Name: resolving affinity purified protein complexes by blue native page and protein correlation profiling
Uploaded: 2017-04-01T12:30:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling at JoVE.com

This work was funded by the Wellcome Trust (WT098051).

<ol>
	<li>Goudreault, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PP2A+phosphatase+high+density+interaction+network+identifies+a+novel+striatin-interacting+phosphatase+and+kinase+complex+linked+to+the+cerebral+cavernous+malformation+3+(CCM3)+protein.">A PP2A phosphatase high density interaction network identifies a novel striatin-interacting phosphatase and kinase complex linked to the cerebral cavernous malformation 3 (CCM3) protein.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (1), 157-171 (2009).</li><li>Leitner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+native+protein+structures+by+chemical+cross-linking,+mass+spectrometry,+and+bioinformatics.">Probing native protein structures by chemical cross-linking, mass spectrometry, and bioinformatics.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (8), 1634-1649 (2010).</li><li>Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginning+of+a+beautiful+friendship:+cross-linking/mass+spectrometry+and+modelling+of+proteins+and+multi-protein+complexes.">The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes.</a> J Struct Biol. 173 (3), 530-540 (2011).</li><li>Sinz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+cross-linking+and+mass+spectrometry+to+map+three-dimensional+protein+structures+and+protein-protein+interactions.">Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions.</a> Mass Spectrom Rev. 25 (4), 663-682 (2006).</li><li>Walzthoeni, T., Leitner, A., Stengel, F., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+supported+determination+of+protein+complex+structure.">Mass spectrometry supported determination of protein complex structure.</a> Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 252-260 (2013).</li><li>Kaake, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vivo+cross-linking+mass+spectrometry+platform+to+define+protein-protein+interactions+in+living+cells.">A new in vivo cross-linking mass spectrometry platform to define protein-protein interactions in living cells.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3533-3543 (2014).</li><li>Kao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+cross-linking+strategy+for+fast+and+accurate+identification+of+cross-linked+peptides+of+protein+complexes.">Development of a novel cross-linking strategy for fast and accurate identification of cross-linked peptides of protein complexes.</a> Mol Cell Proteomics. 10 (1), (2011).</li><li>Hughes, M. A., Langlais, C., Cain, K., MacFarlane, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterisation+and+reconstitution+of+cell+death+signalling+complexes.">Isolation, characterisation and reconstitution of cell death signalling complexes.</a> Methods. 61 (2), 98-104 (2013).</li><li>Lim, S., Zou, Y., Friedman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+activator+Mirk/Dyrk1B+is+sequestered+by+p38alpha/beta+MAP+kinase.">The transcriptional activator Mirk/Dyrk1B is sequestered by p38alpha/beta MAP kinase.</a> J Biol Chem. 277 (51), 49438-49445 (2002).</li><li>Havugimana, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+census+of+human+soluble+protein+complexes.">A census of human soluble protein complexes.</a> Cell. 150 (5), 1068-1081 (2012).</li><li>Kirkwood, K. J., Ahmad, Y., Larance, M., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+native+protein+complexes+and+protein+isoform+variation+using+size-fractionation-based+quantitative+proteomics.">Characterization of native protein complexes and protein isoform variation using size-fractionation-based quantitative proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3851-3873 (2013).</li><li>Kristensen, A. R., Gsponer, J., Foster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+approach+for+measuring+temporal+changes+in+the+interactome.">A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome.</a> Nat Methods. 9 (9), 907-909 (2012).</li><li>Liu, F., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+the+architecture+of+protein+assemblies+and+protein+interaction+networks+by+cross-linking+mass+spectrometry.">Interrogating the architecture of protein assemblies and protein interaction networks by cross-linking mass spectrometry.</a> Curr Opin Struct Biol. 35, 100-108 (2015).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions.">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li><li>Heide, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexome+profiling+identifies+TMEM126B+as+a+component+of+the+mitochondrial+complex+I+assembly+complex.">Complexome profiling identifies TMEM126B as a component of the mitochondrial complex I assembly complex.</a> Cell Metab. 16 (4), 538-549 (2012).</li><li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+953+human+proteins+from+a+mitochondrial+HEK293+fraction+by+complexome+profiling.">Analysis of 953 human proteins from a mitochondrial HEK293 fraction by complexome profiling.</a> PLoS One. 8 (7), 68340 (2013).</li><li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC-MS/MS+as+an+alternative+for+SDS-PAGE+in+blue+native+analysis+of+protein+complexes.">LC-MS/MS as an alternative for SDS-PAGE in blue native analysis of protein complexes.</a> Proteomics. 9 (17), 4221-4228 (2009).</li><li>Remmerie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+tobacco+BY-2+protein+complexes+with+BN+PAGE/LC-MS/MS+and+clustering+methods.">Unraveling tobacco BY-2 protein complexes with BN PAGE/LC-MS/MS and clustering methods.</a> J Proteomics. 74 (8), 1201-1217 (2011).</li><li>Sessler, N., Krug, K., Nordheim, A., Mordmuller, B., Macek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Plasmodium+falciparum+proteasome+using+Blue+Native+PAGE+and+label-free+quantitative+mass+spectrometry.">Analysis of the Plasmodium falciparum proteasome using Blue Native PAGE and label-free quantitative mass spectrometry.</a> Amino Acids. 43 (3), 1119-1129 (2012).</li><li>Bode, D., Yu, L., Tate, P., Pardo, M., Choudhary, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Two+Distinct+Nucleosome+Remodeling+and+Deacetylase+(NuRD)+Complex+Assemblies+in+Embryonic+Stem+Cells.">Characterization of Two Distinct Nucleosome Remodeling and Deacetylase (NuRD) Complex Assemblies in Embryonic Stem Cells.</a> Mol Cell Proteomics. 15 (3), 878-891 (2016).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+the+MaxQuant+computational+platform+for+SILAC-based+quantitative+proteomics.">A practical guide to the MaxQuant computational platform for SILAC-based quantitative proteomics.</a> Nat Protoc. 4 (5), 698-705 (2009).</li><li>Kim, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+regulatory+factor+recruits+the+nucleosome+remodeling+complex+to+wingless+integrated+(Wnt)+signaling+gene+promoters+in+mouse+embryonic+stem+cells.">A novel regulatory factor recruits the nucleosome remodeling complex to wingless integrated (Wnt) signaling gene promoters in mouse embryonic stem cells.</a> J Biol Chem. 287 (49), 41103-41117 (2012).</li><li>Lauberth, S. M., Rauchman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+12-amino+acid+motif+in+Sall1+recruits+the+nucleosome+remodeling+and+deacetylase+corepressor+complex.">A conserved 12-amino acid motif in Sall1 recruits the nucleosome remodeling and deacetylase corepressor complex.</a> J Biol Chem. 281 (33), 23922-23931 (2006).</li><li>Miller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sall4+controls+differentiation+of+pluripotent+cells+independently+of+the+Nucleosome+Remodelling+and+Deacetylation+(NuRD)+complex.">Sall4 controls differentiation of pluripotent cells independently of the Nucleosome Remodelling and Deacetylation (NuRD) complex.</a> Development. 143 (17), 3074-3084 (2016).</li><li>Dharmarajan, V., Lee, J. H., Patel, A., Skalnik, D. G., Cosgrove, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+WDR5+interaction+(Win)+motif+recognition+in+human+SET1+family+histone+methyltransferases.">Structural basis for WDR5 interaction (Win) motif recognition in human SET1 family histone methyltransferases.</a> J Biol Chem. 287 (33), 27275-27289 (2012).</li><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Smits, A. H., Jansen, P. W., Poser, I., Hyman, A. A., Vermeulen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+chromatin-associated+protein+complexes+revealed+by+label-free+quantitative+mass+spectrometry-based+proteomics.">Stoichiometry of chromatin-associated protein complexes revealed by label-free quantitative mass spectrometry-based proteomics.</a> Nucleic Acids Res. 41 (1), 28 (2013).</li><li>Lambert, J. P., Tucholska, M., Pawson, T., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+DNA+shearing+in+standard+affinity+purification+allows+simultaneous+identification+of+both+soluble+and+chromatin-bound+interaction+partners.">Incorporating DNA shearing in standard affinity purification allows simultaneous identification of both soluble and chromatin-bound interaction partners.</a> J Proteomics. 100, 55-59 (2014).</li><li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+PAGE.">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li><li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li><li>Schagger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li><li>Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B., Aebersold, R., Steimle, V., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+Blue+native/SDS+gel+electrophoresis+of+multi-protein+complexes+from+whole+cellular+lysates:+a+proteomics+approach.">Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).</li><li>Liu, F., Rijkers, D. T., Post, H., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+profiling+of+protein+assemblies+by+cross-linking+mass+spectrometry.">Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross-linking mass spectrometry.</a> Nat Methods. 12 (12), 1179-1184 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

هنا، نحن تصف استخدام تنقية تقارب يليه الأزرق الكهربائي للهلام الأصلي في تركيبة مع مطياف الكتلة الكمي لحل مجمعات البروتين. ويوفر هذا النهج طريقة لكشف قوائم التفاعل البروتين ذات بعد واحد في المجالس البروتين وظيفية. نحن لشرح طريقة تعتمد على استخدام البروتينات الموسومة حاتمة. ومع ذلك، إذا كان خط الخلية تعبر عن بروتين الموسومة غير متوفر، قد يكون بديلا لاستخدام أجسام مضادة ضد بروتين من الفائدة، شريطة وجود الببتيد المتاحة لتحقيق شطف تنافسية الأصلي. قد تحتاج إلى تعديل تبعا لمستوى التعبير عن بروتين الهدف كمية بدءا المادية وكمية من الخرز. ونحن أداء عادة هذا البروتوكول 2-5 × 10 8 خلايا بدءا المواد، وهذا يكفي حتى للبروتينات مع مستوى التعبير منخفضة. وينبغي اختيار تكوين العازلة تحلل تجريبيا لتحقيقبالقرب من إكمال الإذابة من الطعم. وهذا قد يكون صعبا بالنسبة لبعض أنواع البروتينات، وخاصة لونين ملزمة أو بروتينات الغشاء. وتشمل الخيارات البديلة زيادة كمية الملح، شريطة أن يكون بروتين معقد تحت الدراسة هو مستقر في الملح العالية، أو باستخدام صوتنة و / أو العلاج نوكلياز لونين البروتينات ملزمة 20 و 29. في حالة بروتينات الغشاء، والتحول إلى المنظفات DDM أو ديجيتونين قد يكون من المستحسن 30. في حالة DNA البروتينات ملزمة، فمن المفيد أن تشمل نوكلياز مثل benzonase خلال خطوة تنقية 20. إزالة كاملة من الأحماض النووية يضمن أن التفاعلات الكشف تحدث بين البروتينات ولم يتم بوساطة الحمض النووي. وثمة عنصر حاسم في الاعتبار عند استخدام هذا النهج هو استقرار المجمع قيد التحقيق. هذا الإجراء هو طويل وقد تنطوي على لحفز البروتين بين عشية وضحاها معقدة. لقد حققنا نجاحا جيدا مع مجمعين لونين إعادة عرض (D. بوده وM. باردو، لا تظهر البيانات)، ولكن هذا يجب أن يتم تقييم. يمكن اختصارها الخطوة تنقية تقارب إذا لزم الأمر. التقنيات البديلة التي تسمح للتجزئة الأم، مثل اللوني حجم الإقصاء، وقد استخدمت على نطاق واسع لأكثر من 50 عاما لتوصيف المجمعات البروتين. نحن وغيرنا قد أظهرت أن حل PAGE الأم الزرقاء متفوقة على أن تحقيق ذلك باستخدام حجم الإقصاء اللوني 20، 31، 32، 33. ميزة أخرى لPAGE الأم الزرقاء هو أنه لا يتطلب أنظمة اللوني، والتي هي مكلفة، وإنما يستخدم البروتين المعدات الكهربي التي هي على نطاق واسع في المختبرات. من حيث التدريب العملي في الوقت المحدد، وهذه الطريقة لا تنطوي على المزيد من العمل من أنصار الكنيسة الألمانية-MS / MS التقليدي لpproach أو غير متصل الكروماتوغرافي تجزئة. لكن، وكما تفعل معظم تقنيات تجزئة، ولها حدود لحلها. المجمعات التي هي متجانسة جدا أو قريبة في الكتلة والشكل قد يكون وراء قرار تقدمها PAGE الأم الزرقاء، وبالتالي البروتوكول كما ذكرت هنا قد لا تكون ناجحة عالميا في حل المجمعات متميزة مع مفارز مشتركة. ومن المشجع أن نكون قد وفقنا في فصل مجمعين رباعي القسيمات مشابهة جدا تقاسم ثلاثة مفارز (M. باردو، مخطوطة في الإعداد). منذ مطياف الكتلة قد تصبح حساسة على نحو متزايد، حتى كميات ضئيلة من interactors والملوثات غير محددة يمكن اكتشافه في عينات AP-MS. النهج المقدمة هنا قد يساعد في التمييز interactors حقيقية من التلوث الخلفية في تنقية تقارب من خلال التركيز على الاهتمام على البروتينات مع وجود قمم الهجرة التي تتزامن مع قمم الطعم الهجرة على أعلى الوزن الجزيئي من ذلكالبروتينات أحادى. وقد استخدمت العديد من المجموعات تقنيات تجزئة تليها البروتين ارتباط التنميط لتحديد بروتين المجمعات على نطاق واسع الخلوي دون الحاجة لعزل السابقة 10 و 11 و 12 و 34. ومع ذلك، فإن هذا يمكن أن يؤدي إلى الفشل في الكشف عن التفاعلات شبه متكافئة. إدراج خطوة التخصيب من خلال تنقية تقارب يمكن أن يساعد على التغلب على هذا. يجب أن يكون النهج الموصوف هنا من المفيد بشكل عام لاستكشاف طوبولوجيا المجمعات البروتين وكشف المجمعات متعددة بروتين معين يشارك في داخل نفس السياق الخلوية. استراتيجية بسيطة وقابلة للمختبرات التي قد لا تكون مكلفة المعدات تجزئة الكروماتوغرافي لحل مجمعات البروتين.

في الخلايا، فإن معظم البروتينات أداء مهامهم من خلال تفاعلات البروتين البروتين عابرة أو من خلال تشكيل مجالس البروتين مستقرة. تميز تفاعلات البروتين المهم لعمليات الخلوية فهم تماما. تنقية التقارب في تركيبة مع الطيف الكتلي (AP-MS) هي واحدة من الاستراتيجيات المطبقة الأكثر شيوعا لتحديد تفاعلات البروتين الأم. وقد أدخلت تحسينات كبيرة في قدرات الأدوات التي تحققت في العقد الماضي هذا النهج قوية للغاية. ومن المهم أن نلاحظ أن التفاعلات التي تم تحديدها من خلال التجارب AP-MS وتشمل خليطا من الجمعيات المباشرة وغير المباشرة بين الطعم ويفترس. وبالإضافة إلى ذلك، في كثير من الأحيان البروتينات تشارك في العديد من المجمعات المختلفة داخل نفس السياق الخلوية، والتي قد يكون لها دور البيولوجية المختلفة، وبالتالي فإن interactors التي يتم تحديدها من قبل AP-MS قد تمثل مزيجا من المجالس البروتين متميزة أو الكيانات الوظيفية. وليس من الممكن لاستخلاصهذه المعلومات الطوبوغرافية مسبقا من القوائم أحادية الأبعاد للبروتينات التي تولدها التجارب AP-MS بسيطة. ومع ذلك، فإن تقنية يمكن زيادة استغلالها لتحديد بنية البروتين المجمعات من خلال الجمع بين ذلك مع أساليب واحد أو أكثر لحل هذه التجمعات. من أجل حل طوبولوجيا من التفاعلات البروتينية التي تم تحديدها من خلال AP-MS، وقد تم تطبيق عدة استراتيجيات. نهج واحد هو لأداء متكررة التجارب AP-MS باستخدام يفترس التي تم تحديدها في الجولة السابقة من التجارب كما الطعوم 1. وعلى الرغم من المفيد جدا، وهذا هو تماما مهمة كثيفة العمالة على حد سواء بالتجربة وتحليلي. ويتزايد استخدام البروتين عبر ربط بالاشتراك مع مطياف الكتلة لاستخلاص المعلومات الطوبوغرافية على بروتين المجمعات 2، 3، 4، 5. ومع ذلك، computatioتحليل نال من الببتيدات عبر ربط لا يزال مهمة صعبة، وبالتالي هو عنق الزجاجة في سير العمل. ظهور الكواشف ربط عبر MS-شطورة أن يسهل رسم الخرائط من بقايا الأحماض الأمينية التي هي على مقربة في التفاعل البروتينات 6 و 7. وثمة بديل آخر يتمثل في الجمع بين تنقية تقارب مع تقنيات الفصل المتعامدة السابقة 8 و 9. وأيضا في الآونة الأخيرة تم استخدام تجزئة الكروماتوغرافي عن طريق الترشيح هلام أو التبادل الأيوني، أو السكروز تجزئة التدرج في تركيبة مع الطيفي الكمي لوصف المجمعات multiprotein في مستوى المنظومة، من خلال تمرير العزلة خطوة معقدة 10، 11، 12، 13. الأزرق هلام بولي أكريلاميد الأصلي الكهربائي (BN-PAGE) تم تطبيق على نطاق واسعالتحقيق في التفاعلات البروتينية الأم، وعادة تلك التي تنطوي على مجمعات البروتين غشاء الميتوكوندريا 14. كما كانت تستخدم هذه التقنية الانفصال مؤخرا بالاشتراك مع التسمية خالية الكمي البروتين والتنميط الارتباط، ليس فقط على المجمعات الميتوكوندريا 15، 16، 17، ولكن أيضا للكشف بروتين المجمعات الأخرى من الخلايا الكاملة 18 و 19. افترضنا أن الجمع بين تنقية تقارب مع نهج تجزئة الأم اللاحقة وMS الكمي ينبغي أن توفر استراتيجية مفيدة للحل المجالس البروتين متعددة تحتوي على بروتين معين. نحن هنا وصف الأسلوب الذي يجمع بين العامة على أساس حاتمة تنقية تقارب مع الأزرق الأصلي الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد من المجمعات معزولة، تليها س كتلة الكميectrometry والبروتين ارتباط التنميط، من أجل حل المجالس متعددة قد يكون متورطا بروتين في. نحن توظيف الماوس الجنينية الخلايا الجذعية حيث يتم التعبير عن بروتين من الفائدة تنصهر علامة حاتمة من موضع الذاتية لتحقيق مقربة من وفرة الفسيولوجية وضمان مواليد كفاءة العزلة معقدة. هذا النهج كشف النقاب عن التفاعلات متعددة بروتين يشارك في وحل لهم في مجالس مختلفة تعتمد على ملامح علاقة بهم، في حين لا تتطلب المزيد من العمل من التقليدية أنصار الكنيسة الألمانية-MS 20.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1384">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Protein G Dynabeads</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">10003D</td>
			<td style="width:452px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">FLAG antibody M2</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">F1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Tween-20, protein grade, 10% solution</td>
			<td style="width:285px;">Millipore</td>
			<td style="width:220px;">655206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Dimethyl pimelimidate</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">80490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">0.2 M Triethanolamine buffer, pH 8.2</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">T0449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">3x FLAG peptide</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">F4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Vivaspin 5K NMWCO, PES</td>
			<td style="width:285px;">Sartorius</td>
			<td style="width:220px;">VS0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">NativePAGE 3-12% Bis-Tris gel</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">20x NativePAGE Running Buffer</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">20x NativePAGE Cathode Additive</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">4x NativePAGE sample loading buffer</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">NativeMARK</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">LC0725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NativePAGE 5% G-250 sample additive&#160;</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Nunc conical bottom 96-well plate, polypropylene</td>
			<td style="width:285px;">Thermo</td>
			<td style="width:220px;">249944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Multiscreen HTS 96-well filtration system</td>
			<td style="width:285px;">Thermo</td>
			<td style="width:220px;">MSDVN6550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Nunc 96-well cap natural</td>
			<td style="width:285px;">Thermo</td>
			<td style="width:220px;">276002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride)</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Acetonitrile, HPLC grade</td>
			<td style="width:285px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">A/0627/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Trypsin, sequencing grade</td>
			<td style="width:285px;">Roche</td>
			<td style="width:220px;">11418475001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Software</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">MaxQuant (software)</td>
			<td style="width:285px;">N.A.</td>
			<td style="width:220px;">N.A.</td>
			<td style="width:452px;">http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Perseus (software)</td>
			<td style="width:285px;">N.A.</td>
			<td style="width:220px;">N.A.</td>
			<td style="width:452px;">http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

resolving affinity purified protein complexes by blue native page and protein correlation profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

سير العمل في تنقية تقارب الأزرق التنميط الأصلي البروتين الارتباط التي كتبها الطيف الكتلي هو مبين (ABC-MS) استراتيجية في الشكل 7. يتم عزل بروتين المجمعات الوطنية حول بروتين الاهتمام من جانب تنقية تقارب باستخدام الأجسام المضادة ضد علامة حاتمة (في هذه الحالة FLAG) وشطف تنافسية. يتم حل المجمعات التي كتبها BN-PAGE، ورفعه جل حارة كله إلى 48 أقسام، وعلى استعداد لطلقات نارية LC-MS / MS. يستخدم المعلومات MS الكمية لإنشاء ملف تعريف الهجرة لكل بروتين تحديدها عبر فصل الأصلي الأزرق. البروتينات التي تتفاعل لتشكيل متميزة عرض معقدة ملامح هجرة مماثلة مع القمم superimposable. عندما يأخذ بروتين من الفائدة شارك في أكثر من محفل، لوحظ قمم متعددة في التشكيل الهجرة لها، نظرا لالمجمعات الفرعية ضمن قوة حل من هلام الأصلي الأزرق. مقارنة منهجية لميجلمحات التموينية يمكن أن يتحقق عن طريق ارتباط بروتين التنميط باستخدام المجموعات الهرمية. وتصور لdendrogram وشدة الذروة لجميع كسور في الحرارة الخريطة، تسهيل تحديد التفاعل البروتينات التي تنتمي إلى المجمعات البروتين متميزة (الشكل 8). استخدمنا هذه الاستراتيجية لتحليل شركاء التفاعل من Mta2، وحدة فرعية أساسية من لونين NuRD إعادة عرض تعقيدا 20. كما هو مبين في الشكل 9، عرض الملف الشخصي هجرة Mta2 قمتين من شدة واضحة بين 700 كيلو دالتون و 1.2 نجمة داود الحمراء، مع ذروة الجماعية أقل عرض أعلى وفرة. وأظهرت مفارز NuRD الأساسية الأخرى، بما في ذلك Mta1 / 3، Hdac1 / 2 و Mbd3، نمط الفصل متطابقة، وإن كانت القمم لبعض مفارز، وهي Chd4، كان Gatad2a / ب وRbbp4 / 7، وتوزيع وفرة معكوس (الشكل 9A، B). في المقابل، فإن الملف الشخصى للمعلمين2ap1، وهو عامل تنظيمي المجندين مجمع NuRD لمروجي الجينات WNT 23، عرض فقط قمة جماهيرية أعلى (الشكل 9C)، وكذلك فعل Sall4، وقامع النسخي الذي ثبت أيضا لربط NuRD 20 و 24 و 25. وهكذا، فإن تجزئة من البروتينات المرتبطة Mta2 النقاء تقارب كتبها PAGE الأم الزرقاء قادرة على حل شكلين مختلفين من مجمع NuRD. كما يسمح ABC-MS تحديد interactors جديدة في حين تعيينهم إلى هيئات معينة تابعة للبروتين. من خلال فحص مجموعات البروتينات وشدة جزء ممثلة في الحرارة خريطة اكتشفنا وجود علاقة قوية بين مفارز NuRD وWdr5، وحدة فرعية التنظيمية للناقلة ميثيل مجمع MLL 26، مع Wdr5 عرض قمتين الهجرة تتزامن مع اثنين NuRD صeaks (الشكل 8)، مما يشير إلى التفاعل الرواية بين Wdr5 وNuRD. أكدنا هذا التفاعل عن طريق المشاركة في مناعي وشارك في الهجرة في حجم الإقصاء اللوني 20. وسيكون اختيار المسافة حساب متري في المجموعات الهرمية تؤثر على شكل مجموعات، وبالتالي الارتباطات. نوصي تجريب مع مقاييس مختلفة لتحقيق أفضل تتناسب مع المعرفة التفاعل القائمة من البروتين أو مجمع الفائدة. عموما حققنا أفضل النتائج مع مانهاتن (L1) مسافة قياس 20. كما تم الإبلاغ عن ارتباط بيرسون أو مقاييس المسافة الإقليدية لتحديد المجمعات استنادا إلى تقنيات بديلة تجزئة 10 و 11 و 12. وتشيوانويمكن أيضا أن البيانات titative MS الحصول عليها من كسور الأم الزرقاء أن تستخدم لتحديد العناصر المتفاعلة المجمعات البروتين. وتقدم (على أساس تقدير المطلقة كثافة) قيمة iBAQ مقياس الوفرة النسبية من البروتينات التي تم تحديدها 27 و 28. قيم iBAQ لأعضاء بروتين معقد في جميع الكسور في ذروة الشخصي الهجرة إلى طبيعتها إلى أن من البروتين الطعم للحصول على الكميات النسبية. ينبغي أن iBAQs تطبيع عبر الذروة الشخصي لأحد أفراد بروتين معين معقدة اتباع الاتجاه الأفقي، والقيم الاتجاه تعكس رياضيات الكيمياء من البروتينات التفاعل النسبية للبروتين الطعم. للحصول على تمثيل أكثر تفصيلا للحسابات رياضيات الكيمياء، انظر 20. <img alt="الرقم 7" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig7.jpg" /> الشكل 7: رسم تخطيطي سير العمل يلخص ABC-MS الصورةtrategy. تم تعديل هذا الرقم من 20. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig7large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 8" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig8.jpg" /> الشكل 8. التجميع الهرمي لمحات الهجرة BN-PAGE من interactors Mta2. وتتجمع البروتينات المرتبطة Mta2 على أساس التشابه في الملامح هجرتهم. فقط يتم عرض مجموعة فرعية من حرارة خريطة تحتوي على مجمع NuRD (المغلقة في المربع الأزرق). المربع الأصفر يسلط الضوء على علاقة قوية من Wdr5 مع مجمع NuRD. وقدرت الأوزان الجزيئية المشروح من مسافات الهجرة من المعايير البروتين تشغيل في نفس هلام. وقد نشر هذا البحث أصلا في الجزيئية والخلوية البروتيوميات 20 للجمعية الأمريكية للكيمياء الحيوية ومو<html> علم الأحياء lecular. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig8large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 9" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig9.jpg" /> الشكل 9. BN-PAGE الشخصي هجرة مفارز NuRD والبروتينات المرتبطة بها. A) Mta2 وNuRD مفارز الحالية في نمط كثافة مماثلة. B) Mta2 وNuRD مفارز مع نمط كثافة معكوس. C) Mta2 وCdk2ap1، التي هي موجودة فقط في الوزن الجزيئي كيان أعلى NuRD. وقدرت الأوزان الجزيئية المشروح من التشكيل الجانبي هجرة المعايير البروتين. وقد نشر هذا البحث أصلا في الجزيئية والخلوية البروتيوميات 20 للجمعية الأمريكية للكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية._blank &quot;&gt; اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الملف التكميلي" src="/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.jpg" /> البيانات التكميلية: بيانات عينة. MaxQuant المستمدة ملف proteingroups.txt التي تحتوي على البروتين هويات والقيم الكمي من تجربة ABC-MS. وقد نشر هذا البحث أصلا في الجزيئية والخلوية البروتيوميات 20 للجمعية الأمريكية للكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.txt" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling at JoVE.com

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

هنا نقدم بروتوكولات لتنقية تقارب من المجمعات البروتين وفصلهم من قبل PAGE الأم الزرقاء، تليها البروتين ارتباط التنميط باستخدام التسمية مجانا الكمي مطياف الكتلة. هذه الطريقة مفيدة لحل interactomes إلى مجمعات البروتين متميزة.

حل تقارب تنقية البروتين المجمعات التي كتبها Blue الأصلية PAGE والبروتين الارتباط التنميط

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

البروتين مجمع القبض على الانجذاب من خلايا الثدييات Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

جنبا إلى جنب تقارب تنقية البروتين المجمعات من خلايا حقيقية النواة

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

متعدد القسيمات-PAGE، طريقة لالتقاط وحل البروتين المجمعات في العينات البيولوجية

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

الأفقي جل الكهربائي للكشف عن تعزيز المجمعات البروتين رنا

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

سبليت-بيويد-تحليل البروتين مجمعات البروتين محددة السياق في بيئتها الخلوية الأصلية

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 في 1: انجذاب تطهير لتحليل مواز للبروتين-بروتين والبروتين-المستقلب المجمعات من خطوة واحدة

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

تحليل الغشاء ثايلاكويد البروتين المجمعات بالتفريد جل الأصلي الأزرق

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

انجذاب تطهير المجمعات البروتين ترانسلوكون بلاستيدات الخضراء باستخدام علامة الحنفية

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

قياس حساسية عالية من الانتماءات الملزمة الحمض النووي عامل النسخ بالتنافسية معايرة باستخدام مجهر الأسفار

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

تحليل لطي البروتين، والنقل، وتدهور في الخلايا الحية بمطاردة نبض المشعة

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...