Name: resolving affinity purified protein complexes by blue native page and protein correlation profiling
Uploaded: 2017-04-01T12:30:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling at JoVE.com

This work was funded by the Wellcome Trust (WT098051).

<ol>
	<li>Goudreault, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PP2A+phosphatase+high+density+interaction+network+identifies+a+novel+striatin-interacting+phosphatase+and+kinase+complex+linked+to+the+cerebral+cavernous+malformation+3+(CCM3)+protein.">A PP2A phosphatase high density interaction network identifies a novel striatin-interacting phosphatase and kinase complex linked to the cerebral cavernous malformation 3 (CCM3) protein.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (1), 157-171 (2009).</li><li>Leitner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+native+protein+structures+by+chemical+cross-linking,+mass+spectrometry,+and+bioinformatics.">Probing native protein structures by chemical cross-linking, mass spectrometry, and bioinformatics.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (8), 1634-1649 (2010).</li><li>Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginning+of+a+beautiful+friendship:+cross-linking/mass+spectrometry+and+modelling+of+proteins+and+multi-protein+complexes.">The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes.</a> J Struct Biol. 173 (3), 530-540 (2011).</li><li>Sinz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+cross-linking+and+mass+spectrometry+to+map+three-dimensional+protein+structures+and+protein-protein+interactions.">Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions.</a> Mass Spectrom Rev. 25 (4), 663-682 (2006).</li><li>Walzthoeni, T., Leitner, A., Stengel, F., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+supported+determination+of+protein+complex+structure.">Mass spectrometry supported determination of protein complex structure.</a> Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 252-260 (2013).</li><li>Kaake, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vivo+cross-linking+mass+spectrometry+platform+to+define+protein-protein+interactions+in+living+cells.">A new in vivo cross-linking mass spectrometry platform to define protein-protein interactions in living cells.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3533-3543 (2014).</li><li>Kao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+cross-linking+strategy+for+fast+and+accurate+identification+of+cross-linked+peptides+of+protein+complexes.">Development of a novel cross-linking strategy for fast and accurate identification of cross-linked peptides of protein complexes.</a> Mol Cell Proteomics. 10 (1), (2011).</li><li>Hughes, M. A., Langlais, C., Cain, K., MacFarlane, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterisation+and+reconstitution+of+cell+death+signalling+complexes.">Isolation, characterisation and reconstitution of cell death signalling complexes.</a> Methods. 61 (2), 98-104 (2013).</li><li>Lim, S., Zou, Y., Friedman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+activator+Mirk/Dyrk1B+is+sequestered+by+p38alpha/beta+MAP+kinase.">The transcriptional activator Mirk/Dyrk1B is sequestered by p38alpha/beta MAP kinase.</a> J Biol Chem. 277 (51), 49438-49445 (2002).</li><li>Havugimana, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+census+of+human+soluble+protein+complexes.">A census of human soluble protein complexes.</a> Cell. 150 (5), 1068-1081 (2012).</li><li>Kirkwood, K. J., Ahmad, Y., Larance, M., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+native+protein+complexes+and+protein+isoform+variation+using+size-fractionation-based+quantitative+proteomics.">Characterization of native protein complexes and protein isoform variation using size-fractionation-based quantitative proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3851-3873 (2013).</li><li>Kristensen, A. R., Gsponer, J., Foster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+approach+for+measuring+temporal+changes+in+the+interactome.">A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome.</a> Nat Methods. 9 (9), 907-909 (2012).</li><li>Liu, F., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+the+architecture+of+protein+assemblies+and+protein+interaction+networks+by+cross-linking+mass+spectrometry.">Interrogating the architecture of protein assemblies and protein interaction networks by cross-linking mass spectrometry.</a> Curr Opin Struct Biol. 35, 100-108 (2015).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions.">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li><li>Heide, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexome+profiling+identifies+TMEM126B+as+a+component+of+the+mitochondrial+complex+I+assembly+complex.">Complexome profiling identifies TMEM126B as a component of the mitochondrial complex I assembly complex.</a> Cell Metab. 16 (4), 538-549 (2012).</li><li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+953+human+proteins+from+a+mitochondrial+HEK293+fraction+by+complexome+profiling.">Analysis of 953 human proteins from a mitochondrial HEK293 fraction by complexome profiling.</a> PLoS One. 8 (7), 68340 (2013).</li><li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC-MS/MS+as+an+alternative+for+SDS-PAGE+in+blue+native+analysis+of+protein+complexes.">LC-MS/MS as an alternative for SDS-PAGE in blue native analysis of protein complexes.</a> Proteomics. 9 (17), 4221-4228 (2009).</li><li>Remmerie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+tobacco+BY-2+protein+complexes+with+BN+PAGE/LC-MS/MS+and+clustering+methods.">Unraveling tobacco BY-2 protein complexes with BN PAGE/LC-MS/MS and clustering methods.</a> J Proteomics. 74 (8), 1201-1217 (2011).</li><li>Sessler, N., Krug, K., Nordheim, A., Mordmuller, B., Macek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Plasmodium+falciparum+proteasome+using+Blue+Native+PAGE+and+label-free+quantitative+mass+spectrometry.">Analysis of the Plasmodium falciparum proteasome using Blue Native PAGE and label-free quantitative mass spectrometry.</a> Amino Acids. 43 (3), 1119-1129 (2012).</li><li>Bode, D., Yu, L., Tate, P., Pardo, M., Choudhary, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Two+Distinct+Nucleosome+Remodeling+and+Deacetylase+(NuRD)+Complex+Assemblies+in+Embryonic+Stem+Cells.">Characterization of Two Distinct Nucleosome Remodeling and Deacetylase (NuRD) Complex Assemblies in Embryonic Stem Cells.</a> Mol Cell Proteomics. 15 (3), 878-891 (2016).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+the+MaxQuant+computational+platform+for+SILAC-based+quantitative+proteomics.">A practical guide to the MaxQuant computational platform for SILAC-based quantitative proteomics.</a> Nat Protoc. 4 (5), 698-705 (2009).</li><li>Kim, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+regulatory+factor+recruits+the+nucleosome+remodeling+complex+to+wingless+integrated+(Wnt)+signaling+gene+promoters+in+mouse+embryonic+stem+cells.">A novel regulatory factor recruits the nucleosome remodeling complex to wingless integrated (Wnt) signaling gene promoters in mouse embryonic stem cells.</a> J Biol Chem. 287 (49), 41103-41117 (2012).</li><li>Lauberth, S. M., Rauchman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+12-amino+acid+motif+in+Sall1+recruits+the+nucleosome+remodeling+and+deacetylase+corepressor+complex.">A conserved 12-amino acid motif in Sall1 recruits the nucleosome remodeling and deacetylase corepressor complex.</a> J Biol Chem. 281 (33), 23922-23931 (2006).</li><li>Miller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sall4+controls+differentiation+of+pluripotent+cells+independently+of+the+Nucleosome+Remodelling+and+Deacetylation+(NuRD)+complex.">Sall4 controls differentiation of pluripotent cells independently of the Nucleosome Remodelling and Deacetylation (NuRD) complex.</a> Development. 143 (17), 3074-3084 (2016).</li><li>Dharmarajan, V., Lee, J. H., Patel, A., Skalnik, D. G., Cosgrove, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+WDR5+interaction+(Win)+motif+recognition+in+human+SET1+family+histone+methyltransferases.">Structural basis for WDR5 interaction (Win) motif recognition in human SET1 family histone methyltransferases.</a> J Biol Chem. 287 (33), 27275-27289 (2012).</li><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Smits, A. H., Jansen, P. W., Poser, I., Hyman, A. A., Vermeulen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+chromatin-associated+protein+complexes+revealed+by+label-free+quantitative+mass+spectrometry-based+proteomics.">Stoichiometry of chromatin-associated protein complexes revealed by label-free quantitative mass spectrometry-based proteomics.</a> Nucleic Acids Res. 41 (1), 28 (2013).</li><li>Lambert, J. P., Tucholska, M., Pawson, T., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+DNA+shearing+in+standard+affinity+purification+allows+simultaneous+identification+of+both+soluble+and+chromatin-bound+interaction+partners.">Incorporating DNA shearing in standard affinity purification allows simultaneous identification of both soluble and chromatin-bound interaction partners.</a> J Proteomics. 100, 55-59 (2014).</li><li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+PAGE.">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li><li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li><li>Schagger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li><li>Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B., Aebersold, R., Steimle, V., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+Blue+native/SDS+gel+electrophoresis+of+multi-protein+complexes+from+whole+cellular+lysates:+a+proteomics+approach.">Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).</li><li>Liu, F., Rijkers, D. T., Post, H., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+profiling+of+protein+assemblies+by+cross-linking+mass+spectrometry.">Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross-linking mass spectrometry.</a> Nat Methods. 12 (12), 1179-1184 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Her, beskriver vi anvendelsen af ​​affinitetsoprensning efterfulgt af blå nativ gelelektroforese i kombination med kvantitativ massespektrometri til at løse proteinkomplekser. Denne fremgangsmåde giver en metode til at trævle endimensionale protein interaktion lister i funktionelle proteinkonstruktioner. Vi viser fremgangsmåden baseret på anvendelsen af ​​epitopmærkede proteiner. Men hvis en cellelinie, der udtrykker et mærket protein ikke er tilgængelig, kan en alternativ være at anvende antistoffer mod proteinet af interesse, forudsat at der er et peptid til rådighed til at opnå nativt kompetitiv eluering. Mængden af ​​udgangsmateriale og mængde af perler skal muligvis ændres afhængigt af ekspressionsniveauet af målproteinet. Vi typisk udføre denne protokol med 2-5 x 10 8 celler udgangsmateriale, og dette er tilstrækkeligt selv for proteiner med lavt ekspressionsniveau. Lyseringsbufferen sammensætning bør vælges empirisk for at opnånær at fuldføre opløsningen af ​​agn. Dette kan være en udfordring for nogle typer af proteiner, især kromatinbinding eller membranproteiner. Alternative muligheder omfatter forøgelse af mængden af salt, forudsat at proteinet kompleks under undersøgelsen er stabil i høj salt eller anvendelse af lydbehandling og / eller nuklease behandling for chromatin bindingsproteiner 20, 29. I tilfælde af membranproteiner, kan skifte detergent til DDM eller digitonin være tilrådeligt 30. I tilfælde af DNA-bindende proteiner, er det nyttigt at omfatte en nuklease, såsom Benzonase under oprensningen trin 20. Fuldstændig fjernelse af nukleinsyrer sikrer, at de detekterede interaktioner forekomme mellem proteiner og ikke er medieret af DNA. Et kritisk element til at overveje, når du bruger denne metode er stabiliteten af ​​komplekset, der undersøges. Proceduren er lang og kan involvere preserving proteinkomplekset natten over. Vi har opnået god succes med to kromatin remodeling komplekser (D. Bode og M. Pardo, data ikke vist), men dette bør evalueres. Affinitetsrensningstrinnet kan afkortes, hvis det kræves. Alternative teknikker, der tillader native fraktionering, såsom gelpermeationskromatografi, er ofte blevet brugt i over 50 år til at karakterisere proteinkomplekser. Vi og andre har vist, at løsningen af blå nativ PAGE er overlegen i forhold til den, der opnås ved anvendelse af gelpermeationskromatografi 20, 31, 32, 33. En anden fordel ved blå nativ PAGE er, at det ikke kræver kromatografisystemer, som er dyre, men snarere anvender protein elektroforetisk udstyr, der er udbredt i laboratorier. Med hensyn til hands-on tid, denne metode involverer ikke mere arbejde end den traditionelle geLC-MS / MS enMETODE eller offline kromatografisk fraktionering. Men som de fleste fraktionering teknikker gør, det har en grænse for deres løsning. Komplekser, der er meget homogene eller tæt i masse og form kan være uden beslutningen tilbydes af blå nativ PAGE, og dermed protokol som rapporteret her, er måske ikke være universelt vellykket i løsningen særskilte komplekser med delte underenheder. Opmuntrende, har vi haft succes med at adskille to meget ens tetrameriske komplekser deler tre underenheder (M. Pardo, manuskript under udarbejdelse). Da massespektrometri bliver stadig mere følsom, kan detekteres selv små mængder af ikke-specifikke interaktører og forurenende stoffer i AP-MS-prøver. Den foreslåede fremgangsmåde her, er måske hjælpe til diskrimination af reelle interaktører fra baggrund forurening i affinitetsoprensning ved at fokusere opmærksomheden på proteiner med migration toppe, der falder sammen med agn migration toppe ved højere molekylvægt end den forde monomere proteiner. Adskillige grupper har brugt fraktioneringsteknikker efterfulgt af protein korrelation profilering at afgrænse proteinkomplekser ved cellulær skala uden behov for forudgående isolation 10, 11, 12, 34. Imidlertid kan dette resultere i manglende detektering sub-støkiometrisk interaktioner. Inkorporeringen af ​​en berigning trin gennem affinitetsoprensning kan bidrage til at overvinde dette. Den her beskrevne fremgangsmåde bør være generelt egnede til at udforske topologien af ​​proteinkomplekser og optrævling de multiple komplekser et givet protein tager del i inden for samme cellulære kontekst. Strategien er enkel og modtagelig for laboratorier, der måske ikke har dyrt kromatografisk fraktionering udstyr til at løse proteinkomplekser.

I celler, de fleste proteiner udfører deres funktioner gennem forbigående protein-protein-interaktioner eller ved dannelse af stabile protein-aggregater. Karakterisering proteininteraktioner er afgørende for fuldt forstå cellulære processer. Affinitetsoprensning i kombination med massespektrometri (AP-MS) er en af ​​de mest almindeligt anvendte strategier til at identificere native protein-interaktioner. Væsentlige forbedringer i instrument kapaciteter opnået i de seneste ti år har gjort denne fremgangsmåde ekstremt kraftfuld. Det er vigtigt at bemærke, at interaktionerne identificeret ved AP-MS eksperimenter, indbefatter en blanding af direkte og indirekte sammenhænge mellem agn og byttedyr. Desuden ofte proteiner deltage i flere forskellige komplekser inden for samme cellulære kontekst, som kan have forskellige biologiske roller, og derfor interaktionskandidater, som er identificeret ved AP-MS kan udgøre en blanding af forskellige protein-samlinger eller funktionelle enheder. Det er ikke muligt at udledesådan topologisk information a priori fra mono-dimensionelle lister over proteiner der genereres af simple AP-MS eksperimenter. Imidlertid kan teknikken udnyttes yderligere at definere arkitekturen af ​​proteinkomplekser ved at kombinere det med en eller flere metoder til at løse disse enheder. For at løse topologien af ​​protein interaktioner identificeret ved AP-MS, har flere strategier blevet anvendt. En fremgangsmåde er at udføre iterative AP-MS forsøg under anvendelse byttedyr identificeret i en tidligere runde af forsøg som lokkemad 1. Selvom meget informativ, dette er en ganske arbejdskrævende opgave både eksperimentelt og analytisk. Protein tværbinding i kombination med massespektrometri anvendes i stigende grad til at udlede topologisk information om proteinkomplekser 2, 3, 4, 5. Men computational analyse af tværbundne peptider stadig en udfordrende opgave og dermed er flaskehalsen i arbejdsgangen. Fremkomsten af MS-spaltelige tværbindingsreagenser bør lette kortlægning af aminosyreresterne, der er i tæt nærhed i interagerende proteiner 6, 7. Et andet alternativ er at kombinere affinitetsoprensning med kendte ortogonale separationsteknikker 8, 9. Kromatografisk fraktionering ved gelfiltrering eller ionbytning eller saccharosegradientfraktionering er også for nylig blevet anvendt i kombination med kvantitativ massespektrometri til at beskrive multiproteinkomplekser på et system-plan, for at omgå den komplekse isolation trin 10, 11, 12, 13. Blå nativ polyacrylamidgelelektroforese (BN-PAGE) har været almindeligt anvendt tilundersøge native protein-interaktioner, typisk dem, der involverer mitokondriske membran proteinkomplekser 14. Denne adskillelse teknik blev også for nylig anvendes i kombination med etiket-frit protein kvantificering og korrelation profilering, ikke kun på mitokondrielle komplekser 15, 16, 17, men også for optrevling andre proteinkomplekser fra hele celler 18, 19. Vi antager, at kombinationen af ​​affinitetsrensning med efterfølgende native fraktioneringstrin tilgange og kvantitativ MS bør give en nyttig strategi til løsning af flere proteinkonstruktioner indeholdende et særligt protein. Her beskriver vi en fremgangsmåde, der kombinerer generiske epitopbaseret affinitetsoprensning med blå nativ polyacrylamidgelelektroforese af de isolerede komplekser, efterfulgt af kvantitativ masse spectrometry og protein korrelation profilering, for at løse de mange samlinger et protein kan være involveret i. Vi anvender musen embryonale stamceller, hvor et protein af interesse fusioneret til et epitopmærke udtrykkes fra det endogene locus for at opnå tæt på fysiologisk overflod og sikre en effektiv native kompleks isolation. Denne tilgang optrevler de multiple interaktioner et protein indgriber i, at løse dem i særskilte enheder baseret på deres sammenligningstabeller profiler, mens ikke kræver mere arbejde end konventionelle geLC-MS 20.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1384">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Protein G Dynabeads</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">10003D</td>
			<td style="width:452px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">FLAG antibody M2</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">F1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Tween-20, protein grade, 10% solution</td>
			<td style="width:285px;">Millipore</td>
			<td style="width:220px;">655206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Dimethyl pimelimidate</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">80490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">0.2 M Triethanolamine buffer, pH 8.2</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">T0449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">3x FLAG peptide</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">F4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Vivaspin 5K NMWCO, PES</td>
			<td style="width:285px;">Sartorius</td>
			<td style="width:220px;">VS0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">NativePAGE 3-12% Bis-Tris gel</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">20x NativePAGE Running Buffer</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">20x NativePAGE Cathode Additive</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">4x NativePAGE sample loading buffer</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">NativeMARK</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">LC0725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NativePAGE 5% G-250 sample additive&#160;</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Nunc conical bottom 96-well plate, polypropylene</td>
			<td style="width:285px;">Thermo</td>
			<td style="width:220px;">249944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Multiscreen HTS 96-well filtration system</td>
			<td style="width:285px;">Thermo</td>
			<td style="width:220px;">MSDVN6550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Nunc 96-well cap natural</td>
			<td style="width:285px;">Thermo</td>
			<td style="width:220px;">276002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride)</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Acetonitrile, HPLC grade</td>
			<td style="width:285px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">A/0627/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Trypsin, sequencing grade</td>
			<td style="width:285px;">Roche</td>
			<td style="width:220px;">11418475001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Software</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">MaxQuant (software)</td>
			<td style="width:285px;">N.A.</td>
			<td style="width:220px;">N.A.</td>
			<td style="width:452px;">http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Perseus (software)</td>
			<td style="width:285px;">N.A.</td>
			<td style="width:220px;">N.A.</td>
			<td style="width:452px;">http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

resolving affinity purified protein complexes by blue native page and protein correlation profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Arbejdsgangen af Affinitetsoprensning Blå native protein Correlation profilering af massespektrometri (ABC-MS) strategi er afbildet i figur 7. Native proteinkomplekser omkring et protein af interesse isoleres ved affinitetsoprensning under anvendelse af antistoffer mod en epitop-tag (i dette tilfælde FLAG) og kompetitiv eluering. Komplekserne løses af BN-PAGE, og hele gelbanen udskæres i 48 sektioner, og forberedt til shotgun LC-MS / MS. Kvantitativ MS oplysninger bruges til at generere en migration profil for hver identificeret protein på tværs af blå native adskillelse. Proteiner, der interagerer for at danne et særskilt kompleks display lignende profiler migration med overlejres toppe. Når et protein af interesse deltager i mere end én samling multiple toppe observeret i sin vandring profil, i betragtning af de sub-komplekser er inden opløsningsevne af det blå nativ gel. En systematisk sammenligning af migration profiler kan opnås ved protein korrelation profilering anvendelse hierarkisk klyngedannelse. Dendrogrammet og topintensiteterne for alle fraktioner visualiseres i en varme-kort, hvilket letter identifikationen af interagerende proteiner, der hører til forskellige proteinkomplekser (figur 8). Vi brugte denne strategi til at analysere de interagerende partnere MTA2, en kerne underenhed af NuRD kromatin remodeling kompleks 20. Som vist i figur 9, migration profil MTA2 vises to toppe af distinkte intensiteter mellem 700 kDa og 1,2 MDa, med den nedre massetop vise højere overflod. Andre NuRD core underenheder, herunder Mta1 / 3, HDAC1 / 2 og Mbd3, viste identisk adskillelse mønster, omend toppene for nogle af de underenheder, nemlig Chd4, Gatad2a / b og Rbbp4 / 7, havde den inverse overflod distribution (figur 9A, B). I modsætning hertil profilen af ​​Cdk2ap1, en regulatorisk faktor, der rekrutterer NuRD komplekset til Wnt genpromotorer 23, vises kun den højere masse top (figur 9C), og det gjorde Sall4, en transskriptionsrepressor der også er blevet vist at binde NuRD 20, 24, 25. Således, fraktionering af affinitetsrensede MTA2-associerede proteiner ved blå nativ PAGE var i stand til at løse to forskellige former af NuRD kompleks. ABC-MS tillader også identifikation af hidtil ukendte interaktører samtidig tildele dem til bestemte protein enheder. Ved undersøgelse af proteinerne klynger og fraktion intensiteter repræsenteret i en varme-map detekteret vi en stærk korrelation mellem NuRD underenheder og Wdr5, en regulatorisk underenhed af MLL methyltransferase kompleks 26, med Wdr5 udviser to migration toppe sammenfaldende med de to NuRD peaks (figur 8), hvilket tyder på en hidtil ukendt vekselvirkning mellem Wdr5 og NuRD. Vi bekræftede denne interaktion ved co-immunpræcipitering og co-migration i gelpermeationskromatografi 20. Valget af afstand metriske beregning i den hierarkiske klyngedannelse vil påvirke formen af ​​klynger og dermed sammenhænge. Vi anbefaler, at eksperimentere med de forskellige målinger til at opnå den bedste pasform med eksisterende interaktion kendskab til protein eller kompleks af interesse. Generelt vi opnået de bedste resultater med Manhattan (L1) afstand metrisk 20. Pearson korrelation eller euklidiske afstand målinger er også blevet rapporteret til at identificere komplekser baseret på alternativ fraktioneringsteknikker 10, 11, 12. Quantive MS-data opnået fra de blå native fraktionerne kan også anvendes til at bestemme støkiometrien af ​​proteinkomplekser. Den iBAQ (intensitet baseret absolut kvantificering) værdi tilvejebringer et mål for relative forekomst af de identificerede proteiner 27, 28. De iBAQ værdier for protein komplekse medlemmer i alle fraktionerne inden en migration profil top er normaliseret til den for bait-proteinet til opnåelse af relative mængder. De normaliserede iBAQs tværs af en profil top for et givet protein kompleks element bør følge en horisontal tendens, og tendensen værdier afspejler støkiometrien af ​​de interagerende proteiner i forhold til bait-proteinet. For en mere detaljeret fremstilling af støkiometri beregninger, se 20. <img alt="figur 7" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig7.jpg" /> Figur 7: Skematisk arbejdsgang sammenfatter ABC-MS sTRATEGI. Dette tal er modificeret fra 20. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig7large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="figur 8" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig8.jpg" /> Figur 8. Hierarkisk klyngedannelse af BN-PAGE indvandringsprofiler for MTA2 interaktionskandidater. MTA2-associerede proteiner, blev grupperet baseret på ligheden i deres migrationsprofiler. Kun en delmængde af varmen-map indeholdende NuRD komplekset vises (indesluttet i det blå felt). Den gule boks fremhæver den stærke korrelation af Wdr5 med NuRD kompleks. De kommenterede molekylvægte blev estimeret fra migrationen afstande på proteinstandarder kører i samme gel. Denne forskning blev oprindeligt udgivet i molekylære og cellulære Proteomics 20 American Society for Biokemi og Mo<html> lecular Biology. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig8large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="figur 9" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig9.jpg" /> Figur 9. BN-PAGE migration profil NuRD underenheder og associerede proteiner. A) MTA2 og NuRD underenheder stede på et lignende intensitet mønster. B) MTA2 og NuRD underenheder med den inverse intensitetsmønster. C) MTA2 og Cdk2ap1, som kun er til stede i højere molekylvægt NuRD enhed. De kommenterede molekylvægte blev estimeret fra migration profil af proteinstandarder. Denne forskning blev oprindeligt udgivet i molekylære og cellulære Proteomics 20 American Society for Biokemi og Molekylær Biologi._blank &quot;&gt; Klik her for at se en større version af dette tal. <img alt="Supplerende fil" src="/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.jpg" /> Supplerende data: Prøve datasæt. MaxQuant-afledte proteingroups.txt fil, der indeholder protein-identifikationer og kvantificering værdier fra en ABC-MS eksperiment. Denne forskning blev oprindeligt udgivet i molekylære og cellulære Proteomics 20 American Society for Biokemi og Molekylær Biologi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.txt" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling at JoVE.com

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Vi præsenterer her protokoller for affinitetsoprensning af proteinkomplekser og deres separation ved blå nativ PAGE, efterfulgt af protein korrelation profilering ved anvendelse etiket fri kvantitativ massespektrometri. Denne metode er nyttig til at løse interactomes i distinkte proteinkomplekser.

Løsning affinitetsrensede proteinkomplekser ved Blå Native PAGE og protein Korrelation Profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture fra Cryomilled pattedyrsceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem affinitetsoprensning af proteinkomplekser fra eukaryote celler

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Multimer-PAGE: A Fremgangsmåde til registrering og Løsning proteinkomplekser i biologiske prøver

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Horisontal gelelektroforese til forbedret påvisning af protein-RNA-komplekser

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID — Proteom analyse af kontekst-specifik proteinkomplekser i deres Native cellulære miljø

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: et-trins affinitet rensning for den parallelle analyse af Protein-Protein og Protein-metabolit komplekser

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Analyse af tylakoid membran proteinkomplekser af blå indfødte gelelektroforese

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Affinitet rensning af grønkorn Translocon Protein komplekser ved hjælp af tryk på Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høj følsomhed måling af transskription faktor-DNA bindende tilhørsforhold ved konkurrencedygtige titrering med Fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse af proteinfoldning, Transport og nedbrydning i levende celler af radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...