Name: open-source single-particle analysis for super-resolution microscopy with virusmapper
Uploaded: 2017-04-09T13:00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper at JoVE.com

Vi vill tacka Corina Beerli, Jerzy Samolej, Pedro Matos Pereira, Christopher Bleck och Kathrin Scherer för deras bidrag till den ursprungliga utveckling och validering av VirusMapper. Vi vill också tacka Artur Yakimovich för hans kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete har finansierats med bidrag från bioteknik och Biological Sciences Research Council (BB / M022374 / 1) (RH); basfinansiering till MRC Laboratory för molekylär cellbiologi, University College London (JM); Europeiska forskningsrådet (649.101-UbiProPox) (JM); och Medical Research Council (MR / K015826 / 1) (RH och JM). RG finansieras av Engineering and Physical Sciences Research Council (EP / M506448 / 1).

OBS: Detta protokoll och video komplettera den ursprungliga pappers 10 beskriver programpaketet mer i detalj. Läsarna uppmanas att granska detta noggrant för ytterligare vägledning om användning av programvaran. Det finns tre huvudsakliga steg: partikel extraktion, vilka segment stora bilder till individuella partiklar; urval utsäde, där gemensamma strukturer identifieras i data och inriktad för att producera frön, som används i det slutliga steget; och modellgenerering, där mallmatchning baserat på dessa frön inriktar de extraherade partiklar och genomsnitten en delmängd för att producera de SPA modeller. 1. Setup innan du kör programpaketet <ol><li> Förbered prover av strukturen som studeras på ett täck eller i de relevanta försöksbetingelser. </li><li> Image proven med superupplösning fluorescensmikroskopi, såsom strukturerade belysning mikroskopi (SIM) 11 eller stimulated emissions utarmning (STED) 12 mikroskopi. OBS: De exakta detaljerna om hur man förbereder och bildprover beror till stor del på vilken typ av struktur som studeras, så relevant litteratur bör konsulteras. Som ett exempel, den exakta metoden för framställning och avbildning prover av vacciniavirus, såsom de som används här, beskrivs i resultaten avsnittet ombudet. </li><li> Skapa bilder av flera synfält som visar ett stort antal separata kopior av strukturen eller partiklar, företrädesvis tusentals. Bild partiklar som så väl åtskilda från varandra som möjligt och se till att bilderna är fria från smuts eller andra fluorescerande strukturer som inte är av intresse. </li><li> Öppna alla bilder som innehåller partiklarna i Fiji genom att dra filerna till Fiji verktygsfältet eller genom att välja &quot;Arkiv&quot;&gt; &quot;Open&quot;. </li><li> Välj &quot;Bild&quot;&gt; &quot;stack&quot;&gt; &quot;Verktyg&quot;&gt; &quot;Sätt ihop&quot; för att sammanfoga denbilder till en enda stapel. Sedan, om den resulterande bilden är en Hypers, förvandla det till en bunt genom att välja &quot;Bild&quot;&gt; &quot;Hyperstacks&quot;&gt; &quot;Hypers att stapla&quot;. OBS: Den slutliga stack bör ha inskjutna kanaler. Om det finns två kanaler, bör den första skivan i stapeln vara kanal 1 från den första bilden, bör den andra skivan vara motsvarande kanal 2, den tredje skiva bör vara kanal 1 från den andra bilden, och så vidare. </li></ol> 2. Extrahera Partiklar <ol><li> Välj bilden att segmentera och välj &quot;Extract Viral Structures&quot;. Välj var du vill spara de extraherade partiklarna och visa &quot;Utdrag Viral Structures&quot; dialogen (Figur 2). </li><li> Tilldela utvinning parametrar med första uppskattningarna genom att ange dem i &quot;Utdrag Viral Structures&quot; dialogen på följande sätt. Finjustera dessa parametrar efter att förhandsgranska bildsegmentering. <ol><li> Ställ number av kanaler i datasetet som antalet olika fluorescenskanaler som har avbildas (t.ex. två). </li><li> Ställa referenskanalen från vilken partiklar extraheras genom detektering av toppar i den kanalen genom att ange det antal val av kanal. Välja den mest konsekventa kanalen; dvs den kanal i vilken de flesta partiklarna har samma utseende. OBS: Om det är möjligt, kommer partiklar i denna kanal har en central maximum. </li><li> Välj om du vill använda en pre-detektion gaussisk oskärpa. Ställ före upptäckt Gaussisk oskärpa till 0 att tillämpa någon oskärpa; om detta värde ökas, en gaussisk oskärpa filter av den givna radien tillämpas före lokala maxima detektering. Använd den här funktionen om referenskanalen inte har en centralt maximum (t ex ringform); suddighet inducerar uppkomsten av en. OBS: Segmenterad områden av intresse (ROI) inte har Gaussisk oskärpa tillämpas på dem, eftersom den här funktionen är endast avseddd för att positionera ROI: er i referenskanalen. </li><li> Ställ in ROI radie (som kommer att ligger runt varje lokal maximum) i pixlar. Välja ett sådant värde att att ROI: er är något större än de största partiklarna, såsom i Figur 3. Till exempel om de största partiklarna verkar ha en diameter av omkring 30 pixlar (beräknade grovt genom ögat), sedan in ROI radie till 20 pixlar. </li><li> Ställa in antalet ROI att använda per ram till en initial, relativt litet värde under 100. </li><li> Ställ in maximal ROI överlappning. Om partiklarna är väl separerade, hålla denna lilla; Om partiklar är grupperade, öka detta för att aktivera de ROI att överlappa varandra. </li></ol></li><li> Välj &quot;Show Förhandsvisning&quot;. OBS: När denna väljs, kommer de extraherade ROI: er för referenskanalen associerad med den aktuella ramen visas. </li><li> Justera ROI radie, antalet ROI: er, och den maximala ROI lappn att ha ROI: er av lämplig storlek runt så många partiklar som möjligt, Såsom i figur 3. </li><li> Välj &quot;OK&quot; för att köra segmentering. Stäng bilden och ROI manager. OBS: Ändra inte namnen på de filer partikelmängder. Dessa namn måste vara i formatet &quot;Viral partiklar - channelX&quot; för de följande avsnitten. </li></ol> 3. Välj Seeds <ol><li> Välj &quot;Generera Seeds&quot;, välj den mapp där de extraherade partiklarna sparas, och visa den &quot;Generera Seeds&quot; dialogen och fönster (figur 4). </li><li> Tilldela första frö-urvalsparametrar genom att ange dem i &quot;Skapa Seeds&quot; dialogen, enligt följande. <ol><li> Ställa referenskanalen som kommer att monteras för att inrikta och centrum alla kanaler. Välja en kanal i vilken de flesta partiklarna har samma utseende och som har ett centralt maximum, om möjligt. </li><li> Markera kryssrutorna för alla kanaler som ett frö skall genereras. </li><li> Välj om fröna ska vara rotated 90 °. Använd den här funktionen för att få anpassning i linje med andra modeller </li><li> Välj om du vill använda en pre-anpassning gaussisk oskärpa. Ställ in oskärpa radien för varje kanal till 0 för att tillämpa någon oskärpa. Öka detta värde att tillämpa en gaussisk oskärpa filter av den givna radien före omläggningen. Använd denna funktion om partiklarna inte har en central maximum; suddighet inducerar uppkomsten av en. OBS: Frön kommer inte att ha oskärpa tillämpas, så som den här funktionen är bara för att få konsekvent inriktning. </li><li> Välja att använda skift korrigering att separat centrera frön för icke-referenskanalerna, även om inte rotera dem, genom att markera eller avmarkera de &quot;Shift korrigerings&quot; lådor för varje kanal. OBS: Använd detta om kanalerna inte är väl i linje med varandra; det kan också vara användbara för att rikta andra kanaler enbart i enlighet med hänvisningen, utan skift korrigering. </li></ol></li><li> Välj partiklar att använda som frön. Sök genom than partikel sekvensen för att finna en partikel som liknar den struktur som skall modelleras och registrera ramnumret. </li><li> Ange numret i &quot;Frames att använda&quot; rutan och fler fönster visas (Figur 5). Ange flera ramnummer separerade med kommatecken. </li><li> Visa utsädesramar och de resulterande genomsnittliga frön i fönstren som visas. OBS: Loggen kommer att föreslå frön liknar genomsnittet. </li><li> Justera referenskanalen, Gaussisk oskärpa radie och skiftkorrigeringsalternativ de att optimera fröet urvalsprocessen så att ett antal av utsädes ramar hittats har ett liknande utseende. Fortsätta lägga frön tills genomsnittliga frön skapas som på ett tillfredsställande likna strukturen ses i de data som ska modelleras. </li><li> Namn frön och var de kommer att sparas till och välj &quot;OK&quot; för att spara de sista frö bilder för senare användning i modell generation. </li></ol> 4. Generera Modeller <ol><li> Select &quot;Generera modeller baserade på frön&quot;, välj den mapp där de extraherade partiklarna sparas, och visa den &quot;Generera Modeller&quot; dialogen (Figur 6). </li><li> Ladda de frön för varje kanal med hjälp av kryssrutorna. OBS: Frön sparas i en undermapp som namnges i &quot;Skapa Seeds&quot; dialog. Standardnamnet är &quot;analys&quot;. Var noga med att välja utsäde Medelvärden, inte ramar, som också sparas som referens. </li><li> Tilldela ursprungliga modellen generation parametrar genom att ange dem i &quot;Skapa modeller&quot; dialogen, enligt följande. Finjustera dessa parametrar senare. <ol><li> Välja att använda en referenskanal för inriktning, som beräknar översättningar och rotationer endast från referenskanalen och överför dem till alla kanaler. Om du använder det här alternativet välja kanal som ska användas som referens. OBS: Detta alternativ ska endast väljas för att specifikt använda en kanal som REFEREiou, såsom om gör referens baserad struktur upptäckt. Annars kommer det att resultera i mindre korrekta modeller. Kanalerna bör vara väl i linje om du använder det här alternativet. </li><li> Välj om du vill square bildintensiteter under mallmatchning. Detta kommer att accentuera små skillnader, så använd detta när du skapar en modell som har särskilt subtila funktioner. </li><li> Välj en minsta likhet mot frö genom att använda &quot;Minimum likheten mot frö&quot; reglaget eller genom att ange ett nummer i rutan. OBS: endast partiklar med en likhet med frön större än denna cut-off kommer att användas. 60-80% är vanligen ett bra val att börja med. </li><li> Ställ in maximalt antal iterationer till 1, optimera den minsta likhet mot säd och öka den senare efter behov. </li><li> Markera kryssrutorna för att välja de delar av modellen generation process som kommer att visas. OBS: &quot;Visa frön&quot; kommer att visa frön som har laddats med lås på toppen av dialogrutan. &quot;Visa modeller&quot; kommer att visa alla upprepningar av de modeller som skapas från genomsnittet av de delmängd av partiklar som uppfyller minimi likheten mot frö. &quot;Show MSE&quot; kommer att visa en medelkvadratfel (MSE) bild som belyser de områden i modellen som är mest rörliga. &quot;Visa partiklar&quot; visas den undergrupp av partiklar som används för att skapa modeller, registreras i enlighet med den högsta iteration av modellen som visas. </li></ol></li><li> Välj &quot;Visa förhandsgranskning&quot; för att generera förhandsgranska modeller och se resultatet. OBS: Detta är den mest beräkningsintensiva steg i processen. Gångtiden för en uppsättning av ett par tusen partiklar med en diameter på några tiotals pixlar på en stationär dator bör vara cirka 10 minuter. Om beräkningstiden är ett problem, bör användarna först försöka algoritmen på en mindre delmängd av data eller använda en mindre ROI radie i steg 2.2.4, om möjligt. </li><li> Visa genererad modeller och optimera de parametrar, särskilt den minsta likheten mot frö. Öka minimi likheten mot utsäde tills enda sanna partiklar av det modellerade morfologi är inkluderade i modellen. </li><li> Öka det maximala antalet iterationer genom att använda &quot;Maximalt antal iterationer&quot; reglaget eller genom att ange ett nummer i rutan och låta modellen genereringsprocessen att iterera. Använd ett värde runt 10 för maximal iteration. </li><li> Namn modeller och välj &quot;OK&quot; för att spara modell evolution staplar som innehåller alla upprepningar av den slutliga modellen generation process. OBS: Om minimi likheten mot frö är så hög att inga partiklar har denna likhet kommer ingenting att uppdateras. Om plugin verkar frysas, överväga möjligheten att minimi likheten är för hög. </li></ol>

<ol>
	<li>Henriques, R., Griffiths, C., Rego, E. H., Mhlanga, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PALM+and+STORM:+Unlocking+live-cell+super-resolution.">PALM and STORM: Unlocking live-cell super-resolution.</a> Biopolymers. 95 (5), 322-331 (2011).</li><li>Gustafsson, N., Culley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+live-cell+conventional+fluorophore+nanoscopy+with+ImageJ+through+super-resolution+radial+fluctuations.">Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations.</a> Nat Commun. 7, 12471 (2016).</li><li>Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Primer+to+Single-Particle+Cryo-Electron+Microscopy.">A Primer to Single-Particle Cryo-Electron Microscopy.</a> Cell. 161 (3), 438-449 (2015).</li><li>Szymborska, A., de Marco, A., Daigle, N., Cordes, V. C., Briggs, J. A. G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+pore+scaffold+structure+analyzed+by+super-resolution+microscopy+and+particle+averaging.">Nuclear pore scaffold structure analyzed by super-resolution microscopy and particle averaging.</a> Science. 341 (6146), 655-658 (2013).</li><li>Broeken, J., Johnson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+improvement+by+3D+particle+averaging+in+localization+microscopy.">Resolution improvement by 3D particle averaging in localization microscopy.</a> Methods Appl Fluoresc. 3 (1), 14003 (2015).</li><li>Burns, S., Avena, J., Unruh, J., Yu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structured+illumination+with+particle+averaging+reveals+novel+roles+for+yeast+centrosome+components+during+duplication.">Structured illumination with particle averaging reveals novel roles for yeast centrosome components during duplication.</a> Elife. , (2015).</li><li>Lelek, M., Di Nunzio, F., Henriques, R., Charneau, P., Arhel, N., Zimmer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+imaging+of+HIV+in+infected+cells+with+FlAsH-PALM.">Superresolution imaging of HIV in infected cells with FlAsH-PALM.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 109 (22), 8564-8569 (2012).</li><li>Laine, R. F., Albecka, A., Svan de Linde, ., Rees, E. J., Crump, C. M., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+herpes+simplex+virus+by+optical+super-resolution+imaging.">Structural analysis of herpes simplex virus by optical super-resolution imaging.</a> Nat Commun. 6, 5980 (2015).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Gray, R. D. M., Beerli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VirusMapper:+open-source+nanoscale+mapping+of+viral+architecture+through+super-resolution+microscopy.">VirusMapper: open-source nanoscale mapping of viral architecture through super-resolution microscopy.</a> Sci Rep. 6, 29132 (2016).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J of Micros. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission:+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy.">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt Let. 19 (11), 780 (1994).</li><li>Chung, C. -. S., Chen, C. -. H., Ho, M. -. Y., Huang, C. -. Y., Liao, C. -. L., Chang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+proteome:+identification+of+proteins+in+vaccinia+virus+intracellular+mature+virion+particles.">Vaccinia virus proteome: identification of proteins in vaccinia virus intracellular mature virion particles.</a> J Virol. 80 (5), 2127-2140 (2006).</li><li>Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxviridae:+the+viruses+and+their+replication.">Poxviridae: the viruses and their replication.</a> Fields virology. , (2010).</li><li>Condit, R. C., Moussatche, N., Traktman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+a+nutshell:+structure+and+assembly+of+the+vaccinia+virion.">In a nutshell: structure and assembly of the vaccinia virion.</a> Adv Virus Res. 66 (6), 31-124 (2006).</li><li>Schmidt, F. I., Bleck, C. K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+entry+is+followed+by+core+activation+and+proteasome-mediated+release+of+the+immunomodulatory+effector+VH1+from+lateral+bodies.">Vaccinia virus entry is followed by core activation and proteasome-mediated release of the immunomodulatory effector VH1 from lateral bodies.</a> Cell Rep. 4 (3), 464-476 (2013).</li><li>. Nanoj-virusmapper Available from: <a target="_blank" href="https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper">https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper</a> (2016)</li><li>Fortun, D., Guichard, P., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+From+Multiple+Poses+in+Fluorescence+Imaging:+Proof+of+Concept.">Reconstruction From Multiple Poses in Fluorescence Imaging: Proof of Concept.</a> IEEE J Sel Topics Signal Process. 10 (1), 61-70 (2016).</li></ol>

Författarna har ingenting att lämna ut.

Med denna metod är forskare utrustade för att kombinera kraften av SPA och SR mikroskopi för att generera hög precision, flerkana 2D modeller av proteinarkitekturen av virus och andra makromolekylära komplex. Dock bör vissa viktiga överväganden beaktas. Frön bör väljas för att representera en struktur som konsekvent ses. Därför bör de rådata kontrolleras noggrant innan fröna väljs. Detta är viktigt för att förhindra partiska modeller. Valen kan valideras av granskningen av minimilikhetströsklar som krävs för att inkludera ett visst antal partiklar i modellerna. Tydligt, för ett urval av utsäde, ju högre denna tröskel måste vara för ett givet antal partiklar, är det mer att strukturen uppenbara i data. Mallen matchande konceptet är särskilt användbart när det finns heterogenitet i data. Alla olika strukturer som är viligt bör identifieras och olika modeller skapas för varje enskilt fall. Genom att separera heterogena strukturer i en kanal men samtidigt skapa modeller i en andra kanal, kan mönster växa fram som skulle inte ha varit omedelbart uppenbart. En annan faktor att vara medveten om när man använder denna algoritm är att iteration förfarandet kommer att maximera stokastisk asymmetri. Till exempel, när modellering av en struktur med två symmetriska maxima, alla små asymmetrier mellan maxima kommer att anpassas till varandra under iterationen, och den slutliga modellen kommer således att vara maximalt asymmetriskt. Om detta inte återspeglar en känd symmetri i strukturen som modelleras, då detta bör beaktas. För närvarande är det enda sättet att undvika detta maxime är att begränsa antalet iterationer till 1, även om en potentiell utveckling skulle vara för VirusMapper att införliva symmetriaxlarna i modellen genereringen. Alla nya versioner av VirusMapper blir Avaletiketten på den refererade webbplats (se Material tabell). Användarna kommer också att hitta en FAQ här för att svara på några vanliga frågor. Programvaran enligt beskrivningen är tillämpbar på vilken som helst struktur som kan avbildas med tillräcklig upplösning för att visualisera de funktioner som användaren önskar att modellera. Även SPA kan förbättra upplösningen, det uppenbarligen inte kommer att förbättra synligheten av funktioner som annars inte syns. Detta protokoll är därför inte en metod för att förbättra kvaliteten på data. Som med någon teknik, noggrann provberedning och optimering av bild strategi kommer att ge de renaste data och de bästa resulterande modellerna. Valet av SR imaging modalitet är också viktigt och i allmänhet kommer att bero på provet till hands. VirusMapper har validerats för att fungera bra med SIM och STED 10, och det kan även användas med högkvalitativa lokalisering mikroskopi data, men försiktighet bör iakttas i detta fall,som gles märkning kan orsaka problem som liknar asymmetri maximering. För närvarande är VirusMapper den enda fritt tillgängliga algoritm för analys enda partikel av fluorescensbilder och den enda allmänt ändamål 2D SPA medelvärdes programvara. Andra studier som har använt sig av samma principer 4, 6, 8 har använt anpassad mjukvara specialiserad för varje enskild studie. Generella algoritmer för återuppbyggnaden av 3D-data har publicerats 5, 18, även om ingen programvara tillhandahölls. När den används som beskrivs i denna artikel, kan VirusMapper användas för att producera exakta, noggranna, och robusta modeller av den makromolekylära proteinarkitekturen av virus och andra komplex. Med dessa modeller kan forskarna ta exakta mätningar av den genomsnittliga dimensioner structgärder som studeras, potentiellt ger dem möjlighet att nå biologiska slutsatser som inte annars skulle ha varit möjligt. Vidare är det med de flerkana funktionerna i denna teknik möjligt att kart ett obegränsat antal proteiner och komponenter inom komplex och att upptäcka ny proteinorganisation. Att undersöka förändringar i nanostrukturen i olika biologiskt relevanta förhållanden, såsom olika skeden av ett virus livscykel, har potential att erbjuda värdefulla insikter i biologi.

Super upplösning (SR) mikroskopi har haft en stor inverkan på cellbiologi genom förmågan att bilden viktiga molekylära processer tillsammans med molekyl särskild märkning avgörande för att förstå dem. SR möjliggör nu Ijusmikroskopi att närma de resolutioner (20-150 nm) som tidigare endast kan uppnås med elektronmikroskopi (EM) under bibehållande av de stora fördelarna med Ijusmikroskopi, såsom potentialen att bild levande celler 1, 2. Vidare, den strukturella bevarande finns på nanonivå nivå tillåter applicering av en enda partikelanalys (SPA) till SR uppgifter, ett begrepp som används i stor utsträckning i elektronmikroskopi 3. Med användning av SPA, kan många mycket konserverade kopior av en struktur skall avbildas och medelvärdesbildas tillsammans för att förbättra upplösningen, precision, eller signal-till-brus hos den visualiserade objektet. Vid användning i kombination med SR har SPA visat sig vara ett kraftfullt verktyg för hög precision kartläggning av komponenterna i den kärnpor komplex 4, 5, centrosomer 6, och virus, såsom HIV 7 och HSV-1 8. Dock har rutinen kombinerad tillämpning av SR och SPA ifrågasatts av en brist på tillgänglig programvara. Av den anledningen har vi utvecklat VirusMapper, en plugin till den populära bildbehandlingsprogram ImageJ / Fiji 9. Detta är den första fritt tillgängliga mjukvarupaket för generaliserad SPA med fluorescens bilder 10 utformade för att ge snabb, användarvänlig, flerkanaligt naiva medelvärdes av strukturer avbildas med SR mikroskopi. Fastän utformad för virus, kan det tillämpas på alla makromolekylära komplex i vilka olika molekylslag kan avbildas, identifieras och lokaliseras. VirusMapper kan användas för att producera hög precision molekylmodeller av vilken som helst känd konstruktion, vilket möjliggör beräkning av de genomsnittliga dimensioner och andra parametrar. Algoritmen design gör den särskilt användbar för att separera populationer av strukturer, som ger för bestämning av distinkta orienteringar eller olika morfologiska tillstånd. Dessutom kan flerkanalig avbildning användas för att utnyttja en referenskanal i de fall där den underliggande strukturen är välkänd, vilket möjliggör för referens baserad struktur upptäckt. Instruktionerna för att hämta och installera programvaran finns på <a href="https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper">https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper</a> . Exempeldata kan också hittas där, och användare uppmanas att öva använda programvaran på exempeldata innan du försöker tillämpa den på egen hand. Här är stegen för att använda denna plugin för att producera SPA modeller från rådata som beskrivs. Programvaran tar RAW-bilder som innehåller en- or multi-märkta strukturer som indata. Den återvänder, under förutsättning att ett antal parametrar som är placerad programmet körs, SPA-modeller som visar den genomsnittliga fördelningarna av de märkta komponenterna inom avbildade strukturer. Målet med detta protokoll är att producera exakta SPA modeller som ger de genomsnittliga lokaliseringar av komponenter inom avbildade strukturer enligt rörledningen skisseras i figur 1. Såsom visas i fig 1, är programvaran arbetsflöde med fördel uppdelad i tre steg. Det första steget är att segment stora bilder, vilket resulterar i travar av partiklar för varje kanal. Dessa partiklar är de enheter som kommer att medelvärdes att skapa modeller och producera frön för modellgenerering. Det andra steget är att generera utsädes bilder, som används för att registrera hela uppsättningen partiklar i slutskedet. Detta görs genom att välja en referenskanal och manuellt välja partiklar i denna kanal som kommer att bidra till sEEDS. Frön väljs i detta referenskanalen men kan genereras för alla kanaler. Partiklarna initialt uträtad genom att anpassa en 2D gaussisk i denna kanal. Alla partiklar som har valts och omgrupperade sedan i genomsnitt för att producera ett frö. För varje gemensam struktur ses i de data som skall modelleras, bör partiklarna väljas som frön som tydligt och korrekt representerar den strukturen. Gränssnittet i detta skede är också användbar för avsökning av data för sådana strukturer. Det sista steget är att generera modeller med hjälp av mallmatchning. Detta uppnås genom registrering av partiklarna som ursprungligen extraherats till utsädes bilder som genereras i föregående avsnitt av korskorrelation. En delmängd av registrerade partiklar medelvärdes tillsammans, och processen vidare itereras för att minska modell medelkvadratfelet, om så önskas. Denna delmängd bestäms genom att sätta en minimi likhet mot frö som måste uppfyllas. När du skapar modellens samtidigt i flera kanaler, det gemensamma likheten, eller genomsnittet av likhet för varje kanal, används. De resulterande modellerna och de registrerade partiklar som bidrog till dem kan sedan analyseras ytterligare.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Open-source image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoJ-VirusMapper</td>
			<td>developed by the Henriques lab</td>
			<td></td>
			<td>Open source-Fiji plugin (https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield antifade mounting medium</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elyra PS1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN BLACK</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software for SIM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance coverslip</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>&#160;474030-9000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpeck beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>T7279</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

open-source single-particle analysis for super-resolution microscopy with virusmapper

Super-upplösning fluorescensmikroskopi närvarande revolutionera cellbiologisk forskning. Dess förmåga att bryta upplösningsgränsen på ca 300 nm möjliggör rutin avbildning av nanoskala biologiska komplex och processer. Denna ökning i upplösning innebär också att metoder populära i elektronmikroskopi, såsom enkelpartikelanalys, lätt kan tillämpas på super upplösning fluorescensmikroskopi. Genom att kombinera denna analytisk metod med superupplösning optisk avbildning, blir det möjligt att dra fördel av molekylen specifika märkning kapacitet fluorescensmikroskopi för att generera strukturella kartor över molekylära element inom en metastabil struktur. För detta ändamål har vi utvecklat en ny algoritm - VirusMapper - paketeras som en enkel att använda, hög prestanda och hög genomströmning ImageJ plugin. Den här artikeln presenterar en fördjupad guide till detta program, visa upp sin förmåga att upptäcka nya strukturella egenskaper i biologisk molecular komplex. Här presenterar vi hur man monterar kompatibla data och ger en steg-för-steg-protokollet om hur man använder denna algoritm för att tillämpa en enda partikelanalys till super-upplösning.

Här visar vi programvaran på modell poxvirus, vacciniavirus. En av de mest komplexa däggdjurs virus, vaccinia paket runt 80 olika proteiner inom en 350 x 270 x 250 nm 3 tegelstensformad partikel 13, 14. Tre delstrukturer är urskiljbara genom elektronmikroskopi: en central kärna, vilken innehåller dsDNA-genomet; två proteinhaltiga strukturer, kallade sido organ, som flankerar kärnan; och en enda proteolipidprotein dubbelskikt kuvertet 15. Den stora storleken, komplex struktur, och mottaglighet för rekombinant fluorescerande protein märkning gör vaccinia ett utmärkt system för att demonstrera VirusMapper arbetsflöde. Med hjälp av programvaran som beskrivs här, kan fördelningen av en mängd olika proteiner på vaccinia virion modelleras. Ett protein märktes och avbildas, eventuellt i kombination med ett annat protein med känd fördelning som en referens, och mjukvaran användes som beskrevs för framställning av genomsnittliga modeller av lokalisering av detta protein på partikeln. I detta exempel framställdes två proteiner modelleras, den inre kärnan protein L4, och huvudsidokroppskomponenten F17. Ett rekombinant vacciniavirus som har F17 märkt med GFP och L4 taggade med mCherry 16 användes. Renat virus späddes i 1 mM Tris, pH 9, och bunden till tvättas, högpresterande täckglas genom att belägga dem för 30 min vid rumstemperatur. Proverna fixerades därefter genom applicering av 4% formaldehyd i PBS under 20 min. Täckglas monterades omedelbart på objektglas i antifad monteringsmedium. Imaging utfördes av SIM på en kommersiell SIM mikroskop. Ett synfält valdes innehållande hundratals virus och bilder förvärvades med användning av 5 fasförskjutningar och 3 galler rotationer med 561 nm (32 | im gitter period) och 488 nm (32 | j, m gitterperiod) lasrar. Bilder förvärvades med hjälp av en sCMOS kamera och bearbetas med hjälp av mikroskop programvara. Kanaler i linje baserat på en flerfärgad pärla slide avbildas med samma bildförvärvs inställningar. Efter SIM återuppbyggnad och kanalinriktnings bilder öppnades i Fiji och konkateneras till en enda bildstapel. Virala partiklar extraherades från bilder med L4 kanal som referens och utan att tillämpa någon gaussisk oskärpa, eftersom dessa partiklar har en centralt maximum. Cirka 15 tusen partiklar extraherades i detta experiment. På grund av geometri vaccinia, sido kropparna har en distinkt annorlunda utseende baserat på virus orientering. Vi visualiserade två inriktningar där antingen en eller två sidokroppar kunde urskiljas. Vi hänvisas till dessa riktlinjer som frontal och sagittal, respektively. Separata frön för orientering frontal- och sagittala selekterades genom att söka igenom listan partikeln vid &quot;Generera Seeds&quot; stadiet (fig 4 och 5); partiklar som var tydligt i en orientering eller den andra valdes. L4 kanal användes som referenskanal för att rikta fröna med varandra. Återigen krävdes ingen Gaussisk oskärpa. 5 partiklar för varje orientering selekterades och var i genomsnitt för att producera frön. Modeller genererades för varje orientering baserad på dessa frön. Varken en referenskanal eller kvadrerade intensitetsvärden användes. Det maximala antalet iterationer var initialt satt till ett, och den minsta likheten var inställt på att inkludera cirka 1000 partiklar i varje enskilt fall, som gav ett enhetligt utseende för varje orientering. Det maximala antalet iterationer ökades sedan tillmöjliggöra konvergens av modellen. Modeller har således genereras för de två orienteringarna i de två kanalerna (Figur 7). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/55471/55471fig1.jpg" /> Figur 1: VirusMapper arbetsflöde. Insticksprogrammet är indelat i tre huvudsteg. Virala partiklar extraheras från stora bilder, är mallbilder eller frön valda halv manuellt från data, och slutliga SPA modeller genereras från data genom att hänvisa till fröna. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55471/55471fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="figur 2" src="/files/ftp_upload/55471/55471fig2.jpg" /> Figur 2: &quot;Utdrag Viral Structures&quot; dialog. När du väljer &quot;Extract Viral Structur<html> es&quot;, kommer detta dialogruta. borde Parametrarna fyllas med ursprungliga beräkningarna för optimal segmentering. &#39;Visa förhandsgranskning&#39; kan sedan väljas, vilket gör att ROI kan förhandsgranskas och de parametrar som skall finslipas. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55471/55471fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a> <img alt="figur 3" src="/files/ftp_upload/55471/55471fig3.jpg" /> Figur 3: Inställning utsugsparametrar. Efter förhandsgranska ROI som extraheras, ROI radie, antal ROI och maximal avkastning överlappning justeras för att uppnå en situation som denna. ROI är något större än de partiklar, alla partiklar ingår i en ROI, och ROI kan överlappa tillräckligt för att tillåta klustrade partiklar som skall separeras.ank &quot;&gt; Klicka här för att se en större version av denna siffra. <img alt="figur 4" src="/files/ftp_upload/55471/55471fig4.jpg" /> Figur 4: Generera mallmatchnings frön. Den &quot;Skapa Seeds&quot; dialogen (1) anges de parametrar som ska tilldelas. Referenspartiklar sekvensen (2) tillåter användaren att söka igenom partiklar i referenskanalen. När en partikel betraktas i referenspartiklar sekvensen, kan omgrupperade partiklar för alla kanaler ses i de omgrupperade partikelförhandsvisningar (3). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55471/55471fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="figur 5" src="/files/ftp_upload/55471/55471fig5.jpg" /> Figur 5: Lägga utsädes bilder. Som frön tillsätts till<html> &quot;Frames att använda&quot; låda, genomsnittet av alla frön (4) och ramarna inblandade (5) visas. Partiklar som liknar de nuvarande genomsnittliga frön föreslås i dialogrutan (6). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55471/55471fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="figur 6" src="/files/ftp_upload/55471/55471fig6.jpg" /> Figur 6: &quot;Skapa modeller&quot; dialog. När du väljer &quot;Skapa modeller baserade på Seeds&quot; dialogrutan visas. Parametrarna bör fyllas med ursprungliga beräkningarna för optimal modellgenerering, och de delar av modellgenerering förfarande som skall visas under beräkningen bör väljas. &quot;Visa förhandsgranskning&quot; kan sedan väljas, vilket tillåter modellen genereringsprocessen att köra och parametrar för att finjusteras.ftp_upload / 55.471 / 55471fig6large.jpg&quot; target = &#39;_ blank&#39;&gt; Klicka här för att se en större version av denna siffra. <img alt="figur 7" src="/files/ftp_upload/55471/55471fig7.jpg" /> Figur 7: Modeller som genereras med VirusMapper. Vaccinia-virioner med L4-kärnproteinet taggade med mCherry och proteinet F17 sidokroppen märkt med EGFP avbildades med användning SIM. Modeller ades sedan genereras med programvaran, såsom beskrivs i protokollet. Två inriktningar, frontal och sagittal, kännetecknas av förekomsten av sidoorganen. Scale bar = 100 nm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55471/55471fig7large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper at JoVE.com

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Detta manuskript använder Fiji-baserade open-source mjukvara VirusMapper att tillämpa en enda partikelanalys till super-upplösning mikroskopi bilder för att generera exakta modeller av nanostruktur.

Öppen källkod Single-partikelanalys för Super högupplösande mikroskopering med VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Research

JoVE Journal

Biology

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Enda partikel elektronmikroskopi Rekonstruktion av Exosome Complex Använda Random Konisk Tilt metod

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Super-upplösning avbildning av de bakteriella Division Maskin

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

Test Prover för Optimera STORM Super-resolution Mikroskopi

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Provberedning för single virion atomic force mikroskopi och superupplösning fluorescensavbildning

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Spårning och kvantifiera utvecklingsprocesser i<em&gt; C. elegans</em&gt; Använda Open-source-verktyg

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

Tredimensionell Super Resolution mikroskopi av F-aktinfilament av interferometriska photoactivated Lokalisering Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Open Source Hög innehållsanalys Använda automatiserade fluorescens Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Grundtillståndet utarmning super resolution Imaging i däggdjursceller

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

Tillämpningen av höghastighetståg super-resolution hastighet mikroskopi i levande primära cilier

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Isolering och fluorescens Imaging för singel-partikel rekonstruktion av Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...