высокой точности молекулярныхмодели любой известной структуры, что позволяет для расчета средних размеров и других параметров. Дизайн алгоритма делает его особенно полезным для разделения популяций структур, обеспечивающее для определения различных ориентаций или различных морфологических состояний. Кроме того, многоканальное формирование изображение может быть использовано для использовать опорный канал в тех случаях, когда основная структура хорошо известно, тем самым позволяя для обнаружения опорной на основе структуры. Инструкции по загрузке и установке программного обеспечения предоставляются на <a href="https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper">https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper</a> . Пример данных также можно найти там, и пользователям рекомендуется практиковать с помощью программного обеспечения на примере данных, прежде чем пытаться применить его к своей собственной. Здесь шаги для использования этого плагина для создания SPA модели из исходных данных описаны. Программное обеспечение принимает сырые изображения, содержащих одинарные Oг мульти-меченые структуры в качестве входных данных. Он возвращается, с учетом ряда параметров, которые настраиваются как программное обеспечение запускается, модели SPA, показывающие средние распределения меченых компонентов в пределах изображаемых структур. Целью данного протокола является получение точных SPA модели , дающей средние локализаций компонентов внутри отображенных структур в соответствии с трубопроводом , описанным на фиг.1. Как показано на рисунке 1, рабочий процесс программного обеспечения целесообразно разделить на три этапа. Первая стадия заключается в сегменте больших изображений, что приводит к стопкам частиц для каждого канала. Эти частицы являются единицами, которые будут усреднены для создания моделей и для производства семян для генерации модели. Второй этап заключается в создании семенных изображений, которые используются, чтобы зарегистрировать весь набор частиц в конечной стадии. Это делается путем выбора опорного канала и ручной выбор частиц в этом канале, что будет способствовать сeeds. Семена выбираются в этом опорном канале, но могут быть сгенерированы для всех каналов. Частицы первоначально перестроены путем установки 2D гауссово в этом канале. Все частицы, которые были выбраны и пересмотренные затем усредняются для получения семян. Для каждой общей структуры видели в данных, которые должны быть смоделированы, частицы должны быть выбраны в качестве семян, которые четко и точно представляют эту структуру. Интерфейс на этом этапе также полезен для сканирования данных для таких структур. На заключительном этапе для создания моделей с помощью сопоставления шаблона. Это достигается за счет регистрации частиц, первоначально экстрагированных к семенам изображений, полученных в предыдущем разделе по кросс-корреляции. Подмножество зарегистрированных частиц в среднем вместе, и процесс далее итерация, чтобы уменьшить модель среднеквадратичной ошибки, если это желательно. Это подмножество определяется путем установки минимального сходства против семени, которое должно быть выполнено. При создании моделиев одновременно в нескольких каналах, совместное сходство, или среднее значение сходства для каждого канала, используются. Полученные модели и зарегистрированные частицы, которые способствовали их могут быть затем дополнительно проанализированы.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Open-source image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoJ-VirusMapper</td>
			<td>developed by the Henriques lab</td>
			<td></td>
			<td>Open source-Fiji plugin (https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield antifade mounting medium</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elyra PS1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN BLACK</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software for SIM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance coverslip</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>&#160;474030-9000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpeck beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>T7279</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

open-source single-particle analysis for super-resolution microscopy with virusmapper

Супер-разрешение флуоресцентная микроскопия в настоящее время реконструирует исследования клеточной биологии. Его способность сломать предел разрешения около 300 нм позволяет для рутинного визуализации наноразмерных биологических комплексов и процессов. Это увеличение разрешения также означает, что методы популярные в электронной микроскопии, такие как анализ одночастичного, могут быть легко применены к супер-разрешение флуоресцентной микроскопии. Комбинируя этот аналитический подход с оптической визуализацией сверхвысокого разрешения, становится возможным воспользоваться молекулами конкретной маркировки емкости флуоресцентной микроскопии для генерации структурных карт молекулярных элементов внутри метастабильной структуры. С этой целью мы разработали новый алгоритм - VirusMapper - упакованное в качестве простого в использовании, высокая производительность, и высокой пропускной способностью ImageJ плагин. Эта статья представляет собой подробное руководство для этого программного обеспечения, демонстрируя свою способность раскрыть новые структурные особенности в биологических мolecular комплексы. Здесь мы представляем, как собрать совместимые данные и предоставлять протокол шаг за шагом о том, как использовать этот алгоритм, чтобы применить анализ одночастичную к изображениям супер-разрешением.

Здесь мы демонстрируем программное обеспечение на модель поксвирусной, вирус коровьей оспы. Одним из наиболее сложных вирусов млекопитающих, коровьих пакетов около 80 различных белков в пределах 350 х 270 х 250 нм 3 кирпич-образной форме частицы 13, 14. Три подструктур различимы с помощью электронной микроскопии: центральное ядро, которое содержит геном днДНКа; две белковые структуры, называемые боковые тела, которые фланкируют ядро; и один протеолипидный бислой конверт 15. Большой размер, сложная структура, и аменабельность с рекомбинантным белком флуоресцентного мечения сделать осповакцины отличной систему, чтобы продемонстрировать рабочий процесс VirusMapper. Используя программное обеспечение, как описано здесь, распределение различных белков на коровьем вирионе может быть смоделировано. Белок был маркирован и отображается, возможно, в комбинации с другим белком, известным распределением в качестве эталона, и программное обеспечение было использовано, как описано для получения средних моделей локализации этого белка на частицу. В этом примере два белка были смоделирована, внутренний L4 ядра белка, и основной компонент F17 бокового тела. Рекомбинантный вирус коровьей оспы , который имеет F17 с меткой GFP и L4 с меткой была использована mCherry 16. Очищенный вирус разводили в 1 мМ Трис, рН 9, и связан с покровными промывают, высокопроизводительного путем покрытия их в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем образцы фиксировали с применением 4% формальдегида в PBS в течение 20 мин. Покровные были немедленно установлены на слайдах antifade монтажной среды. Визуализация проводили с помощью SIM-карты на коммерческую SIM микроскопе. Поле зрения был выбран, содержащий сотни вирусов и изображения были получены с использованием 5 фазовых сдвигов и 3 сетки вращения с 561 нм (32 мкм решетки PeRIOD) и 488 нм (32 мкм периода решетки) лазеров. Изображения были получены с помощью камеры sCMOS и обрабатываются с помощью программного обеспечения микроскопа. Каналы были выровнены на основе разноцветного бисера слайда изображаемого с теми же параметрами захвата изображений. После реконструкции и выравнивания канала изображения SIM были открыты в Фиджи и объединены в один стек изображения. Вирусные частицы были извлечены из изображений с использованием канала L4 в качестве эталона и без применения какого-либо Гауссово размывания, так как эти частицы имеют центральный максимум. Около 15000 частиц были извлечены в этом эксперименте. Из-за геометрии коровьей оспы, боковые тела имеют отчетливо различный внешний вид, основанный на ориентации вируса. Мы визуализировали две ориентации, в которой один или два боковых тела можно было различить. Мы ссылались на эти ориентации как фронтальные и сагиттальные, по отношениюively. Отдельные семена для фронтальной и сагиттальной ориентации были выбраны путем поиска списка частиц на стадии «Генерировать Семена» (фиг.4 и 5); Частицы, которые явно находились в одной ориентации или другие были выбраны. Канал L4, был использован в качестве опорного канала для выравнивания семян друга с другом. Опять же, не Гауссово размывание не было необходимости. 5 частиц для каждой ориентации были выбраны и были усреднены для получения семян. Модели были созданы для каждой ориентации на основе этих семян. были использованы Ни опорный канал, ни квадратов значений интенсивности. Максимальное число итераций было установлено изначально на 1, а минимальное сходство было установлено, чтобы включать в себя около 1000 частиц в каждом случае, что дало последовательное возникновение для каждой ориентации. Максимальное число итераций затем увеличивали допозволяют сходимости модели. Модели были , таким образом , генерируется для двух ориентаций в двух каналах (рисунок 7). <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/55471/55471fig1.jpg" /> Рисунок 1: VirusMapper рабочий процесс. Плагин состоит из трех основных этапов. Вирусные частицы извлекаются из больших изображений, шаблонов изображений или семена выбирают полу-вручную из данных, и конечные модели SPA генерируются из данных со ссылкой на семена. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55471/55471fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55471/55471fig1large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55471/55471fig1large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/55471/55471fig2.jpg" /> Рисунок 2: «Извлечение Вирусные структур» диалог. При выборе «Extract Вирусный Структур<html> эс», это диалоговое окно появится. Эти параметры должны быть заполнены с начальными оценками для оптимальной сегментации.„Показать предварительный просмотр“ , то можно выбрать, позволяя трансформирование быть просмотрено и параметры , чтобы быть доработаны. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55471/55471fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55471/55471fig2large.jpg" target="_blank">нажмите здесь для просмотра большая версия этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/55471/55471fig3.jpg" /> Рисунок 3: Установка параметров экстракции. После предварительного просмотра трансформирования, которые будут извлечены, радиус ROI, количество трансформирования, и максимальный ROI перекрытия регулируют так, чтобы достичь подобной ситуации. Трансформирования немного больше, чем частицы, все частицы включены в ROI и трансформировании могут перекрываться в достаточной степени, чтобы позволить частицы кластерных быть разделены.апк &quot;&gt; Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/55471/55471fig4.jpg" /> Рисунок 4: Создание семян , соответствующих шаблонов. «Создать Seeds» Диалог (1) устанавливает параметры, которые будут назначены. Последовательность опорных частиц (2) позволяет пользователю сканировать через частицы в опорном канале. Когда частица рассматриваются в последовательности опорных частиц перераспределяются частицы для всех каналов можно рассматривать в перераспределяемых предварительных просмотрах частиц (3). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55471/55471fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55471/55471fig4large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55471/55471fig4large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 5" src="/files/ftp_upload/55471/55471fig5.jpg" /> Рисунок 5: Добавление семян изображений. Как семена добавляют к<html> «Рамки использовать» окно, (5) отображаются среднее значение всех семян (4) и кадры участвуют. Частицы, которые похожи на нынешние средние семена предлагаются в диалоговом окне (6). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55471/55471fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55471/55471fig5large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55471/55471fig5large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 6" src="/files/ftp_upload/55471/55471fig6.jpg" /> Рисунок 6: «Сформировать модели» диалоговое окно. При выборе «Сформировать модели на основе семян» появится это диалоговое окно. Параметры должны быть заполнены начальными оценками для выработки оптимальной модели, и элементы процедуры генерации модели, которые будут показаны во время расчета должны быть выбраны. «Показать предварительный просмотр», то может быть выбран, позволяя процесс генерации модели для запуска и параметры, чтобы быть доработаны.ftp_upload / 55471 / 55471fig6large.jpg»целевых =„_blank“&gt; Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. <img alt="Рисунок 7" src="/files/ftp_upload/55471/55471fig7.jpg" /> Рисунок 7: Модели , созданные с VirusMapper. Коровья оспа вирионы с коровым белком L4 меченого с mCherry и белком тела F17 бокового помеченный EGFP были обследованы с помощью SIM-карты. Модели были затем генерируется с помощью программного обеспечения, как описано в протоколе. Две ориентации, фронтальная и сагиттальная, отличаются по внешнему виду боковых тел. Шкала бар = 100 нм. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55471/55471fig7large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55471/55471fig7large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55471/55471fig7large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper at JoVE.com

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Эта рукопись использует Фиджи на основе открытого исходного пакета программного обеспечения VirusMapper для применения анализа одночастичных образами микроскопии сверхвысокого разрешения для того, чтобы генерировать точные модели наноразмерной структуры.

С открытым исходным кодом Анализ Одночастичного для супер-разрешение микроскопии с VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Research

JoVE Journal

Biology

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Одной частицы электронной микроскопии Реконструкция комплекса Exosome Использование случайных Коническая Метод Tilt

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Super-Resolution Imaging бактериального Машины отдела

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

Опытные образцы для оптимизации STORM супер-разрешения микроскопии

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Подготовка образцов для одной микроскопии атомной силы Virion и флуоресценции супер-разрешения

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Отслеживание и Количественная процессов развития в<em&gt; С. Элеганс</em&gt; Использование инструментов с открытым кодом

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

Трехмерная Суперразрешение Микроскопия F-актин филаментов интерферометрической фотоактивированного локализации микроскопии (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Open Source High Content Analysis Используя Автоматизированное время жизни флюоресценции визуализации микроскопии

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Основного состояния истощения суперразрешением изображений в клетках млекопитающих

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

Применение высокоскоростных суперразрешением скорость микроскопии в прямом первичной ресничку

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Изоляция и флуоресценции изображений для одной частицы реконструкция Хламидомонада Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...