Name: application of genetically encoded fluorescent nitric oxide (no&#8226;) probes, the genops, for real-time imaging of no&#8226; signals in single cells
Uploaded: 2017-03-16T15:00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide NOÃ¢â‚¬Â¢ Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NOÃ¢â‚¬Â¢ Signals in Single Cells at JoVE.c

The authors acknowledge C.J. Edgell, Pathology Department, University of North Carolina at Chapel Hill, NC, USA for providing the EA.hy926 cells. Author E.E. is supported by Nikon Austria within the Nikon-Center of Excellence, Graz and is a fellow of the Ph.D. program in Molecular Medicine at the Medical University of Graz. The researchers are also supported by the Ph.D. program Metabolic and Cardiovascular Disease (DK-W1226) of the Medical University of Graz. This work was also funded by the FWF project P 28529-B27. Microscopic equipment is part of the Nikon-Center of Excellence, Graz that is supported by the Austrian infrastructure program 2013/2014, Nikon Austria Inc., and BioTechMed, Graz.

<ol>
	<li>Eroglu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+FP-based+probes+for+live-cell+imaging+of+nitric+oxide+dynamics.">Development of novel FP-based probes for live-cell imaging of nitric oxide dynamics.</a> Nat Commun. 7, 10623 (2016).</li><li>Bush, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+for+enhancer-dependent+assembly+and+activation+of+the+AAA+transcriptional+activator+NorR.">The structural basis for enhancer-dependent assembly and activation of the AAA transcriptional activator NorR.</a> Mo. Microbiol. 95 (1), 17-30 (2015).</li><li>Cranfill, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+fluorescent+proteins.">Quantitative assessment of fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 13 (7), 557-562 (2016).</li><li>D'Autr&#233;aux, B., Tucker, N., Spiro, S., Dixon, R., Poole, e. d. .. P. o. o. l. e. ,. R. .. K. .. ,. (. e. d. ). .. ,. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Nitric+Oxide-Reactive+Transcriptional+Activator+NorR.">Characterization of the Nitric Oxide-Reactive Transcriptional Activator NorR.</a> Globins and Other Nitric Oxide-Reactive Proteins, Part B. 437, 235-251 (2008).</li><li>Strack, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensors+and+probes:+Yes+to+genetically+encoded+NO&#8226;+sensors.">Sensors and probes: Yes to genetically encoded NO&#8226; sensors.</a> Nat Methods. 13 (4), 288 (2016).</li><li>Auten, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+to+'The+use+of+diaminofluorescein+for+nitric+oxide+detection:+Conceptual+and+methodological+distinction+between+NO+and+nitrosation.">Response to 'The use of diaminofluorescein for nitric oxide detection: Conceptual and methodological distinction between NO and nitrosation.</a> Free Radic. Biol. Med. 50 (12), 1812 (2011).</li><li>Sivaraman, G., Anand, T., Chellappa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fluorescence+Switch+for+the+Detection+of+Nitric+Oxide+and+Histidine+and+Its+Application+in+Live+Cell+Imaging.">A Fluorescence Switch for the Detection of Nitric Oxide and Histidine and Its Application in Live Cell Imaging.</a> ChemPlusChem. 79 (12), 1761-1766 (2014).</li><li>Ye, X., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+nitric+oxide+in+single+cells.">Detection of nitric oxide in single cells.</a> Analyst. 133 (4), 423-433 (2008).</li><li>Thyagarajan, B., Malli, R., Schmidt, K., Graier, W. F., Groschner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+inhibits+capacitative+Ca2++entry+by+suppression+of+mitochondrial+Ca2++handling.">Nitric oxide inhibits capacitative Ca2+ entry by suppression of mitochondrial Ca2+ handling.</a> Br J Pharmacol. 137 (6), 821-830 (2002).</li><li>Germond, A., Fujita, H., Ichimura, T., Watanabe, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+development+of+genetically+encoded+fluorescent+sensors+to+monitor+intracellular+chemical+and+physical+parameters.">Design and development of genetically encoded fluorescent sensors to monitor intracellular chemical and physical parameters.</a> Biophy. Rev. 8, 121-138 (2016).</li><li>Malli, R., Eroglu, E., Waldeck-Weiermair, M., Graier, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+a+GAP-An+Optimized+Probe+for+ER+Ca2++Imaging+In+Vivo.">Filling a GAP-An Optimized Probe for ER Ca2+ Imaging In Vivo.</a> Cell Chem Biol. 23 (6), 641-643 (2016).</li><li>Sato, M., Hida, N., Umezawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+nanomolar+range+of+nitric+oxide+with+an+amplifier-coupled+fluorescent+indicator+in+living+cells.">Imaging the nanomolar range of nitric oxide with an amplifier-coupled fluorescent indicator in living cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 102 (41), 14515-14520 (2005).</li><li>Weidinger, A., Kozlov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Activities+of+Reactive+Oxygen+and+Nitrogen+Species:+Oxidative+Stress+versus+Signal+Transduction.">Biological Activities of Reactive Oxygen and Nitrogen Species: Oxidative Stress versus Signal Transduction.</a> Biomolecules. 5 (2), 472-484 (2015).</li><li>Paolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+Oxide+in+Human+Health+and+Disease.">Nitric Oxide in Human Health and Disease.</a> Encyclopedia of life sciences. , (2005).</li><li>Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+and+peroxynitrite+in+health+and+disease.">Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease.</a> Physiol Rev. 87 (1), 315-424 (2007).</li><li>Bonafe, F., Guarnieri, C., Muscari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+regulates+multiple+functions+and+fate+of+adult+progenitor+and+stem+cells.">Nitric oxide regulates multiple functions and fate of adult progenitor and stem cells.</a> J Physiol Biochem. 71 (1), 141-153 (2015).</li><li>Forstermann, U., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+synthases:+regulation+and+function.">Nitric oxide synthases: regulation and function.</a> Eur. Heart J. 33 (7), 829-837 (2012).</li><li>Dudzinski, D. M., Igarashi, J., Greif, D., Michel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+pharmacology+of+endothelial+nitric+oxide+synthase.">The regulation and pharmacology of endothelial nitric oxide synthase.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 46, 235-276 (2006).</li><li>Zhou, L., Zhu, D. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+nitric+oxide+synthase:+structure,+subcellular+localization,+regulation,+and+clinical+implications.">Neuronal nitric oxide synthase: structure, subcellular localization, regulation, and clinical implications.</a> Nitric Oxide. 20 (4), 223-230 (2009).</li><li>Aktan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iNOS-mediated+nitric+oxide+production+and+its+regulation.">iNOS-mediated nitric oxide production and its regulation.</a> Life Sci. 75 (6), 639-653 (2004).</li><li>Ghafourifar, P., Cadenas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+nitric+oxide+synthase.">Mitochondrial nitric oxide synthase.</a> Trends Pharmacol Sci. 26 (4), 190-195 (2005).</li><li>Crane, B. R., Sudhamsu, J., Patel, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+nitric+oxide+synthases.">Bacterial nitric oxide synthases.</a> Annu Rev Biochem. 79, 445-470 (2010).</li><li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nitrate-nitrite-nitric+oxide+pathway+in+physiology+and+therapeutics.">The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).</li><li>Kelm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+metabolism+and+breakdown.">Nitric oxide metabolism and breakdown.</a> Biochim Biophys Acta. 1411 (2-3), 273-289 (1999).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen-related+receptors+stimulate+pyruvate+dehydrogenase+kinase+isoform+4+gene+expression.">Estrogen-related receptors stimulate pyruvate dehydrogenase kinase isoform 4 gene expression.</a> J Biol Chem. 281 (52), 39897-39906 (2006).</li><li>Holzmann, S., Kukovetz, W. R., Windischhofer, W., Paschke, E., Graier, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+differentiation+between+endothelium-dependent+relaxations+sensitive+and+resistant+to+nitro-L-arginine+in+coronary+arteries.">Pharmacologic differentiation between endothelium-dependent relaxations sensitive and resistant to nitro-L-arginine in coronary arteries.</a> J Cardiovasc Pharmacol. 23 (5), 747-756 (1994).</li><li>Bentley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+calcium+regulates+coat+retention,+fusogenicity,+and+size+of+pre-Golgi+intermediates.">Vesicular calcium regulates coat retention, fusogenicity, and size of pre-Golgi intermediates.</a> Mol Biol Cell. 21 (6), 1033-1046 (2010).</li><li>Ignarro, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide:+a+unique+endogenous+signaling+molecule+in+vascular+biology.">Nitric oxide: a unique endogenous signaling molecule in vascular biology.</a> Biosci Rep. 19 (2), 51-71 (1999).</li><li>Upreti, M., Kumar, S., Rath, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replacement+of+198MQMDII203+of+mouse+IRF-1+by+197IPVEVV202+of+human+IRF-1+abrogates+induction+of+IFN-&#946;,+iNOS,+and+COX-2+gene+expression+by+IRF-1.">Replacement of 198MQMDII203 of mouse IRF-1 by 197IPVEVV202 of human IRF-1 abrogates induction of IFN-&#946;, iNOS, and COX-2 gene expression by IRF-1.</a> Biochem Biophys Res Com. 314 (3), 737-744 (2004).</li><li>Lacin, E., Muller, A., Fernando, M., Kleinfeld, D., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Cell-based+Neurotransmitter+Fluorescent+Engineered+Reporters+(CNiFERs)+for+Optical+Detection+of+Neurotransmitters+In+Vivo.">Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo.</a> J Vis Exp. (111), (2016).</li><li>de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+gene+expression+in+response+to+stress.">Controlling gene expression in response to stress.</a> Na. Rev Genet. 12 (12), 833-845 (2011).</li><li>Latchman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Gene+Regulation+in+Eukaryotes.">Transcriptional Gene Regulation in Eukaryotes.</a> Encyclopedia of life sciences. , (2005).</li><li>Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+cycle+transcription+during+G1+and+S+phases.">Control of cell cycle transcription during G1 and S phases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).</li><li>Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+the+mitochondrial+proton+gradient+during+cytosolic+calcium+elevations.">Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations.</a> J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).</li><li>Suarez, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+is+reduced+to+HNO+by+proton-coupled+nucleophilic+attack+by+ascorbate,+tyrosine,+and+other+alcohols.+A+new+route+to+HNO+in+biological+media.">Nitric oxide is reduced to HNO by proton-coupled nucleophilic attack by ascorbate, tyrosine, and other alcohols. A new route to HNO in biological media.</a> J Am Chem Soc. 137 (14), 4720-4727 (2015).</li><li>Kuropteva, Z. V., Kudryavtsev, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferrous-ascorbate+complexes+as+carriers+of+nitric+oxide.">Ferrous-ascorbate complexes as carriers of nitric oxide.</a> Gen Physiol Biophys. 16 (1), 91-96 (1997).</li><li>Vanin, A. F., Huisman, A., Stroes, E. S., Ruijter-Heijstek, F. C., Rabelink, T. J., van Faassen, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+capacity+of+mononitrosyl-iron-dithiocarbamate+complexes:+implications+for+NO+trapping.">Antioxidant capacity of mononitrosyl-iron-dithiocarbamate complexes: implications for NO trapping.</a> Free Radic Biol Med. 30 (8), 813-824 (2001).</li><li>Lindberg, R. A., Dewhirst, M. W., Buckley, B. J., Hughes, C. S., Whorton, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-dependent+nitric+oxide+release+in+endothelial+but+not+R3230Ac+rat+mammary+adenocarcinoma+cells.">Ca2+-dependent nitric oxide release in endothelial but not R3230Ac rat mammary adenocarcinoma cells.</a> Am J Physiol. 271 (1), 332-337 (1996).</li><li>Campo, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SOD+mimic+MnTM-2-PyP(5+)+reduces+hyaluronan+degradation-induced+inflammation+in+mouse+articular+chondrocytes+stimulated+with+Fe+(II)+plus+ascorbate.">The SOD mimic MnTM-2-PyP(5+) reduces hyaluronan degradation-induced inflammation in mouse articular chondrocytes stimulated with Fe (II) plus ascorbate.</a> Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1610-1619 (2013).</li><li>Waldeck-Weiermair, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+correlations+between+cytosolic+and+mitochondrial+Ca2++signals+using+a+novel+red-shifted+mitochondrial+targeted+cameleon.">Spatiotemporal correlations between cytosolic and mitochondrial Ca2+ signals using a novel red-shifted mitochondrial targeted cameleon.</a> PLOS ONE. 7 (9), 45917 (2012).</li><li>Kuzkaya, N., Weissmann, N., Harrison, D. G., Dikalov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+peroxynitrite+with+uric+acid+in+the+presence+of+ascorbate+and+thiols:+implications+for+uncoupling+endothelial+nitric+oxide+synthase.">Interactions of peroxynitrite with uric acid in the presence of ascorbate and thiols: implications for uncoupling endothelial nitric oxide synthase.</a> Biochem Pharmacol. 70 (3), 343-354 (2005).</li><li>Liu, J., Hughes, T. E., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+35+amino+acids+and+fatty+acylation+sites+determine+the+molecular+targeting+of+endothelial+nitric+oxide+synthase+into+the+Golgi+region+of+cells:+a+green+fluorescent+protein+study.">The first 35 amino acids and fatty acylation sites determine the molecular targeting of endothelial nitric oxide synthase into the Golgi region of cells: a green fluorescent protein study.</a> J Cell Biol. 137 (7), 1525-1535 (1997).</li><li>Feron, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Endothelial+Nitric-oxide+Synthase-Caveolin+Regulatory+Cycle.">The Endothelial Nitric-oxide Synthase-Caveolin Regulatory Cycle.</a> J Biol Chem. 273 (6), 3125-3128 (1998).</li></ol>

EE, MW, RM и WFG, сотрудники медицинского университета Граца, подали заявку на патент Великобритании (патентная заявка номер WO2015EP74877 20151027, приоритет номер GB20140019073 20141027), которые описывают части исследований в этой рукописи. Лицензии , связанные с этим патентом предоставляются Next Generation флуоресцентной томографии (NGFI) GmbH ( <a href="http://www.ngfi.eu/" target="_blank">http://www.ngfi.eu/</a> ), спин-офф компании медицинского университета Граца.

С момента открытия NO • в качестве важной сигнальной молекулы в биологии 28, конкретное измерение в режиме реального времени радикала в отдельных клетках, тканях и целых животных с высоким разрешением в осуществимый и надежным образом было стремились. Здесь мы сообщаем о применении недавно разработанных генетически кодируемых флуоресцентных NO • зондов (geNOps) , которые позволяют точное жить-ячейки изображения NO • сигналов с использованием широкого поля флуоресцентной микроскопии 1. Для того, чтобы обойти сложные и инвазивные процедуры трансфекции клона НЕК клеток, которые стабильно экспрессирует зеленый флуоресцентный G-GENOP был использован для количественного определения экзогенного генерироваться одноклеточных Нет • профили. Как НЕК клетки обычно не производят NO • эндогенно 29, этот тип клеток подходит для генерации GENOP на основе датчика клеточной линии, которая может оказаться полезной для многих других применений в условиях совместного культивированияс NO • производить первичные клетки или даже в живых животных 30. Тем не менее, в данном исследовании мы демонстрируем способность различных НЕТ • -liberating соединений, различных концентраций и стабильностей, пробуждать внутриклеточных NO • сигналы с использованием G-GENOP, выражающую модель НЕК клеток. Наши данные показали, что NO • -donor концентрация, качество и способ применения в конечном итоге определить модели внутриклеточных Нет • профили. Такая информация необходима для на месте Фармакокинетические характеристики различных доноров NO •, которые являются признаком ряда заболеваний. Следует отметить, что geNOps было показано , что стабильно реагировать на несколько повторяющихся применений NO • -donor импульсов в течение очень длительного времени 1. Таким образом, эксперименты с использованием NO • -liberating соединения, представленные в настоящем документе, позволяют Полуколичественные выводы относительно различных амплитуд и кинетики соответствующего клеточного NO226; сигналы (фиг.1 и 2). Несмотря на то, стабильно экспрессирующих клон НЕК клеток , вероятно , происходит из одной клетки, широкая гетерогенность уровней экспрессии G-geNOps наблюдалось (рисунок 1). Это общая особенность стабильных клеточных клонов , как транскрипция (генома) интегрированный интерес гена находится под контролем многих факторов , таких как различных экологических стрессов 31, влияющих на темпы роста 32 клеток, и статус клеточного цикла 33. Отдельные ФП на основе geNOps не являются логометрических датчиков и, следовательно, NO • индуцированную потерю интенсивности флуоресценции возрастает с выражением уровня GENOP 1. Соответственно, нормализация geNOps сигналов имеет важное значение для количественной оценки клеточных NO • сигналы особенно в случае сравнительного анализа. Как показано в нашем недавнем исследовании, строгая линейная корреляция Ьetween базальная интенсивность флуоресценции geNOps и сила НЕТ • индуцированного тушения флуоресценции в широком диапазоне интенсивностей флуоресценции было обнаружено 1. Это важная особенность geNOps для абсолютного количественного определения клеточных NO • сигналов. Как показано на рисунке 1, нормализация G-geNOps сигналов в ответ на NOC-7 и SNP выявлены однородные NO • сигналы в различных НЕК клеток из одной тарелки, указывая , что НЕК клетки не разнообразны в отношении их способности принимать до и ухудшать NO • радикал, который берет свое начало от NO • донора. В отличие от этого, используя geNOps в клетках HeLa продемонстрировали четкие гетерогенность клеточных сигналов нет • между различными клетками в ответ на NOC-7. Эти различия указывают на NO • метаболизма и разложения скоростей типа специфических клеток, которые могут иметь несколько последствий в клеточной физиологии и патологии, а также могут быть обнаружены с помощью GENOPs технологии. Тем не менее, две важные особенности geNOps должны быть тщательно продуманы для правильного использования датчиков и интерпретации данных: I) geNOps требуют адекватного железа (II) , чтобы полностью ответить на NO • 1 и II) в зависимости от варианта FP, geNOps может быть рН чувствительной 1. Здесь мы опишем протокол, который был найден, чтобы быть пригодным для нетоксичен железа (II) добавок geNOps, которые выражаются в любом НЕК, HeLa или клетки EA.hy926 (см протокол 2.6). В то время как это было показано , что лечение клеток с железом (II) / витамин С не влияет на морфологию клеток, жизнеспособность клеток и метаболическую активность клеток 1, это может быть необходимо оптимизировать этот важный шаг для других типов клеток и тканей. Тем не менее, в некоторых экспериментальных условиях, требование железа (II) загрузка может ограничить применимость geNOps. Следует отметить, что было показано, что аскорбиновая кислота может уменьшить NO • 35 и аскорбат железа (II) комплексы способны продувать NO • 36, 37. Кроме того, избыток железа (II) и аскорбат могут вызывать воспалительные реакции 39 и расцепить ENOS 41. Такие эффекты необходимо учитывать при использовании технологии geNOps. Было показано , что при определенных условиях эксперимента, внутриклеточный рН влияет значительно 34, который имеет потенциал , чтобы влиять на geNOps флуоресценции 1. Следует отметить, что голубые и зеленые geNOps варианты относительно рН чувствительны демонстрируют снижение флуоресценции при подкислении 1. Следовательно, острые изменения (суб) клеточного рН может имитировать ложные сигналы НЕТ • при использовании рН-чувствительного geNOps. Как было предложено в нашей предыдущей работе, параллельное использование NO • Нечувствительность geNOps (geNOps MUT) в качестве отрицательного ControLs рекомендуется рассекать реальный клеточный NO • сигнал от pH изменяется 1. Кроме того изменения клеточного рН могут быть проверены с использованием зондов , рН , такие как SypHer 34. Кроме того, мы визуализировали эндогенной ферментативной NO • образование в ответ на физиологический Ca 2+ -mobilizing агониста в эндотелиальной клетке суррогатной EA.hy926. Клеточная линия EA.hy926 является часто используемая модель системы последовательно выражать Енос 38. Использование geNOps транзиторно экспрессируется в клетках EA.hy926, подтвердили , что IP - 3 -опосредованной Ca 2+ сигналы вызывают глубокое образование NO • В этом типе клеток, который был почти полностью перекрыт L-NNA. Для того , чтобы временно коррелируют Ca 2+ с NO • сигналы, G-GENOP-экспрессирующие клетки были загружены с УФ-возбудимый химической Ca 2+ -indicator фура-2 / AM. Спектральное разделение Са 2+ связанных и несвязанных фура-2 флуо<html> ценция из сигнала G-GENOP может быть легко достигнуто с коммерчески доступными наборами фильтров 40. IMAGING оба зонда представила , что Ca 2+ -triggered ферментативная NO • формирование происходит гораздо медленнее по сравнению с цитозольного Ca 2+ рост этого типа клеток эндотелия. Подобные кинетика одноклеточных NO • сигналы в эндотелиальных клетках из бычьей легочной артерии при обработке клеток с IP - 3 -generating агонистом брадикинина, а также напряжения сдвига было зарегистрировано с использованием НОА-1, косвенное высоко НЕТ • датчик 12 , чувствительными , Соответственно, эти данные подчеркивают , что Ca 2+ -evoked Енос происхождения NO • образование требует определенного времени начала до полного ферментативная активность не будет достигнута. Хотя кинетика клеточного NO • формирование, распространение и деградации могут быть извлечены из других данных, например , измерения напряжения на основе из NO • индуцированный релаксации сосудовсс = &quot;Xref&quot;&gt; 26, большая польза от флуоресцентных зондов • NO является то , что они непосредственно конвертировать клеточные NO • колебания в видимые сигналы в режиме реального времени. Следовательно, визуализации сотовой связи NO • сигналы с geNOps обеспечивает высокую пространственное и временное разрешение, а также предлагает уникальные возможности в (ре) исследования (суб) сотовой связи NO • гомеостаза. Например, Енос изображений челночные 42 в сочетании с технологией geNOps в одиночных эндотелиальных клетках может быть приемлемым не коррелировать NO • образование с внутриклеточной локализации и транслокации нет • -продуцирующих фермента или других соответствующих белков , таких как кальмодулин и кавеолином 43. Здесь мы опишем достижимой применение G-GENOP, выражающую НЕК и EA.hy926 клетки визуализировать экзогенно и эндогенно генерируются клеточные NO • сигналы на уровне одной клетки и в режиме реального времени на обычном широком поле флуоресцентной мicroscope. Наши данные свидетельствуют о том, что geNOps подходят конкретно отслеживать (суб) клеточных динамику NO • при различных экспериментальных условиях, используя все виды интересных типов клеток.

Недавно мы разработали новый класс генетически кодируемых флуоресцентных зондов NO •, называют geNOps 1. Эти датчики состоят из просто построены, бактерии-производного, NO • 2 - связывающий домен, который конъюгирован с отчетливым флуоресцентного белка (ФП) вариант 3 (голубой, зеленый или оранжевый FP). НЕТ • привязка к центру 4 негемового железа (II) в пределах geNOps мгновенно уменьшает интенсивность флуоресценции 1. Важно отметить, что geNOps флуоресценция быстро и полностью восстанавливается при внутриклеточных NO • Уровни 1 снижаться. Соответственно, geNOps позволяют в режиме реального времени обработки изображений (суб) клеточных колебаний NO •. Хотя НЕТ • чувствительный механизм geNOps остаются неясными до сих пор, они оказались превосходными NO • репортеры, и, таким образом, имеют потенции, чтобы открыть новую эру полихроматическом, количественного NO • bioimaginг с высоким пространственным и временным разрешением 1, 5. Другие доступные флуоресцентные зонды НЕТ • не основаны на небольших химических соединений, которые должны быть загружены в клетки, и необратимо измененных NO • 6. Дополнительные недостатки НЕТ • чувствительных малых флуорофоров являются их потенциал цитотоксичность и относительно низкая специфичность , которые затрудняют их использовать в надежной, аналитической и убедительным образом 7, 8, 9. Хотя эффективное использование генетически кодируемых флуоресцентных зондов требует эффективных методов переноса генов, FP на основе генетически кодируемые сенсоры появились как незаменимые инструменты , которые произвели революцию в наше понимание внутреннего функционирования клеток 10, 11. До разработки отдельных geNOps FP основе, A Förster резонансной передачи энергии (FRET) не -На NO • датчик, называемый NOA-1 12, был построен. Сато и др. проектировали этот сложный зонд , который состоит из двух субъединиц NO • растворимой , чувствительными к гуанилатциклазы (SGC), оба сопряженными с FRET на основе датчиков отчетности циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) 12 уровней. Поскольку этот датчик реагирует на цГМФ, она лишь косвенно воспринимает внутриклеточных NO • колебания 12. Хотя NOA-1 реагирует на NO • возвышенностей в нано-молярная диапазоне, этот инструмент не часто используется до сих пор, вероятно, из-за ограничений в отношении доступности и практичности этого громоздкого двудольного датчика. Универсальные функции NO •, что воздействие фундаментальные биологические процессы были хорошо охарактеризованы 13, 14. Многие исследования показали, что NO • concentratioп внутри клеток и субдоменов определяет судьбу клеток в области здравоохранения и болезней , 14, 15, 16. В млекопитающим, НЕТ • в основном генерируется ферментативно в различных типах клеток с помощью семейства 17 хорошо изученным синтазы окиси азота (NOS). До сих пор, три изоформы NOS были описаны 18, 19, 20; они являются Ca 2+ / кальмодулин-зависимой эндотелиальной NOS (Енос или NOS-3) 18 и нейронный NOS (ННО или NOS-1) 19, и Ca 2+ / кальмодулин-независимый конститутивно активный , индуцируемый NOS (иОАС или NOS- 2) 20. Кроме того, существование митохондриальной NOS (mtNOS) также было предложено 21. Тем не менее, mtNOS рассматривается как сплайс вариант нОАС, и поэтому отдельно не классифицирован<html> как изоформы 21. Другой изоформ, за исключением тех , в клетках млекопитающих, является так называемый бактериальный БДУ (bNOS), главным образом, в грам-положительных бактерий 22. Ферментативная производство NO • сильно контролируется и зависит от наличия нескольких кофакторов , таких как никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NADPH), флавинадениндинуклеотид (ФАД), тетрагидробиоптерин (BH4), молекулярный кислород и L-аргинин 17. Катионный аминокислота L-аргинин является субстратом , который преобразуется в L-цитруллин на NO • производство 17. В дополнение к высокой регулируемой ферментативной генерации NO •, было постулировано , что радикал может быть уменьшена неферментативно из нитрита бассейнов в митохондриях в условиях гипоксических 23. После того, как НЕТ • продуцируется внутри клетки, он может свободно диффундировать через биомембран 14,исх &quot;&gt; 15. Тем не менее, очень короткий период полураспада этого радикала в основном определяется условиями окружающей среды, а также различные пути и химические реакции , эффективно деградировать NO • Уровни 24. В конце концов, образование, диффузия и деградация NO • зависит по различным экологическим параметрам , которые определяют эффективную концентрацию высоко биологически активной молекулы 24. Технология geNOps обеспечивает прямое обнаружение (суб) сотовой связи NO • Колебание 1 и поэтому подходит повторно рассмотреть , и вновь открыть для себя механизмы , ответственные за раскачки и разложения клеточных NO • сигналов. Здесь мы приводим простые протоколы и репрезентативные результаты для использования geNOps визуализации экзогенно и эндогенно вызванных сгенерированные NO • профили, на уровне отдельных клеток. Кроме того, технология geNOps может быть адаптирована для арпликация в других модельных системах клеток для изучения сложных моделей образования NO •, диффузии и деградации в ответ на различные клеточные раздражений и стрессов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>3957.20</td>
			<td>sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>6781.1</td>
			<td>potassium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 .2H2O</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>T885.1</td>
			<td>calcium chloride dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 .6H2O</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>2189.2</td>
			<td>magnesium chloride hexahydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>9105.3</td>
			<td>4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>8551.1</td>
			<td>sodium hydrogencarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>104873</td>
			<td>potassium dihydrogen phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 .2H2O</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>4984.1</td>
			<td>sodium hydrogenphosphate dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>6780.1</td>
			<td>&#62;99.5%; for cell culture, endotoxin free;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>3054.2</td>
			<td>ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid; calcium chelating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>6771.1</td>
			<td>sodium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>4625.1</td>
			<td>hydrochloric acid, fuming, 37% (~10 N)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>4720.1</td>
			<td>dimethyl sulfoxide;&#160; highly polar, aprotic organic solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid hydrochloride&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich, Vienna, Austria</td>
			<td>G2128</td>
			<td>(S)-2-Aminoglutaric acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich, Vienna, Austria</td>
			<td>D5523</td>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - low glucose; with 1000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Vitamin solution (100X)</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>11120037</td>
			<td>100x the vitamins found in the standard Minimum Essential Medium (MEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Amino acids solution (50X)</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>11130036</td>
			<td>50X the essential amino acids (except L-glutamine) found in the standard Minimum Essential Medium (MEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>15140122.00</td>
			<td>antibiotics to prevent bacterial contamination of cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>15290026.00</td>
			<td>Gibco Amphotericin B contains 250 &#181;g of amphotericin B (Fungizone) and 205 &#181;g of sodium deoxycholate; prevents the contamination of cell cultures by yeast and multicellular fungi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>10010031.00</td>
			<td>phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 (AM)</td>
			<td>Teflabs, Austin, TX, USA</td>
			<td>102</td>
			<td>fluorescent cytosolic calcium indicators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histamine dihydrochlorid</td>
			<td>Sigma Aldrich, Vienna, Austria</td>
			<td>H7250</td>
			<td>&#160;2-(4-Imidazolyl)ethylamine dihydrochloride; IP3-generating agonist&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N&#969;-Nitro-L-arginine</td>
			<td>Sigma Aldrich, Vienna, Austria</td>
			<td>N5501</td>
			<td>N5-(Nitroamidino)-L-2,5-diaminopentanoic acid; L-NNA;&#160; inhibitor of nitric oxide synthase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOC-7</td>
			<td>Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>487952</td>
			<td>3-(2-Hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine; nitric oxide (NO) donor short half-life of NO release</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitroprusside dihydrate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA</td>
			<td>sc-203395A</td>
			<td>sodium nitroferricyanide(III) dihydrate; nitric oxide releasing compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-mm Cover slips</td>
			<td>Karl Hecht, Sondheim v. d. Rh&#246;n, Germany</td>
			<td>41001130</td>
			<td>glass cover slips, HECHT &#34;Assistent&#34;, size 1, round, 30-mm, (VE: 100 pcs.)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(II) booster solution</td>
			<td>Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Iron(II) containing physiological buffer for non toxic iron(II) loading of cells;&#160; http://www.ngfi.eu/product/ironii-booster-solution/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-geNOp plasmid</td>
			<td>Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>plasmid DNA encoding green&#160;NO sensitive probe (G-geNOp);&#160; http://www.ngfi.eu/product/g-genop/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-geNOp AAV5</td>
			<td>Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>adenovirus encoding green NO sensitive probe (G-geNOp);&#160; http://www.ngfi.eu/product-category/genops/viral-genops-vectors/g-genop-aav5/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-geNOp sensor cell line</td>
			<td>Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>human embryonic kidney cell line (HEK293) stably expressing green NO sensitive probe (G-geNOp);&#160; http://www.ngfi.eu/product-category/genops/g-genop-sensor-cell-line/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293A cell line</td>
			<td>Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>R70507</td>
			<td>subclone of human embryonic kidney cell line (HEK293)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EA.hy926 cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC), Wesel, Germany</td>
			<td>CRL-2922</td>
			<td>somatic cell hybrid clone of human umbilical vein cell line with a thioguanine-resistant clone of A549</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TILL iMIC</td>
			<td>Till Photonics, Graefling, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>digital microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polychrome V monochromator</td>
			<td>Till Photonics, Graefling, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>ultra fast switching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVT Stingray F145B</td>
			<td>Allied Vision Technologies, Stadtroda, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Versatile CCD camera with Sony ICX285 EXview HAD sensor, IEEE 1394b</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha Plan Fluar 40</td>
			<td>Zeiss, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>x40 objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dichroic filters</td>
			<td>Chroma Technology Corp, Rockingham, Vermont, USA</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>GFP emitter 514/3 nm (515dcxr)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ValveBank8 Controller</td>
			<td>AutoMate Scientific, Inc., Berkeley, California, USA</td>
			<td>01-08</td>
			<td>programmable perfusion system control unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BVC control</td>
			<td>Vacuubrand, Wertheim, Germany</td>
			<td>727200</td>
			<td>Chemistry diaphragm pump ME 1C; vacuum pump for perfusion system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>&#160;NIH Image&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Java image processing program inspired by NIH Image. http://imagej.net/Welcome</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of genetically encoded fluorescent nitric oxide (no&#8226;) probes, the genops, for real-time imaging of no&#8226; signals in single cells

Оксид азота (NO •) представляет собой небольшой остаток, который опосредует множество важных клеточных функций в организме млекопитающих, бактерий и растений. Несмотря на существование большого количества методов для обнаружения NO • в естественных условиях и в пробирке, мониторинг в режиме реального времени Нет • на уровне одной клетки является весьма сложной задачей. Физиологические или патологические эффекты NO • определяются фактической концентрации и времени выдержки этого радикала. Соответственно, методы, позволяющие выявлять одной ячейки NO • очень желательны. В последнее время мы расширили палитру NO • Индикаторы путем введения одного флуоресцентного белка на основе генетически кодируемых оксида азота (NO) • зонды (geNOps), которые непосредственно реагировать на колебания клеточных NO • и, следовательно, решает эту потребность. Здесь показано использование geNOps для оценки внутриклеточных NO • сигналы в ответ на два различных химических NO • -liberating молекул. Наши результаты ALSO Убедитесь, что свежеприготовленный 3- (2-гидрокси-1-метил-2-nitrosohydrazino) -N-метил-1-пропиламин (ННК-7) имеет гораздо более высокий потенциал, чтобы пробуждать изменение внутриклеточных НЕТ • уровней по сравнению с неорганические NO • нитропруссид донор натрия (SNP). Кроме того, двухцветные изображения живых клеток с использованием зеленых geNOps (G-GENOP) и индикатор химической Са 2+ Fura-2 проводили для визуализации жесткое регулирование Са 2+ -зависимая NO • образование в отдельных эндотелиальных клеток. Эти представительные эксперименты показывают, что geNOps являются подходящими инструментами для расследования генерации в режиме реального времени и деградации одноклеточных NO • сигналы в различных экспериментальных установках.

Визуализация одноклеточные NO • Профили в ответ на скоротечно Applied NO Доноры Мы использовали клон клеток HEK , которая стабильно экспрессирует G-GENOP (рис 1А), для того , чтобы визуализировать НЕТ • сигналы на одноклеточной уровне в ответ на два различных NO-освободив малых химических соединений, NOC-7 и SNP. В NO • доноры последовательно применяются и удаляются из клеток во время формирования изображения с использованием силы тяжести на основе системы перфузии , что обеспечивается непрерывный поток (рис 1B). Все клетки , экспрессирующие G-GENOP с различной интенсивностью показали явное снижение флуоресценции в ответ на NOC-7 и SNP (рис 1C), что указывает на быстрое NO • накопление внутри клеток при добавлении к NO • доноров. Нормированные сигналы флуоресценции (1-F / F 0) показали , что оба NO • доноры вызывали однородную cellulaг NO • возвышений , что полностью выздоровел после вымывания из -releasing соединений NO • (Рисунок 1D). Тем не менее, 10 мкМ SNP индуцируется только 50% от сотовой связи NO • сигнала (9,63 ± 1,05%, N = 3/38), который был достигнут 10 мкМ NOC-7 (18,10 ± 1,20%, п = 3/38, р &lt; 0,0001). Для достижения равных внутриклеточные уровни NO • как с NO • доноров, требовалась концентрация 1 мМ SNP (рис 1C, 1D). Далее, мы протестировали способность свежеприготовленной по сравнению с истекшим NOC-7, чтобы поднять внутриклеточных NO • Уровни в НЕК клетках. С этой целью мы подготовили четыре экспериментальных буферов, содержащих 5 мкМ NOC-7. НЕТ • донора либо добавлены свежеприготовленные непосредственно перед измерением, или храниться в резервуарах в течение 1 ч, 2 ч и 3 ч при комнатной температуре перед измерением. Различные буферы были последовательно применены и удаляться пПЗУ клетки , экспрессирующие G-GENOP с помощью перфузионной системы (рис 2B). Такой подход обнародовал стабильность водных NOC-7 решений , которые, как и ожидалось, показал снизилась мощности в течение долгого времени , чтобы поднять внутриклеточные уровни NO • (Фигуры 2А, 2С). Интересно отметить , что НЕТ • сигналы значительно быстрее восстанавливается после удаления истекших буферов, по сравнению с внутриклеточным NO • ответ , что была вызвана свежей NOC-7 (рис 2С), возможно , указывающего слипание нетронутым НЕТ • -liberating молекул на клеточных компонентов , Одновременная визуализация Са 2+ и NO • Сигналы в одиночных эндотелиальных клеток Для изучения Са 2+ не -triggered NO • образование в эндотелиальных клетках, обычно используется эндотелиальной увековечены клеток суррогатным, клеточная линия EA.hy926, была тransiently трансфицируют G-GENOP и нагружали фура-2 / ч (см протокол 2.8). Трансфекция дали примерно 10% G-GENOP положительных эндотелиальных клеток (п = 6, рис 3А), что достаточно для записи Ca 2+ не -evoked NO • производство на уровне отдельных эндотелиальных клеток. Тем не менее, мы достигли почти 100% G-GENOP клетки положительным EA.hy926 с использованием вирусного вектора аденоассоциированный (n = 6; см протокол 2.2). До многоканальных измерений, клетки инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре в буфере для хранения , состоящий L-нна, мощный необратимый ингибитор NOS-26. Контрольные клетки содержали в том же буфере для хранения без L-NNA (см протокола 1.1) (рис 3б). Лечение контрольных клеток гистамина, мощный инозитол 1,4,5-трифосфата (IP 3) -generating агониста, мгновенно повышен цитозольного Ca 2+ уровня с последующим постепенным увеличением внутриклеточного NO • пока агонист не было удалитьD (рис 3C, 3D). Клетки , предварительно обработанные с NOS-ингибиторов показали аналогичные цитозольных сигналы Са 2+, в то время как внутриклеточный NO • уровень остается практически неизменным в ответ на гистамин (рис 3Е). EA.hy926 клетки , экспрессирующие G-GENOP также обрабатывали 1 мкМ и 100 мкМ IP 3 -generating агонистом АТФ для того , чтобы проверить , является ли или нет geNOps подходят для мониторинга за NO • сигналы в ответ на низких , так физиологические и супра-физиологические концентрации агониста (рис 3F). В эндотелиальных клеток линии 1 мкМ АТФ вызывало ясно цитозольного НЕТ • сигнал, который был приблизительно половина сигнала , полученного с помощью 100 мкМ АТФ (рис 3F). <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/55486/55486fig1.jpg" /> Рисунок 1: Внутриклеточные профили NO в ответ на различные NO-Liberati<html> нг молекул. (A) Широкое поле изображения клеток НЕК , стабильно экспрессирующих цитозольного G-GENOP. Шкала бар = 20 мкм. (Б) Схематическое изображение , основанного на полуавтоматическом перфузионной системы гравитации для контролируемого применения и снятия NOC-7 и SNP. (С) представитель (из 3 независимых экспериментов) ненормированной интенсивности одноклеточного флуоресценции прослеживает в произвольных единицах в зависимости от времени из клеток НЕК , стабильно экспрессирующих цитозольного G-GENOP в ответ на 10 мкМ NOC-7, 10 мкМ СНП и 1 мМ SNP. Black полужирный кривая представляет среднюю кривую 26 одноклеточных следов (светло-серые кривые). Пунктирные черная кривая представляет F 0, который был использован для нормализации. (D) нормировано и перевернутые одиночные следы (1-F / F 0, светло - серые кривые), и средней кривой (черная смелая кривая) с течением времени в ответ на 10 мкМ NOC-7, 10 мкМ SNP и 1 мМ SNP , извлеченные из панель C.эс / ftp_upload / 55486 / 55486fig1large.jpg &quot;целевых =&quot; _blank &quot;&gt; Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/55486/55486fig2.jpg" /> Рисунок 2: Тест на стабильность ННК-7 с использованием стабильно G-GENOP , выражающие HEK клеток. (А) представитель NO • Кривая концентрации реакция с течением времени стабильно G-GeNOps , выражающих HEK клеток при применении свежих и старых NOC-7 буферных растворов. Все NOC-7, содержащие буферы были первоначально приготовленным с конечной концентрации 5 мкМ, используя один и тот же исходный раствор (50 мМ). Время истечения соответствующих растворов после приготовления до количеств изображений до 1 ч, 2 ч, 3 ч и, как не указано обратное. (Б) Схематическое изображение на основе полуавтомат системы перфузионного тяжести , чтобы последовательно добавлять и удалять NOC-7 , содержащий решения во время съемки. (C) Временные корреляциисотовой связи NO • сигналы в ответ на свежеприготовленную и старые NOC-7 буферов. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55486/55486fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55486/55486fig2large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55486/55486fig2large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/55486/55486fig3.jpg" /> Рисунок 3: Одновременная многоканальная визуализация NO • и Ca 2+ сигналов в одиночных клетках EA.hy926. (A) репрезентативные широким полем флуоресцентного изображения клеток EAhy.926 , экспрессирующих G-GENOP (левая панель), которые загружаются с фура-2 / AM (средней и правой панелей). Шкала бар = 20 мкм. (Б) Схематическое изображение обработки клеток EAhy.926 с 500 мкМ Nω-нитро-L-аргинина (L-ННА) в течение 20 мин в течение шести-луночного планшета перед измерением. (C) представитель Временной ход одновременной записи фура-2 (возбуждение: 340 нм / 380 нм Emissиона: 510 нм) и сигналы G-GENOP (возбуждение: 480 нм; эмиссионные: 520 нм) в ответ на 100 мкМ гистамина. Как указано гистамин удаляли через 3 мин с использованием перфузионной системы. (D) Кривые представляют собой одновременные записи цитозольного Ca 2+ (фура-2 Отношение сигнал, F 340 / F 380 серая сплошная линия) и NO • (нормированные и перевернутый кривая, 1-F / F 0 зеленая сплошная линия) сигналы с течением времени одного фура-2 / я загружен эндотелиальные клетки транзиторно экспрессирующих G-GENOP. Клетки стимулировали 100 мкМ гистамина в течение 3 мин в Са 2+ (2 мМ CaCl 2) , содержащей буфер (n = 8/3). (Е) представитель одновременно записывается Ca 2+ (серая сплошная линия) и NO • сигналы (зеленая сплошная линия) с течением времени из ячейки EA.hy926 , который предварительно обрабатывают с помощью 500 мкМ Nω-Нитро-L-аргинина (L-NNA) до для измерения (п = 12/3). Клетки обрабатывали 100 мкМ гистамина в присутствии 2 мМCa 2+. (F) , усредненные кривые , представляющие цитозольных Нет • сигналы в ответ на 1 мкМ АТФ , за которым следует второй стимуляции клеток с помощью 100 мкМ АТФ. Бары представляют собой средние значения ± SD максимальных сигналов G-GENOP в ответ на 1 мкМ АТФ (белая полоса) и 100 мкМ АТФ (зеленая полоса) из 4-х независимых экспериментов; р &lt;0,001 по сравнению с 1 мкМ АТФ. P-значение было рассчитано с использованием непарный т-тест. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55486/55486fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55486/55486fig3large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55486/55486fig3large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide NOÃ¢â‚¬Â¢ Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NOÃ¢â‚¬Â¢ Signals in Single Cells at JoVE.c

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide NOÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬Ãƒâ€šÃ‚Â¢ Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NOÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬Ãƒâ€šÃ‚Â¢ Signals in Single Cells

This manuscript presents protocols for the application of novel genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) to monitor single cell NO&#8226; fluctuations in real-time using fluorescence microscopy. The Ca2+-triggered NO&#8226; formation on the level of individual endothelial cells was visualized by combining geNOps with a chemical Ca2+ sensor.

Применение Генетически кодируемые Флуоресцентные окиси азота (NO •) зондов geNOps, в режиме реального времени изображений NO • Сигналы в одиночных камерах

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...

Research

JoVE Journal

Biology

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Определение оксида азота и супероксид анион-радикал электронов парамагнитного резонанса от клеток с использованием спиновых ловушек

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET микроскопии для мониторинга в реальном времени сигнальных событий в живых клетках Использование Мономолекулярные Биосенсоры

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Генетически-кодированные Молекулярные зонды по изучению G-белком

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Автономно Биолюминесцентный клетках млекопитающих для непрерывных и мониторинга в реальном времени цитотоксичности

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

В режиме реального времени изображений Единого Engineered РНК-транскриптов в живых клетках, используя Логометрический Бимолекулярные маяки

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Зонд на основе ПЦР в реальном времени подходов к количественному измерению микроРНК

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Двухфотонное изображений внутриклеточного Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Погрузочно-разгрузочные работы и оксид азота производства в эндотелиальных и гладкомышечных клеток изолированной аорты крыс

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

В режиме реального времени изображений растений клеточной поверхности динамика с переменным углом эпифлуоресцентной микроскопии

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection оксида азота и супероксид в эндотелиальный слой малонарушенных артериях

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

Измерение нитритов и нитратов, метаболиты в оксид азота Pathway, в биологических материалах с использованием метода хемилюминесценции

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into ...