Name: resolving affinity purified protein complexes by blue native page and protein correlation profiling
Uploaded: 2017-04-01T12:30:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling at JoVE.com

This work was funded by the Wellcome Trust (WT098051).

<ol>
	<li>Goudreault, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PP2A+phosphatase+high+density+interaction+network+identifies+a+novel+striatin-interacting+phosphatase+and+kinase+complex+linked+to+the+cerebral+cavernous+malformation+3+(CCM3)+protein.">A PP2A phosphatase high density interaction network identifies a novel striatin-interacting phosphatase and kinase complex linked to the cerebral cavernous malformation 3 (CCM3) protein.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (1), 157-171 (2009).</li><li>Leitner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+native+protein+structures+by+chemical+cross-linking,+mass+spectrometry,+and+bioinformatics.">Probing native protein structures by chemical cross-linking, mass spectrometry, and bioinformatics.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (8), 1634-1649 (2010).</li><li>Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginning+of+a+beautiful+friendship:+cross-linking/mass+spectrometry+and+modelling+of+proteins+and+multi-protein+complexes.">The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes.</a> J Struct Biol. 173 (3), 530-540 (2011).</li><li>Sinz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+cross-linking+and+mass+spectrometry+to+map+three-dimensional+protein+structures+and+protein-protein+interactions.">Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions.</a> Mass Spectrom Rev. 25 (4), 663-682 (2006).</li><li>Walzthoeni, T., Leitner, A., Stengel, F., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+supported+determination+of+protein+complex+structure.">Mass spectrometry supported determination of protein complex structure.</a> Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 252-260 (2013).</li><li>Kaake, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vivo+cross-linking+mass+spectrometry+platform+to+define+protein-protein+interactions+in+living+cells.">A new in vivo cross-linking mass spectrometry platform to define protein-protein interactions in living cells.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3533-3543 (2014).</li><li>Kao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+cross-linking+strategy+for+fast+and+accurate+identification+of+cross-linked+peptides+of+protein+complexes.">Development of a novel cross-linking strategy for fast and accurate identification of cross-linked peptides of protein complexes.</a> Mol Cell Proteomics. 10 (1), (2011).</li><li>Hughes, M. A., Langlais, C., Cain, K., MacFarlane, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterisation+and+reconstitution+of+cell+death+signalling+complexes.">Isolation, characterisation and reconstitution of cell death signalling complexes.</a> Methods. 61 (2), 98-104 (2013).</li><li>Lim, S., Zou, Y., Friedman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+activator+Mirk/Dyrk1B+is+sequestered+by+p38alpha/beta+MAP+kinase.">The transcriptional activator Mirk/Dyrk1B is sequestered by p38alpha/beta MAP kinase.</a> J Biol Chem. 277 (51), 49438-49445 (2002).</li><li>Havugimana, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+census+of+human+soluble+protein+complexes.">A census of human soluble protein complexes.</a> Cell. 150 (5), 1068-1081 (2012).</li><li>Kirkwood, K. J., Ahmad, Y., Larance, M., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+native+protein+complexes+and+protein+isoform+variation+using+size-fractionation-based+quantitative+proteomics.">Characterization of native protein complexes and protein isoform variation using size-fractionation-based quantitative proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3851-3873 (2013).</li><li>Kristensen, A. R., Gsponer, J., Foster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+approach+for+measuring+temporal+changes+in+the+interactome.">A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome.</a> Nat Methods. 9 (9), 907-909 (2012).</li><li>Liu, F., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+the+architecture+of+protein+assemblies+and+protein+interaction+networks+by+cross-linking+mass+spectrometry.">Interrogating the architecture of protein assemblies and protein interaction networks by cross-linking mass spectrometry.</a> Curr Opin Struct Biol. 35, 100-108 (2015).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions.">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li><li>Heide, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexome+profiling+identifies+TMEM126B+as+a+component+of+the+mitochondrial+complex+I+assembly+complex.">Complexome profiling identifies TMEM126B as a component of the mitochondrial complex I assembly complex.</a> Cell Metab. 16 (4), 538-549 (2012).</li><li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+953+human+proteins+from+a+mitochondrial+HEK293+fraction+by+complexome+profiling.">Analysis of 953 human proteins from a mitochondrial HEK293 fraction by complexome profiling.</a> PLoS One. 8 (7), 68340 (2013).</li><li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC-MS/MS+as+an+alternative+for+SDS-PAGE+in+blue+native+analysis+of+protein+complexes.">LC-MS/MS as an alternative for SDS-PAGE in blue native analysis of protein complexes.</a> Proteomics. 9 (17), 4221-4228 (2009).</li><li>Remmerie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+tobacco+BY-2+protein+complexes+with+BN+PAGE/LC-MS/MS+and+clustering+methods.">Unraveling tobacco BY-2 protein complexes with BN PAGE/LC-MS/MS and clustering methods.</a> J Proteomics. 74 (8), 1201-1217 (2011).</li><li>Sessler, N., Krug, K., Nordheim, A., Mordmuller, B., Macek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Plasmodium+falciparum+proteasome+using+Blue+Native+PAGE+and+label-free+quantitative+mass+spectrometry.">Analysis of the Plasmodium falciparum proteasome using Blue Native PAGE and label-free quantitative mass spectrometry.</a> Amino Acids. 43 (3), 1119-1129 (2012).</li><li>Bode, D., Yu, L., Tate, P., Pardo, M., Choudhary, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Two+Distinct+Nucleosome+Remodeling+and+Deacetylase+(NuRD)+Complex+Assemblies+in+Embryonic+Stem+Cells.">Characterization of Two Distinct Nucleosome Remodeling and Deacetylase (NuRD) Complex Assemblies in Embryonic Stem Cells.</a> Mol Cell Proteomics. 15 (3), 878-891 (2016).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+the+MaxQuant+computational+platform+for+SILAC-based+quantitative+proteomics.">A practical guide to the MaxQuant computational platform for SILAC-based quantitative proteomics.</a> Nat Protoc. 4 (5), 698-705 (2009).</li><li>Kim, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+regulatory+factor+recruits+the+nucleosome+remodeling+complex+to+wingless+integrated+(Wnt)+signaling+gene+promoters+in+mouse+embryonic+stem+cells.">A novel regulatory factor recruits the nucleosome remodeling complex to wingless integrated (Wnt) signaling gene promoters in mouse embryonic stem cells.</a> J Biol Chem. 287 (49), 41103-41117 (2012).</li><li>Lauberth, S. M., Rauchman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+12-amino+acid+motif+in+Sall1+recruits+the+nucleosome+remodeling+and+deacetylase+corepressor+complex.">A conserved 12-amino acid motif in Sall1 recruits the nucleosome remodeling and deacetylase corepressor complex.</a> J Biol Chem. 281 (33), 23922-23931 (2006).</li><li>Miller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sall4+controls+differentiation+of+pluripotent+cells+independently+of+the+Nucleosome+Remodelling+and+Deacetylation+(NuRD)+complex.">Sall4 controls differentiation of pluripotent cells independently of the Nucleosome Remodelling and Deacetylation (NuRD) complex.</a> Development. 143 (17), 3074-3084 (2016).</li><li>Dharmarajan, V., Lee, J. H., Patel, A., Skalnik, D. G., Cosgrove, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+WDR5+interaction+(Win)+motif+recognition+in+human+SET1+family+histone+methyltransferases.">Structural basis for WDR5 interaction (Win) motif recognition in human SET1 family histone methyltransferases.</a> J Biol Chem. 287 (33), 27275-27289 (2012).</li><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Smits, A. H., Jansen, P. W., Poser, I., Hyman, A. A., Vermeulen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+chromatin-associated+protein+complexes+revealed+by+label-free+quantitative+mass+spectrometry-based+proteomics.">Stoichiometry of chromatin-associated protein complexes revealed by label-free quantitative mass spectrometry-based proteomics.</a> Nucleic Acids Res. 41 (1), 28 (2013).</li><li>Lambert, J. P., Tucholska, M., Pawson, T., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+DNA+shearing+in+standard+affinity+purification+allows+simultaneous+identification+of+both+soluble+and+chromatin-bound+interaction+partners.">Incorporating DNA shearing in standard affinity purification allows simultaneous identification of both soluble and chromatin-bound interaction partners.</a> J Proteomics. 100, 55-59 (2014).</li><li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+PAGE.">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li><li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li><li>Schagger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li><li>Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B., Aebersold, R., Steimle, V., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+Blue+native/SDS+gel+electrophoresis+of+multi-protein+complexes+from+whole+cellular+lysates:+a+proteomics+approach.">Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).</li><li>Liu, F., Rijkers, D. T., Post, H., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+profiling+of+protein+assemblies+by+cross-linking+mass+spectrometry.">Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross-linking mass spectrometry.</a> Nat Methods. 12 (12), 1179-1184 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Hier beschrijven we het gebruik van affiniteitszuivering gevolgd door blauwe natieve gelelektroforese in combinatie met kwantitatieve massaspectrometrie eiwitcomplexen lossen. Deze aanpak biedt een methode om eendimensionale eiwit interactie lijsten te ontrafelen in functionele verzamelingen van eiwitten. We tonen de methode gebaseerd op het gebruik van epitoop-gemerkte eiwitten. Echter, als een cellijn die een gecodeerde eiwit niet beschikbaar is, kan een alternatief zijn om antilichamen te gebruiken tegen het eiwit van belang, op voorwaarde dat er een peptide beschikbaar voor inheemse concurrerende elutie bereiken. De hoeveelheid uitgangsmateriaal en de hoeveelheid korrels zouden moeten worden aangepast afhankelijk van het expressieniveau van het doeleiwit. Wij doorgaans voeren dit protocol met 2-5 x 10 8 cellen uitgangsmateriaal, en dit is zelfs voldoende voor eiwitten met laag expressieniveau. De lysisbuffer samenstelling dient empirisch worden gekozen verwezenlijkenin de buurt van oplosbaar maken van het aas te voltooien. Dit kan een uitdaging voor sommige soorten van eiwitten, in het bijzonder chromatine binden of membraaneiwitten. Alternatieven omvatten het verhogen van de hoeveelheid zout, mits het eiwitcomplex onderzochte stabiel in hoog zoutgehalte, of via sonificatie en / of nuclease behandeling van chromatine bindende eiwitten 20, 29. Bij membraaneiwitten, schakelen detergens DDM of digitonine kan wenselijk 30 zijn. In het geval van DNA-bindende eiwitten is het nuttig om een nuclease zoals Benzonase tijdens de zuiveringsstap 20 omvatten. Volledige verwijdering van nucleïnezuren garandeert dat de waargenomen wisselwerkingen plaatsvinden tussen eiwitten en niet gemedieerd door DNA. Een cruciaal element om te overwegen bij het gebruik van deze aanpak is de stabiliteit van het complex in onderzoek. De procedure is lang en kan preservin betrekkeng het eiwitcomplex een nacht. We hebben goede succes met twee chromatine remodeling complexen (D. Bode en M. Pardo, gegevens niet getoond) bereikt, maar dit moet worden geëvalueerd. De affiniteit zuiveringsstap kan worden verkort indien nodig. Alternatieve technieken die natief fractionering mogelijk, zoals grootte-uitsluitingschromatografie, zijn op grote schaal gebruikt voor meer dan 50 jaar eiwitcomplexen karakteriseren. Wij en anderen hebben aangetoond dat de resolutie van de blauwe inheemse PAGE is superieur aan die bereikt met behulp van grootte-uitsluitingschromatografie 20, 31, 32, 33. Een ander voordeel van de blauwe inheemse PAGE is dat het niet-chromatografie-systemen, die duur zijn vereist, maar maakt gebruik van eiwit elektroforese apparatuur die is wijdverbreid in laboratoria. In termen van hands-on tijd, deze methode niet meer werk dan de traditionele geLC-MS / MS een betrekkenAANPAK of offline chromatografische fractionering. Echter, zoals de meeste fractionering technieken te doen, het heeft een limiet aan de oplossing ervan. Complexen die zeer homogene of dicht in de massa en vorm kan zijn dan de resolutie die door de blauwe inheemse PAGE, en dus het protocol zoals hier gemeld misschien niet universeel succesvol in het oplossen van verschillende complexen met gedeelde subeenheden zijn. Bemoedigend, hebben we succesvol geweest in het scheiden van twee zeer vergelijkbare tetramere complexen delen drie subeenheden (M. Pardo, manuscript in voorbereiding). Aangezien massaspectrometrie steeds gevoeliger is geworden, kunnen zelfs zeer kleine hoeveelheden niet-specifieke interactors en verontreinigingen worden gedetecteerd in AP-MS monsters. De hier gepresenteerde benadering kan helpen bij het onderscheiden van echte interactoren van achtergrond vervuiling in de affiniteitszuivering door richten van de aandacht op eiwitten met migratie pieken die overeenkomen met aas migratie pieken bij hogere molecuulgewicht dan die vande monomere eiwitten. Verschillende groepen hebben fractionatietechnieken gevolgd door proteïne correlatie profilering eiwitcomplexen op celniveau bakenen zonder de noodzaak van voorafgaande isolatie 10, 11, 12, 34 toegepast. Echter, dit kan resulteren in het niet sub-stoichiometrische interacties te detecteren. Het opnemen van een verrijking voor stap door affiniteit zuivering kan helpen om dit te overwinnen. De hier beschreven benadering zou in het algemeen bruikbaar voor het verkennen van de topologie van eiwitcomplexen en het ontrafelen van de meervoudige complexen een bepaald proteïne deelneemt aan binnen dezelfde cellulaire context. De strategie is eenvoudig en vatbaar voor laboratoria die niet kunnen hebben dure chromatografische fractionering apparatuur om eiwitcomplexen te lossen.

In cellen, meeste eiwitten hun functies door middel van tijdelijke eiwit-eiwitinteracties of door vorming van stabiele verzamelingen van eiwitten. Het karakteriseren van eiwit interacties is van cruciaal belang voor een volledig begrip cellulaire processen. Affiniteitszuivering in combinatie met massaspectrometrie (AP-MS) is een van de meest toegepaste strategieën voor natief eiwit interacties te identificeren. Significante verbeteringen in het instrument mogelijkheden bereikt in de afgelopen tien jaar hebben deze aanpak zeer krachtig gemaakt. Het is belangrijk op te merken dat de interacties die door AP-MS experimenten omvatten een mengsel van directe en indirecte verbindingen tussen aas en prooi. Bovendien vaak eiwitten nemen deel aan verschillende complexen binnen dezelfde cellulaire context, waarin verschillende biologische rollen kunnen hebben, en dus de interactoren die worden geïdentificeerd door AP-MS kan een combinatie van afzonderlijke verzamelingen van eiwitten of functionele entiteiten vertegenwoordigen. Het is niet mogelijk te leidendergelijke topologische informatie voorbaat van het mono-dimensionale lijsten van eiwitten die door eenvoudige AP-MS experimenten. Echter de techniek verder worden benut om de architectuur van eiwitcomplexen definiëren door het te combineren met één of meer methoden om deze samenstellingen te lossen. Om de topologie van eiwitinteracties geïdentificeerd door middel van AP-MS lossen zijn verschillende strategieën toegepast. Een benadering is om iteratief AP-MS experimenten met de prooien die in een voorgaande ronde van experimenten 1 lokaas voeren. Hoewel zeer informatief, dit is een heel arbeidsintensieve taak experimenteel en analytisch. Eiwit verknoping in combinatie met massaspectrometrie wordt steeds vaker gebruikt om topologische gegevens over eiwitcomplexen 2, 3, 4, 5 af te leiden. Echter, computational analyse van verknoopte peptiden nog steeds een uitdaging en is de bottleneck in de workflow vandaar. De komst van MS-afsplitsbare verknopende reagentia moeten in kaart brengen van de aminozuurresten die in de nabijheid van interagerende eiwitten 6, 7 te vergemakkelijken. Een ander alternatief is om affiniteitszuivering te combineren indien orthogonale scheidingstechnieken 8, 9. Chromatografische fractionering door gelfiltratie of ionuitwisseling of sucrosegradiënt fractionering zijn recent ook gebruikt in combinatie met kwantitatieve massaspectrometrie multiproteïnecomplexen beschrijven op systeemniveau-niveau, het omzeilen van het complex isolatiestap 10, 11, 12, 13. Blauw natieve polyacrylamidegelelektroforese (BN-PAGE) is op grote schaal toegepastonderzoeken natief eiwit interacties, kenmerkend die waarbij mitochondriale membraan eiwitcomplexen 14. Deze scheidingstechniek is onlangs ook gebruikt in combinatie met labelvrije eiwit kwantificering en correlatie profilering, niet alleen op de mitochondriale complexen 15, 16, 17, maar ook voor het ontrafelen andere proteïnecomplexen uit gehele cellen 18, 19. Onze hypothese was dat de combinatie van affiniteitszuivering met aansluitende fractionering natieve benaderingen en kwantitatieve MS een bruikbare strategie voor het oplossen van meerdere verzamelingen van eiwitten die een bepaald eiwit moet bieden. Hier beschrijven we een werkwijze die algemeen epitoop gebaseerde affiniteitszuivering met blauwe natieve polyacrylamide gel elektroforese van de geïsoleerde complexen gecombineerd, gevolgd door kwantitatieve massa spectrometry en eiwit correlatie profilering, de meerdere vergaderingen een eiwit zou kunnen worden betrokken bij het op te lossen. We maken gebruik van embryonale stamcellen van muizen waarbij een eiwit van belang gefuseerd aan een epitooplabel wordt uitgedrukt van de endogene locus in de buurt van fysiologische overvloed te bereiken en te zorgen voor een efficiënte inheemse complex isolement. Deze benadering ontrafelt de meervoudige interacties een eiwit grijpt in, het oplossen van hen in verschillende samenstellingen op basis van hun correlatie profielen, terwijl die niet werken dan conventionele geLC MS-20.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1384">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Protein G Dynabeads</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">10003D</td>
			<td style="width:452px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">FLAG antibody M2</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">F1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Tween-20, protein grade, 10% solution</td>
			<td style="width:285px;">Millipore</td>
			<td style="width:220px;">655206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Dimethyl pimelimidate</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">80490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">0.2 M Triethanolamine buffer, pH 8.2</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">T0449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">3x FLAG peptide</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">F4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Vivaspin 5K NMWCO, PES</td>
			<td style="width:285px;">Sartorius</td>
			<td style="width:220px;">VS0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">NativePAGE 3-12% Bis-Tris gel</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">20x NativePAGE Running Buffer</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">20x NativePAGE Cathode Additive</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">4x NativePAGE sample loading buffer</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">NativeMARK</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">LC0725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NativePAGE 5% G-250 sample additive&#160;</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Nunc conical bottom 96-well plate, polypropylene</td>
			<td style="width:285px;">Thermo</td>
			<td style="width:220px;">249944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Multiscreen HTS 96-well filtration system</td>
			<td style="width:285px;">Thermo</td>
			<td style="width:220px;">MSDVN6550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Nunc 96-well cap natural</td>
			<td style="width:285px;">Thermo</td>
			<td style="width:220px;">276002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride)</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Acetonitrile, HPLC grade</td>
			<td style="width:285px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">A/0627/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Trypsin, sequencing grade</td>
			<td style="width:285px;">Roche</td>
			<td style="width:220px;">11418475001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Software</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">MaxQuant (software)</td>
			<td style="width:285px;">N.A.</td>
			<td style="width:220px;">N.A.</td>
			<td style="width:452px;">http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Perseus (software)</td>
			<td style="width:285px;">N.A.</td>
			<td style="width:220px;">N.A.</td>
			<td style="width:452px;">http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

resolving affinity purified protein complexes by blue native page and protein correlation profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

De werkstroom van de affiniteitszuivering Blue profilering natieve eiwit Correlatie van Mass Spectrometry (ABC-MS) strategie is afgebeeld in figuur 7. Natief eiwitcomplexen om een ​​eiwit van interesse worden geïsoleerd door affiniteitszuivering met gebruikmaking van antilichamen tegen een epitoop-tag (hier FLAG) en competitieve elutie. De complexen worden gescheiden door BN-PAGE, en de gehele gel baan is gesneden in secties 48 en voorbereid voor jachtgeweer LC-MS / MS. MS kwantitatieve informatie wordt gebruikt om een ​​profiel migratie voor elk geïdentificeerd eiwit in de natieve blauwe scheiding genereren. Eiwitten die interageren met een afzonderlijke complexe weergave vergelijkbaar migratieprofielen met elkaar tot pieken. Wanneer een eiwit van belang deelneemt aan meer dan één samenstel worden meerdere pieken waargenomen bij de migratieprofiel Gezien de sub-complexen zijn in het oplossend vermogen van de blauwe natieve gel. Een systematische vergelijking van de migrantsoen profielen kunnen worden verkregen door proteïne correlatie profilering middels hiërarchische clustering. Het dendrogram en piekintensiteiten van alle fracties worden gevisualiseerd in een warmte-kaart, het vergemakkelijken van de identificatie van interagerende eiwitten die tot afzonderlijke eiwitcomplexen (figuur 8). We gebruikten deze strategie om de interactie partners van MTA2, een kern subunit van het NuRD chromatine remodeling complex 20 te analyseren. Zoals getoond in figuur 9, de migratieprofiel van MTA2 weergegeven twee pieken afzonderlijke intensiteiten tussen 700 kDa en 1,2 MDa, waarbij de onderste massapiek tonen hogere overvloed. Andere NuRD kern subeenheden, waaronder MTA1 / 3, HDAC1 / 2 en Mbd3, vertoonde dezelfde scheidingspatroon, ondanks de pieken voor enkele van de subeenheden, namelijk Chd4, Gatad2a / b en Rbbp4 / 7, had de inverse abundantie verdeling (figuur 9A, B). Daarentegen het profiel van Cdk2ap1, een regulerende factor die de NuRD complex Wnt genpromoters 23 recruteert alleen getoonde grotere massa piek (figuur 9C), en dus Sall4, een transcriptionele repressor die ook is aangetoond dat NuRD 20, 24, 25 binden. Aldus fractionering van affiniteitsgezuiverde MTA2-geassocieerde eiwitten door blauwe natieve PAGE kon twee vormen van het complex NuRD lossen. ABC-MS maakt ook de identificatie van nieuwe interactoren terwijl ze toe te wijzen aan specifieke eiwit entiteiten. Door onderzoek van de eiwitten clusters en fractie intensiteiten vertegenwoordigd in een warmte-kaart gedetecteerd we een sterke correlatie tussen NuRD subeenheden en Wdr5, een regulerende subunit van het MLL methyltransferase complex 26, met Wdr5 weergeven van twee migratie pieken samenvallen met de twee NuRD peaks (figuur 8), suggereert een interactie van de Wdr5 en NuRD. We bevestigden deze interactie met co-immunoprecipitatie en co-migratie in grootte-uitsluitingschromatografie 20. De keuze van afstandmetriek berekening in de hiërarchische clustering zal de vorm van de clusters en dus de correlaties beïnvloeden. We raden u aan te experimenteren met de verschillende statistieken om de beste pasvorm met de bestaande interactie kennis van het eiwit of complex van belang te bereiken. Over het algemeen behaalden we de beste resultaten met de Manhattan (L1) afstand metrische 20. Pearson correlatie of Euclidische afstand metrieken zijn ook beschreven voor het identificeren van complexen op basis van alternatieve fractioneringstechnieken 10, 11, 12. de QuanMS titatieve gegevens uit de blauwe natieve fracties kunnen ook worden gebruikt om de stoichiometrie van eiwitcomplexen bepalen. De iBAQ (intensiteit gebaseerd absolute kwantificatie) -waarde geeft een maat van de relatieve abundantie van de geïdentificeerde eiwitten 27, 28. De iBAQ waarden voor het eiwitcomplex leden van alle fracties binnen migratieprofiel piek genormaliseerd aan die van de aasproteïne om relatieve hoeveelheden te verkrijgen. De genormaliseerde iBAQs over een profiel piek voor een bepaald eiwitcomplex lid moeten horizontale trend te volgen, en de trend waarden weerspiegelen de stoichiometrie van de interacterende eiwitten ten opzichte van het aas eiwit. Voor een meer gedetailleerde weergave van stoichiometrie berekeningen, zie 20. <img alt="figuur 7" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig7.jpg" /> Figuur 7: Schematische samenvatting van de workflow ABC-MS strategie. Dit cijfer wordt gewijzigd van 20. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 8" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig8.jpg" /> Figuur 8 hiërarchische clustering van BN-PAGE migratieprofielen MTA2 interactoren. MTA2-geassocieerde eiwitten werden geclusterd op basis van de gelijkenis van hun migratieprofielen. Slechts een deel van de warmte-map van de NuRD complex weergegeven (tussen het blauwe vak). De gele vakje wijst op de sterke correlatie van Wdr5 met de NuRD complex. De geannoteerde molecuulgewichten werden bepaald door migratie afstand van eiwitstandaarden draaien in dezelfde gel. Dit onderzoek werd oorspronkelijk gepubliceerd in Molecular and Cellular Proteomics 20 van de Amerikaanse Vereniging voor Biochemie en Mo<html> lecular Biology. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="figuur 9" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig9.jpg" /> Figuur 9. BN-PAGE migratieprofiel van NuRD subeenheden en geassocieerde eiwitten. A) MTA2 en NuRD subeenheden aanwezig intensiteiten gelijk patroon. B) MTA2 en NuRD subeenheden met de inverse intensiteitspatroon. C) MTA2 en Cdk2ap1, die slechts aanwezig is in de hogere molecuulgewicht NuRD entiteit. De geannoteerde molecuulgewichten werden geschat op basis van de migratie-profiel van het eiwit normen. Dit onderzoek werd oorspronkelijk gepubliceerd in Molecular and Cellular Proteomics 20 van de Amerikaanse Vereniging voor Biochemie en Moleculaire Biologie._blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken. <img alt="aanvullende File" src="/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.jpg" /> Aanvullende gegevens: Sample dataset. MaxQuant afgeleide proteingroups.txt bestand met eiwitidentificaties en kwantificering waarden uit een ABC-MS experiment. Dit onderzoek werd oorspronkelijk gepubliceerd in Molecular and Cellular Proteomics 20 van de Amerikaanse Vereniging voor Biochemie en Moleculaire Biologie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.txt" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling at JoVE.com

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Hier presenteren we protocollen voor affiniteitszuivering van eiwitcomplexen en hun scheiding door blauwe natieve PAGE, gevolgd door proteïne correlatie profilering middels label vrije kwantitatieve massaspectrometrie. Deze methode is nuttig voor interactomen in verschillende proteïnecomplexen lossen.

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Eiwitcomplex Affiniteit Capture uit Cryomilled zoogdiercellen

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem affiniteitszuivering van eiwitcomplexen van eukaryote cellen

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Multimeer-PAGE: Een methode voor het vastleggen en oplossen eiwitcomplexen Biological Samples

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Horizontale Gel Electroforese voor Verbeterde Detectie van Proteïne-RNA Complexen

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID — Proteoom analyse van Context-specifieke eiwitcomplexen in hun inheemse cellulaire omgeving

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: stap zuivering van de affiniteit voor de parallelle analyse van eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet complexen

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Analyse van eiwitcomplexen thylakoïde membraan door blauwe inheemse gelelektroforese

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Affiniteit zuivering van Chloroplast Translocon eiwitcomplexen met behulp van de Tag van de TAP

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hoge gevoeligheid meten van transcriptie Factor-DNA-bindende affiniteiten concurrerende getitreerd wordt met behulp van fluorescentie microscopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse van de vouwing van eiwitten, vervoer en afbraak in levende cellen door radioactieve Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...