Name: fluorescent dye labeling of erythrocytes and leukocytes for studying the flow dynamics in mouse retinal circulation
Uploaded: 2017-07-03T12:30:00
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Das Forschungsprojekt wurde unter dem New Investigator-Stipendium des National Medical Research Council (NMRC), Singapur, finanziert. Das Team wird gern die von Dr. Agrawal am Institut für Ophthalmologie (IoO), University College London (UCL) unter National Medical Research Council (NMRC) ausländische Forschungsausbildungsstipendien von November 2012 bis Oktober 2014 unter Mentoren von Prof. David Shima Dr. Agrawal erwarb das Konzept und die Fähigkeiten für die Etikettierung der Zellen und die Live-Bildgebung in Dr. Shimas Labor. Das Team wird daher während der Trainingsstiftung von Prof. David Shima, Pro.f Kenith Meissner, Dr. Peter Lundh und Dr. Daiju Iwata, die Betreuung und Führung anerkennen.

Die Tierprotokolle, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee von SingHealth, Singapur, genehmigt und entsprechen den Richtlinien der Vereinigung für Forschung in der Vision und Ophthalmologie (ARVO) Erklärung zur Verwendung von Tieren in Ophthalmologie und Vision Forschung. 1. Markierung von Erythrozyten und Leukozyten mit Fluoreszenzfarbstoffen <ol><li> Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Bereiten Sie ICG (1,5 mg / ml) vor, indem Sie 3 m...

Das Studium der Hämodynamik im Netzhaut- und Aderhautkreislauf ist für das Verständnis der Pathophysiologie vieler Augenerkrankungen unerlässlich. Die Blutflussdynamik in der Netzhautzirkulation kann durch Fourier-Domänen-optische Kohärenztomographie (FD-OCT), Laser-Speckle-Flowgraphie (LSFG) und Netzhautoximetrie untersucht werden. Obwohl diese Methoden unterschiedliche Ansätze zur Untersuchung des Gesamtblutflusses in der Netzhautzirkulation 40 , 41 <su...

Das Studium der Strömungsdynamik der Blutzellen im Netzhaut- und Aderhautkreislauf ist für das Verständnis der Pathogenese potenziell visionsbedrohender Augenkrankheiten und anderer okulärer entzündlicher Zustände unerlässlich. Die herkömmlichen Angiographietechniken, die die Bindung von Fluoreszenzfarbstoffen an Plasmaproteine ​​beinhalten, liefern jedoch keine Information über die Dynamik der Erythrozyten oder Leukozyten 1 . Die Erythrozyten-Retinalströmungsdynamik ist wichtig für das Studium der metabolisch wirksamen Zirkulation in der Netzhaut und die Leukozytenströmungsdynamik zum Verständnis der Zellmigration, der Erkennung, der Adhäsion und der Zerstörung bei verschiedenen entzündlichen Zuständen. Es gibt mehrere fluoreszierende Moleküle, die bei der Identifizierung und Charakterisierung verschiedener Zelltypen verwendet werden 3 . Die Hämodynamik der Blutzellen kann durch Färbung mit den entsprechenden Fluoren gemessen werdenCent-Farbstoffe und Anwendung der richtigen bildgebenden Techniken 4 . Die Anwesenheit von entzündlichen Reaktionen bei intraokularen Erkrankungen wie altersbedingte Makuladegeneration (AMD) und diabetische Retinopathie (DR) beinhaltet die Akkumulation von Lymphozyten im kranken Bereich 5 , 6 . Die Verfolgung der Immunzellen in den Geweben kann dazu beitragen, die komplexen Ereignisse in den Mechanismus der Krankheit Pathogenese beteiligt zu verstehen. Radioaktive Isotope wie 51 Cr und 125 wurden als Zelltracer in frühen Studien verwendet. Diese Farbstoffe sind giftig und beeinflussen die Lebensfähigkeit der Zellen. Obwohl die radioaktiven Marker 3H und 14C aufgrund ihrer geringeren Emissionsenergien weniger toxisch für die Zellen sind, ist es schwierig, ihre Signale im System 7 , 8 zu detektieren. Eine Anzahl von Fluorochrom-Farbstoffen wurden eingeführt, um die potentiellen Probleme zu überwindenIth radioaktive Marker und Track-Lymphozyten-Migration in vitro mit Fluoreszenz-Mikroskopie und Durchflusszytometrie 9 , 10 . Hoechst 33342 und Thiazolorange sind DNA-bindende Fluoreszenzfarbstoffe, die zur Verfolgung von Lymphozyten in vivo verwendet werden. Hoechst 33342 bindet an AT-reiche Regionen in der DNA, ist membranpermeabel, behält Fluoreszenzsignale für 2 - 4 Tage und ist resistent gegen Abschrecken 9 , 10 . Die Nachteile von Hoechst 33342 und Thiazolorange sind die Hemmung der Lymphozytenproliferation 11 und die kurze Halbwertszeit bzw. 9 . Calcein-AM, Fluoresceindiacetat (FDA), 2 &#39;, 7&#39;-Bis- (2-carboxyethyl) -5- (und-6) -carboxyfluorescein, Acetoxymethylester (BCECF-AM), 5- (und-6) Carboxyfluoresceindiacetat (CFDA) und 5- (und-6) -Carboxyfluoresceindiacetat-Acetoxymethylester (CFDA-AM)Sind die zytoplasmatischen Fluoreszenzfarbstoffe, die für Lymphozytenmigrationsstudien verwendet werden. Allerdings haben FDA, CFDA und CFDA-AM eine niedrigere Retention in den Zellen 9 . BCECF-AM reduziert die proliferative Reaktion und beeinflusst die Chemotaxis- und Superoxidproduktion 9 , 12 . Calcein-AM ist ein fluoreszierender Farbstoff und nützlich für kurzfristige in vivo- Lymphozyten-Migrationsstudien. Es strahlt starke Fluoreszenzsignale aus, stört nicht die meisten zellulären Funktionen und behält fluoreszierende Signale für bis zu 3 Tage 12 , 13 bei . Fluoresceinisothiocyanat (FITC) und Carboxyfluoresceindiacetat-Succinimidylester (CFDA-SE) sind kovalente Kopplungs-Fluoreszenzfarbstoffe, die für Lymphozytenmigrationsstudien verwendet werden. FITC zeigt keine Auswirkung auf die Zelllebensfähigkeit und hat eine stärkere Affinität zu B-Lymphozyten als die T-Lymphozyten 14 , 15 </suP&gt;. Die CFDA-SE-markierten Lymphozyten können in vivo für mehr als 8 Wochen und bis zu 8 Zellteilungen 9 , 16 verfolgt werden . C18 DiI (1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyaninperchlorat), DiO (3,3&#39;-dioctadecyloxacarbocyaninperchlorat), Paul Karl Horan (PKH) 2, PKH3 und PKH26 sind Membran- Einfügen von fluoreszierenden lipophilen Carbocyaninfarbstoffen, die zur Markierung von Leukozyten und Erythrozyten verwendet werden. C18 Dil und DiO zeigen höhere Signale, wenn sie in die Zellmembran eingebaut werden und sind relativ ungiftig 12 , 17 . PKH2-, PKH3- und PKH26-markierte Zellen zeigen eine gute Retention der Fluoreszenzsignale mit weniger Toxizität 18 , 19 , 20 , 21 , 22 . Allerdings reguliert PKH2 down die CD62L-Expression und reduziert die ly<html> Mphozytenlebensfähigkeit 23 . Die meisten der oben erwähnten Studien wurden durchgeführt, um die Lymphozytenmigration und -proliferation in den Lymphgefäßen zu verfolgen und die markierten Erythrozyten in der nicht-okulären Zirkulation zu untersuchen. Es gibt sehr wenige Studien, die die Etikettierungstechniken anwenden, um die Blutzellen in der Augenzirkulation zu untersuchen. Die Anwendung der Scanning-Laser-Ophthalmoskopie (SLO) hat einen großen Vorteil beim Studium der markierten Zellen in der Netzhaut- und Aderhautzirkulation in vivo durch Fundusangiographie 24 . Es gibt mehrere Fluoreszenzfarbstoffe wie ICG, Acridinorange, FITC, Natriumfluorescein und CFDA, die verwendet werden, um die Leukozyten in der Retinalzirkulation durch SLO 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ,Class = &quot;xref&quot;&gt; 31 , 32 , 33 , 34 . Die Phototoxizität und Karzinogenität von Acridinorange 26 , 27 , die Interferenz von FITC mit der zellulären Aktivität und die Anforderung eines intravaskulären Kontrastmittels für die Auflösung der retinalen und choroidalen Blutgefäße beschränken ihre Anwendung in in vivo Tierversuchen 29 . Natriumfluorescein und ICG sind ungiftig, von der Food and Drug Administration genehmigt und sicher für die Prüfung auf Menschen 32 , 35 . Die meisten der dynamischen Strömungsstudien beziehen sich auf die Markierung der Leukozyten oder Erythrozyten und deren Visualisierung in den Netzhaut- und Aderhautblutgefäßen 36 , 37 , 38 , 39 </sUp&gt;. Hier beschreiben wir ein standardisiertes Protokoll der ICG-Markierung der Erythrozyten, die Natriumfluorescein-Markierung der Leukozyten und die Verfolgung der sichtbaren markierten Zellen in der Maus-Retinalzirkulation unter Verwendung von SLO.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="751">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">12633-50MG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Fluorescein 100 mg/mL</td>
			<td style="width:179px;">Novartis</td>
			<td style="width:119px;">U1705A/H-1330292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">10X Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade</td>
			<td style="width:179px;">1st BASE</td>
			<td style="width:119px;">BUF-2040-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) - EDTA concentration - 1.8 mg/mL of blood</td>
			<td style="width:179px;">BD, USA</td>
			<td style="width:119px;">REF 365974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Histopaque 1077 solution</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Centrifuge 5810 R</td>
			<td style="width:179px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">05-413-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Microcentrifuge tubes 2mL</td>
			<td style="width:179px;">Axygen</td>
			<td style="width:119px;">MCT-200-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:179px;">Insta BioAnalytik pte. ltd</td>
			<td style="width:119px;">FINE VORTEX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Shaker incubator</td>
			<td style="width:179px;">Lab Tech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100mg/mL)</td>
			<td style="width:179px;">Ceva</td>
			<td style="width:119px;">KETALAB03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20mg/Ml)</td>
			<td style="width:179px;">Troy Laboratories PTY. Limited</td>
			<td style="width:119px;">LI0605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%)</td>
			<td style="width:179px;">Alcon&#160;Laboratories, Inc. USA</td>
			<td style="width:119px;">NDC&#160;0998-0355-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%)</td>
			<td style="width:179px;">Alcon&#160;Laboratories, Inc. USA</td>
			<td style="width:119px;">NDC&#160;0998-0342-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Terumo syringe with needle 1cc/mL Tuberculin</td>
			<td style="width:179px;">Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines</td>
			<td style="width:119px;">SS-01T2613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:287px;">Vidisic Gel 10G</td>
			<td style="width:179px;">Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Alcohol swabs</td>
			<td style="width:179px;">Assure medical disposables</td>
			<td style="width:119px;">7M-004-L-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:287px;">Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2)</td>
			<td style="width:179px;">Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:287px;">Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0</td>
			<td style="width:179px;">Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Fluorescent microscope</td>
			<td style="width:179px;">ZEISS</td>
			<td style="width:119px;">Model: axio imager z1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent dye labeling of erythrocytes and leukocytes for studying the flow dynamics in mouse retinal circulation

Die retinale und choroidale Blutflussdynamik kann einen Einblick in die Pathophysiologie und Folgeerscheinungen verschiedener Augenkrankheiten wie Glaukom, diabetische Retinopathie, altersbedingte Makuladegeneration (AMD) und andere okuläre Entzündungszustände geben. Es kann auch helfen, die therapeutischen Reaktionen im Auge zu überwachen. Die korrekte Markierung der Blutzellen, gepaart mit der lebenden Zellenabbildung der markierten Zellen, ermöglicht die Untersuchung der Strömungsdynamik im Netzhaut- und Aderhautkreislauf. Hier beschreiben wir die standardisierten Protokolle von 1,5% Indocyaningrün (ICG) und 1% Natriumfluorescein-Markierung von Mäusen-Erythrozyten bzw. Leukozyten. Die Scanning-Laser-Ophthalmoskopie (SLO) wurde angewendet, um die markierten Zellen in der Retinalzirkulation von C57BL / 6J-Mäusen (Wildtyp) zu visualisieren. Beide Methoden zeigten deutliche fluoreszenzmarkierte Zellen in der Maus-Retinalzirkulation. Diese Etikettierungsmethoden können breitere Anwendungen bei verschiedenen Augenerkrankungen habenModelle.

Erythrozyten, markiert mit 1,5% ICG, wurden in der Netzhautzirkulation von C57BL / 6J-Mäusen (Wildtyp) sichtbar gemacht. Sowohl 1% als auch 5% Hämatokrit von 1,5% ICG-markierten Erythrozyten waren im Retinalkreislauf zu unterscheiden. Allerdings wurden die einzelnen markierten Zellen mit 1% Hämatokrit von 1,5% ICG-markierten Erythrozyten deutlicher sichtbar gemacht ( Abbildung 1 ). In 5% Hämatokrit war es aufgrund der großen Anzahl markierter Zellen in ...

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Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

Die Live-Zell-Bildgebung der markierten Blutzellen im Augenkreis kann Informationen über Entzündungen und Ischämie bei diabetischer Retinopathie und altersbedingter Makuladegeneration liefern. Ein Protokoll zur Etikettierung von Blutzellen und Bild der markierten Zellen in der Netzhautzirkulation ist beschrieben.

Fluoreszenzfarbstoff-Markierung von Erythrozyten und Leukozyten zum Studieren der Flußdynamik bei der Maus-Retinal-Zirkulation

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

The overall goal of this procedure is to visualize retinal circulation of blood cells in the mouse using a scanning laser ophthalmoscope. This method can help answer key questions about retinal diseases such as what is the retinal floor dynamics of WBCs and RBCs and how can their flow dynamics contribute to disease pathogenesis. The main advantages of this technique is that it can refelct on different disease phenotypes and it is also very easy to perform.This procedure will be demonstrated by our team members, Praveen, Bo Bo, and Neha. To isolate the mouse blood cells layer freshly collected whole blood on top of a 1:1 polysucrose and sodium diatrizoatem solution in a two milliliter tube. Then centrifuge the tube for 30 minutes.Next aspirate and discard the plasma supernatant. Then carefully collect the buffy coat layer composed of leukocytes and the underlying layer of erythrocytes in separate tubes. Next wash the erythrocytes with 1XPBS to remove any contaminants and resuspend them in one volume of PBS.Then transfer half milliliter aliquots of the suspension into microcentrifuge tubes. Spin down the aliquots, discard the supernatant and add about 200 microliters of 40%1XPBS to the pelleted erythrocytes. Mix them well.And incubate them at room temperature for five minutes. After five minutes, add 100 microliters of ICG to each suspension. Mix the tubes using inversions and then incubate them at room temperature for five minutes.Next add 300 microliters of 1XPBS and incubate for an hour with gentle agitation at 37 degree Celsius. Then centrifuge the suspensions, keep the pelleted cells and resuspend them in one milliliter of 1XPBS. Keep washing the cells with 1XPBS until the supernatant is clear.After decanting the supernatant add back one volume of 1%BSA and PBS to achieve 50%hematocrit of ICG labeled erythrocytes. Next process the buffy coat collection. First wash the cells once with 10 milliliters of 1XPBS to remove any contaminants.Centrifuge the samples again and then resuspend the pellet in 900 microliters of 1XPBS. Next add 100 microliters of 10%sodium fluorescein and incubate the cells at room temperature for two minutes. Finally wash the labeled lymphocytes three times with 10 milliliters of 1XPBS.Centrifuge and resuspend them in 100 microliters of 1XPBS. To prepare the ICG labeled erythrocytes for injection first dilute an aliquot for injection down to a 5%or 1%hematocrit. Anesthetize the mouse and dilate its pupils.Then apply ophthalmic ointment to both eyes. And place a contact lens over one of the eyes. Now image the mouse using a confocal SLO camera with a positive 25 diopter lens to compensate for the eye's refraction.Fresh perfectly direct the cornea to the optical head of the SLO machine. Next switch on the imaging module and to maneuver it until the optic nerve is at the center of the imaging screen. Then at a 30 degree angle take the infrared fundus images.Next take an infrared fundus video. Turn on the 790 nanometer ICG filter set the camera mode to high speed addition keep the view angle at 15 to 30 degrees. Then set the ICG intensity to 85 for all readings.On the control panel, click on the acquire button to take a baseline video at 8.8 to 15 frames per second for one minute. Next load 100 microliters of ICG labeled erythrocytes into an insulin syringe with a 30 gauge needle and inject the cells into the tail vein or inject them retroorbitally. Immediately after the injection, take a new infrared fundus image and a new ICG filter video.After acquiring the videos export them in TIFF format for image analysis. Process the images using the freely available imaging software package, MHJ. After opening the file, set the frame interval of the image video for velocity measurements.Then open the MtrackJ plugin. From the menu, select tracking and toggle the option for moving to next timeframe index after adding a point. Now locate a cell of interest and track through each frame.From the menu, click add to add a new track and then click on the chosen cell. Then continue clicking on the current position of the cell as images advance from frame to frame. Once tracked change the display option for the trajectory from the displaying choices and choose to display only the track points at the current time.Continue clicking until the trajectory of the cell is displayed and then save the track. Now proceed with tracking the next cell starting with the add command and proceeding as with the first cell. After tracking all the cells of interest open the display of all the track measurements using the measure option.Then save the output for further analysis. Erythrocytes labeled with 1.5%ICG were visualized in the retinal circulation of C57 black 6J mice using 1%or 5%hematocrit, cells were distinguishable but in the 1%hematocrit the labeled cells were more easily visualized. With either injected concentration some erythrostasis was observable in the parapapillary region and it was more visible with the 5%hematocrit.Leukocytes were labeled with 1%sodium fluorescein and visualized as green labeled cells using fluorescence microscopy. Some clumping was observed. Once mastered, this technique can be done in six hours if performed properly.While attempting this procedure, it is important to dilate the eyes to acquire quality retinal images and videos.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Medizin

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