Name: resolving affinity purified protein complexes by blue native page and protein correlation profiling
Uploaded: 2017-04-01T12:30:00
Duration: 9 min 35 s
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This work was funded by the Wellcome Trust (WT098051).

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	<li>Goudreault, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PP2A+phosphatase+high+density+interaction+network+identifies+a+novel+striatin-interacting+phosphatase+and+kinase+complex+linked+to+the+cerebral+cavernous+malformation+3+(CCM3)+protein.">A PP2A phosphatase high density interaction network identifies a novel striatin-interacting phosphatase and kinase complex linked to the cerebral cavernous malformation 3 (CCM3) protein.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (1), 157-171 (2009).</li><li>Leitner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+native+protein+structures+by+chemical+cross-linking,+mass+spectrometry,+and+bioinformatics.">Probing native protein structures by chemical cross-linking, mass spectrometry, and bioinformatics.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (8), 1634-1649 (2010).</li><li>Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginning+of+a+beautiful+friendship:+cross-linking/mass+spectrometry+and+modelling+of+proteins+and+multi-protein+complexes.">The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes.</a> J Struct Biol. 173 (3), 530-540 (2011).</li><li>Sinz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+cross-linking+and+mass+spectrometry+to+map+three-dimensional+protein+structures+and+protein-protein+interactions.">Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions.</a> Mass Spectrom Rev. 25 (4), 663-682 (2006).</li><li>Walzthoeni, T., Leitner, A., Stengel, F., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+supported+determination+of+protein+complex+structure.">Mass spectrometry supported determination of protein complex structure.</a> Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 252-260 (2013).</li><li>Kaake, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vivo+cross-linking+mass+spectrometry+platform+to+define+protein-protein+interactions+in+living+cells.">A new in vivo cross-linking mass spectrometry platform to define protein-protein interactions in living cells.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3533-3543 (2014).</li><li>Kao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+cross-linking+strategy+for+fast+and+accurate+identification+of+cross-linked+peptides+of+protein+complexes.">Development of a novel cross-linking strategy for fast and accurate identification of cross-linked peptides of protein complexes.</a> Mol Cell Proteomics. 10 (1), (2011).</li><li>Hughes, M. A., Langlais, C., Cain, K., MacFarlane, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterisation+and+reconstitution+of+cell+death+signalling+complexes.">Isolation, characterisation and reconstitution of cell death signalling complexes.</a> Methods. 61 (2), 98-104 (2013).</li><li>Lim, S., Zou, Y., Friedman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+activator+Mirk/Dyrk1B+is+sequestered+by+p38alpha/beta+MAP+kinase.">The transcriptional activator Mirk/Dyrk1B is sequestered by p38alpha/beta MAP kinase.</a> J Biol Chem. 277 (51), 49438-49445 (2002).</li><li>Havugimana, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+census+of+human+soluble+protein+complexes.">A census of human soluble protein complexes.</a> Cell. 150 (5), 1068-1081 (2012).</li><li>Kirkwood, K. J., Ahmad, Y., Larance, M., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+native+protein+complexes+and+protein+isoform+variation+using+size-fractionation-based+quantitative+proteomics.">Characterization of native protein complexes and protein isoform variation using size-fractionation-based quantitative proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3851-3873 (2013).</li><li>Kristensen, A. R., Gsponer, J., Foster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+approach+for+measuring+temporal+changes+in+the+interactome.">A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome.</a> Nat Methods. 9 (9), 907-909 (2012).</li><li>Liu, F., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+the+architecture+of+protein+assemblies+and+protein+interaction+networks+by+cross-linking+mass+spectrometry.">Interrogating the architecture of protein assemblies and protein interaction networks by cross-linking mass spectrometry.</a> Curr Opin Struct Biol. 35, 100-108 (2015).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions.">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li><li>Heide, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexome+profiling+identifies+TMEM126B+as+a+component+of+the+mitochondrial+complex+I+assembly+complex.">Complexome profiling identifies TMEM126B as a component of the mitochondrial complex I assembly complex.</a> Cell Metab. 16 (4), 538-549 (2012).</li><li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+953+human+proteins+from+a+mitochondrial+HEK293+fraction+by+complexome+profiling.">Analysis of 953 human proteins from a mitochondrial HEK293 fraction by complexome profiling.</a> PLoS One. 8 (7), 68340 (2013).</li><li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC-MS/MS+as+an+alternative+for+SDS-PAGE+in+blue+native+analysis+of+protein+complexes.">LC-MS/MS as an alternative for SDS-PAGE in blue native analysis of protein complexes.</a> Proteomics. 9 (17), 4221-4228 (2009).</li><li>Remmerie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+tobacco+BY-2+protein+complexes+with+BN+PAGE/LC-MS/MS+and+clustering+methods.">Unraveling tobacco BY-2 protein complexes with BN PAGE/LC-MS/MS and clustering methods.</a> J Proteomics. 74 (8), 1201-1217 (2011).</li><li>Sessler, N., Krug, K., Nordheim, A., Mordmuller, B., Macek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Plasmodium+falciparum+proteasome+using+Blue+Native+PAGE+and+label-free+quantitative+mass+spectrometry.">Analysis of the Plasmodium falciparum proteasome using Blue Native PAGE and label-free quantitative mass spectrometry.</a> Amino Acids. 43 (3), 1119-1129 (2012).</li><li>Bode, D., Yu, L., Tate, P., Pardo, M., Choudhary, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Two+Distinct+Nucleosome+Remodeling+and+Deacetylase+(NuRD)+Complex+Assemblies+in+Embryonic+Stem+Cells.">Characterization of Two Distinct Nucleosome Remodeling and Deacetylase (NuRD) Complex Assemblies in Embryonic Stem Cells.</a> Mol Cell Proteomics. 15 (3), 878-891 (2016).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+the+MaxQuant+computational+platform+for+SILAC-based+quantitative+proteomics.">A practical guide to the MaxQuant computational platform for SILAC-based quantitative proteomics.</a> Nat Protoc. 4 (5), 698-705 (2009).</li><li>Kim, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+regulatory+factor+recruits+the+nucleosome+remodeling+complex+to+wingless+integrated+(Wnt)+signaling+gene+promoters+in+mouse+embryonic+stem+cells.">A novel regulatory factor recruits the nucleosome remodeling complex to wingless integrated (Wnt) signaling gene promoters in mouse embryonic stem cells.</a> J Biol Chem. 287 (49), 41103-41117 (2012).</li><li>Lauberth, S. M., Rauchman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+12-amino+acid+motif+in+Sall1+recruits+the+nucleosome+remodeling+and+deacetylase+corepressor+complex.">A conserved 12-amino acid motif in Sall1 recruits the nucleosome remodeling and deacetylase corepressor complex.</a> J Biol Chem. 281 (33), 23922-23931 (2006).</li><li>Miller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sall4+controls+differentiation+of+pluripotent+cells+independently+of+the+Nucleosome+Remodelling+and+Deacetylation+(NuRD)+complex.">Sall4 controls differentiation of pluripotent cells independently of the Nucleosome Remodelling and Deacetylation (NuRD) complex.</a> Development. 143 (17), 3074-3084 (2016).</li><li>Dharmarajan, V., Lee, J. H., Patel, A., Skalnik, D. G., Cosgrove, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+WDR5+interaction+(Win)+motif+recognition+in+human+SET1+family+histone+methyltransferases.">Structural basis for WDR5 interaction (Win) motif recognition in human SET1 family histone methyltransferases.</a> J Biol Chem. 287 (33), 27275-27289 (2012).</li><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Smits, A. H., Jansen, P. W., Poser, I., Hyman, A. A., Vermeulen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+chromatin-associated+protein+complexes+revealed+by+label-free+quantitative+mass+spectrometry-based+proteomics.">Stoichiometry of chromatin-associated protein complexes revealed by label-free quantitative mass spectrometry-based proteomics.</a> Nucleic Acids Res. 41 (1), 28 (2013).</li><li>Lambert, J. P., Tucholska, M., Pawson, T., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+DNA+shearing+in+standard+affinity+purification+allows+simultaneous+identification+of+both+soluble+and+chromatin-bound+interaction+partners.">Incorporating DNA shearing in standard affinity purification allows simultaneous identification of both soluble and chromatin-bound interaction partners.</a> J Proteomics. 100, 55-59 (2014).</li><li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+PAGE.">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li><li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li><li>Schagger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li><li>Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B., Aebersold, R., Steimle, V., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+Blue+native/SDS+gel+electrophoresis+of+multi-protein+complexes+from+whole+cellular+lysates:+a+proteomics+approach.">Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).</li><li>Liu, F., Rijkers, D. T., Post, H., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+profiling+of+protein+assemblies+by+cross-linking+mass+spectrometry.">Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross-linking mass spectrometry.</a> Nat Methods. 12 (12), 1179-1184 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Hier beschreiben wir die Verwendung von Affinitätsreinigung gefolgt von blau native Gelelektrophorese in Kombination mit quantitativen Massenspektrometrie Proteinkomplexe aufzulösen. Dieser Ansatz bietet eine Methode eindimensional Protein-Wechselwirkung Listen in funktionelle Proteinkomplexe zu entwirren. Wir zeigen das Verfahren basiert auf der Verwendung von Epitop-markierten Proteinen. Wenn jedoch eine Zelllinie ein markiertes Protein exprimieren, nicht verfügbar ist, könnte eine Alternative sein, Antikörper gegen das Protein von Interesse zu verwenden, sofern ein Peptid zur Verfügung nativen kompetitive Elution zu erreichen. Die Menge des Ausgangsmaterials und der Menge der Perlen kann in Abhängigkeit von dem Expressionsspiegel des Zielproteins werden müssen modifiziert. Wir führen in der Regel dieses Protokoll mit 2-5 x 10 8 Zellen - Ausgangsmaterial, und dies ist ausreichend , um auch die für Proteine mit niedrigem Expressionsniveau. Die Lysepuffer Zusammensetzung sollte empirisch gewählt werden, um zu erreichen,in der Nähe von vollständiger Auflösung des Köders. Dies kann für einige Arten von Proteinen, insbesondere Chromatin-Bindung oder Membranproteine ​​schwierig sein. Alternative Optionen gehören die Erhöhung die Menge an Salz, vorausgesetzt , daß der Proteinkomplex in Untersuchung in hohem Salz stabil ist, oder unter Verwendung von Ultraschall - Behandlung und / oder Nuklease - Behandlung für Chromatin - Bindungsproteine 20, 29. Im Falle von Membranproteinen, können Waschmittel DDM oder Digitonin Schalt 30 sinnvoll sein. Im Fall von DNA - Bindungsproteinen, ist es sinnvoll , eine Nuklease Benzonase wie während der Reinigungsstufe 20 umfasst. Die vollständige Entfernung von Nukleinsäuren gewährleistet, dass die detektierten Wechselwirkungen zwischen Proteinen auftreten und nicht durch DNA vermittelt. Ein kritisches Element zu berücksichtigen, wenn mit diesem Ansatz die Stabilität des Komplexes untersucht wird. Das Verfahren ist lang und preservin beinhalten kanng der Proteinkomplex über Nacht. Wir haben gute Erfolge mit zwei Chromatin-Remodeling-Komplexe (D. Bode und M. Pardo, Daten nicht gezeigt) erreicht, aber dies ausgewertet werden soll. Der Affinitätsreinigungsschritt kann bei Bedarf gekürzt werden. Alternative Techniken, die native Fraktionierung ermöglichen, wie Grßenausschlußchromatographie, sind seit mehr als 50 Jahren zu charakterisieren Proteinkomplexe weit verbreitet. Wir und andere haben gezeigt , dass die Auflösung der blauen native PAGE auf , dass 20, 31, 32, 33 unter Verwendung von Grßenausschlußchromatographie erreicht überlegen ist. Ein weiterer Vorteil der blauen native PAGE ist, dass es nicht Chromatographie-Systeme erfordert, die teuer sind, sondern nutzt Protein elektrophoretische Geräte, die in Laboratorien weit verbreitet ist. In Bezug auf die Hands-on-Zeit, diese Methode beinhaltet nicht mehr Arbeit als die traditionelle GELC-MS / MS einNSATZ oder offline chromatographische Fraktionierung. Da jedoch die meisten Fraktionierungsverfahren tun, hat es eine Grenze für ihre Auflösung. Komplexe, die sehr homogen oder in der Nähe in Masse und Form sind, können über die Auflösung von blau native PAGE angeboten werden, und somit das Protokoll wie hier berichtete nicht sein könnte allgemein erfolgreich bei der Lösung verschiedene Komplexe mit gemeinsamen Untereinheiten. Erfreulicherweise haben wir bei der Trennung von zwei sehr ähnliche tetramere Komplexe teilen drei Untereinheiten (M. Pardo, Manuskript in Vorbereitung) erfolgreich. Da Massenspektrometrie zunehmend empfindlich geworden ist, auch kleinste Mengen an unspezifischer Interaktoren und Verunreinigungen können in AP-MS Proben nachgewiesen werden. Der hier vorgestellte Ansatz könnte bei der Unterscheidung von echten Interaktionspartner von Hintergrundbelastung in der Affinitätsreinigung helfen, indem die Aufmerksamkeit auf Proteine ​​mit Migrationsspitzen zu konzentrieren, die als bei höheren Molekulargewicht mit Ködern Migration Spitzen zusammenfallen, dass diedie monomeren Proteine. Mehrere Gruppen haben Fraktionierungstechniken durch Protein - Korrelationsprofilierungs gefolgt verwendet , um Protein - Komplexe auf Zell Maßstab ohne die Notwendigkeit einer vorherigen Isolierung 10, 11, 12, 34 abzugrenzen. Dies kann jedoch dazu führen, substöchiometrischen Wechselwirkungen zu erkennen. Der Einbau eines Anreicherungsschritt durch Affinitätsreinigung kann helfen, diese zu überwinden. Der hier beschriebene Ansatz sollte für die Erkundung der Topologie von Proteinkomplexen und Entschlüsselung der mehrere Komplexe ein bestimmtes Protein an innerhalb der gleichen zellulären Kontext dauert in der Regel nützlich sein. Die Strategie ist einfach und zugänglich für Laboratorien, die nicht teuer chromatographische Fraktionierung Ausrüstung können Proteinkomplexe zu lösen.

In Zellen, führen die meisten Proteine ​​ihre Funktionen durch transitorische Protein-Protein-Wechselwirkungen oder durch stabile Proteinanordnungen bilden. Protein-Wechselwirkungen charakterisierenden ist für voll Verständnis zellulärer Prozesse von entscheidender Bedeutung. Affinitätsreinigung in Kombination mit der Massenspektrometrie (AP-MS) ist eine der am häufigsten angewandt Strategien native Protein-Wechselwirkungen zu identifizieren. Signifikante Verbesserungen in den Instrumenten Fähigkeiten in den letzten zehn Jahren erreicht haben, diesen Ansatz extrem leistungsfähig gemacht. Es ist wichtig zu beachten, dass die von AP-MS-Experimenten identifiziert Wechselwirkungen eine Mischung aus direkten und indirekten Verbindungen zwischen Köder und Beute sind. Darüber hinaus oft Proteine ​​nehmen an mehreren verschiedenen Komplexen innerhalb des gleichen zellulären Kontext, die unterschiedliche biologische Rollen haben könnte, und daher sind die Interaktoren, die durch AP-MS identifiziert werden könnte eine Mischung von verschiedenen Protein-Baugruppen oder Funktionseinheiten darstellen. Es ist nicht möglich abzuleitensolche topologischen Informationen a priori aus den mono-dimensional Listen von Proteinen durch einfache AP-MS - Experimente erzeugt. Jedoch kann die Technik ausgenutzt werden, um die Architektur weiter von Proteinkomplexen zu definieren, indem sie mit einer oder mehreren Methoden, die Kombination dieser Baugruppen zu lösen. Um haben die Topologie von Protein-Wechselwirkungen identifiziert durch AP-MS, verschiedene Strategien angewandt worden zu lösen. Ein Ansatz ist die iterativen AP-MS - Experimente durchzuführen , unter Verwendung des in einer früheren Runde von Experimenten identifiziert preys als Köder 1. Obwohl sehr informativ, ist dies eine Arbeit ganz Aufgabe intensiv experimentell und analytisch. Protein Vernetzung in Kombination mit der Massenspektrometrie wird zunehmend eingesetzt, um 2 auf den Proteinkomplexen topologische Informationen abzuleiten, 3, 4, 5. Allerdings computational Analyse von vernetzten Peptide bleibt nach wie vor eine schwierige Aufgabe, und daher ist der Engpass im Arbeitsablauf. Das Aufkommen von MS-spaltbare Vernetzungsreagenzien sollten Kartierung der Aminosäurereste erleichtern , die 6 Proteine in enger Nähe sind, 7 in zusammenwirkt. Eine weitere Alternative ist die Affinitätsreinigung des Standes der orthogonalen Trenntechniken zu kombinieren 8, 9. Chromatographische Fraktionierung durch Gelfiltration oder Ionenaustausch oder Saccharosegradienten - Fraktionierung wird kürzlich auch in Kombination mit quantitativer Massenspektrometrie verwendet Multiproteinkomplexe in einer systemweiten Ebene zu beschreiben, unter Umgehung des komplexen Isolierungsschrittes 10, 11, 12, 13. Blau nativen Polyacrylamid-Gelelektrophorese (BN-PAGE) wurde in großem Umfang angewendetuntersuchen native Protein - Wechselwirkungen, Protein typischerweise mitochondrialen Membrankomplexe solcher , die 14. Diese Trenntechnik wurde kürzlich auch in Kombination mit markierungsfreien Proteinquantifizierung und Korrelations Profilieren, nicht nur auf die mitochondriale Komplexe 15, 16, 17, sondern auch für andere entwirren Proteinkomplexe aus ganzen Zellen 18, 19 verwendet. Wir stellten die Hypothese, dass die Kombination von Affinitätsreinigung mit anschließenden nativen Fraktionierung Ansätzen und quantitativem MS sollte für die Lösung mehrerer Proteineinheiten eine nützliche Strategie bietet ein bestimmtes Protein enthalten. Hier beschreiben wir ein Verfahren, das generische Epitop-basierte Affinitätsreinigung mit blauem nativer Polyacrylamidgelelektrophorese der isolierten Komplexe, gefolgt von quantitativen Massen sp vereintectrometry und Proteinkorrelationsprofilerstellung, die mehrere Baugruppen ein Protein lösen könnten beteiligt werden. Wir embryonalen Stammzellen der Maus verwenden, wo ein Protein von Interesse an ein Epitop-Tag fusioniert ist, von dem endogenen Locus exprimiert physiologischen Fülle der Nähe zu erreichen und effizient nativen gewährleisten Komplex Isolation. Dieser Ansatz entwirrt die mehrere Wechselwirkungen ein Protein eingreift, so dass sie in verschiedene Baugruppen auf ihre Korrelationsprofile basierend Lösung, während erfordern keine Arbeit mehr als herkömmliche GELC-MS 20.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1384">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Protein G Dynabeads</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">10003D</td>
			<td style="width:452px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">FLAG antibody M2</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">F1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Tween-20, protein grade, 10% solution</td>
			<td style="width:285px;">Millipore</td>
			<td style="width:220px;">655206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Dimethyl pimelimidate</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">80490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">0.2 M Triethanolamine buffer, pH 8.2</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">T0449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">3x FLAG peptide</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">F4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Vivaspin 5K NMWCO, PES</td>
			<td style="width:285px;">Sartorius</td>
			<td style="width:220px;">VS0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">NativePAGE 3-12% Bis-Tris gel</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">20x NativePAGE Running Buffer</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">20x NativePAGE Cathode Additive</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">4x NativePAGE sample loading buffer</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">NativeMARK</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">LC0725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NativePAGE 5% G-250 sample additive&#160;</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Nunc conical bottom 96-well plate, polypropylene</td>
			<td style="width:285px;">Thermo</td>
			<td style="width:220px;">249944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Multiscreen HTS 96-well filtration system</td>
			<td style="width:285px;">Thermo</td>
			<td style="width:220px;">MSDVN6550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Nunc 96-well cap natural</td>
			<td style="width:285px;">Thermo</td>
			<td style="width:220px;">276002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride)</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Acetonitrile, HPLC grade</td>
			<td style="width:285px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">A/0627/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Trypsin, sequencing grade</td>
			<td style="width:285px;">Roche</td>
			<td style="width:220px;">11418475001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Software</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">MaxQuant (software)</td>
			<td style="width:285px;">N.A.</td>
			<td style="width:220px;">N.A.</td>
			<td style="width:452px;">http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Perseus (software)</td>
			<td style="width:285px;">N.A.</td>
			<td style="width:220px;">N.A.</td>
			<td style="width:452px;">http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

resolving affinity purified protein complexes by blue native page and protein correlation profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Der Arbeitsablauf der Affinitätsreinigung Blau native Protein Correlation Profilierung durch Massenspektrometrie (ABC-MS) Strategie ist in Abbildung 7 dargestellt. Native Protein-Komplexe um ein Protein von Interesse werden durch Affinitätsreinigung isoliert Antikörper gegen einen Epitop-Tag (in diesem Fall FLAG) und kompetitive Elution mit. Die Komplexe werden durch BN-PAGE aufgetrennt, und die ganze Gelspur ist in 48 Abschnitte herausgeschnitten und für Schrot LC-MS / MS. Quantitative MS Informationen werden verwendet, um ein Migrationsprofil für jedes identifizierte Protein über die blaue nativen Trennung zu erzeugen. Proteine, die interagieren, ein deutliches komplexe Anzeige ähnliche Migrationsprofile mit deckungs Spitzen bilden. Wenn ein Protein von Interesse an mehr als eine Baugruppe erfolgt, werden mehrere Peaks in ihrem Migrationsprofil beobachtet, da die Teilkomplexe sind innerhalb des Auflösungsvermögens des blauen nativen Gels. Ein systematischer Vergleich der migRation Profile können durch Protein-Korrelation erreicht werden Profilierungs hierarchische Clustern unter Verwendung. Das Dendrogramm und die Spitzenintensitäten für alle Fraktionen werden in einem wärme Karte visualisiert, erleichtert die Identifizierung Proteinen in Wechselwirkung zu treten, die auf unterschiedliche Proteinkomplexen gehören (Abbildung 8). Wir nutzten diese Strategie , um die Interaktionspartner von MTA2 zu analysieren, eine Kernuntereinheit der NuRD Chromatin - Komplex 20 Umbau. Wie in 9 gezeigt ist , zeigte das Migrationsprofil von MTA2 zwei Peaks unterschiedlicher Intensitäten zwischen 700 kDa und 1,2 MDa, mit der unteren Massenspitze höher Fülle anzeigt. Andere NuRD Kern - Untereinheiten, einschließlich MTA1 / 3, HDAC1 / 2 und MBD3 identisches Trennungsmuster zeigten, wenn auch Peaks , das für einige der Untereinheiten, nämlich CHD4, Gatad2a / b und Rbbp4 / 7, hatten die inverse Häufigkeitsverteilung (9A, B). Im Gegensatz dazu das Profil von Cdk2ap1, ein Regulationsfaktor, der den Komplex zu NuRD Wnt Genpromotoren rekrutiert 23, dargestellt nur die höheren Massenpeak (Abbildung 9C), und so hat Sall4, einen transkriptionalen Repressor, der auch 20 NuRD zu binden , gezeigt worden ist, 24, 25. Somit Fraktionierung von affinitätsgereinigtem MTA2-assoziierte Proteine, die durch blaue native PAGE konnte zwei verschiedene Formen des NuRD Komplex lösen. ABC-MS ermöglicht auch die Identifizierung von neuen Interaktoren, während sie zu bestimmten Protein Einheiten zuweisen. Durch Untersuchung der Proteine Cluster und Fraktion in einer Wärme Karte dargestellt Intensitäten detektiert wir eine starke Korrelation zwischen Untereinheiten und NuRD WDR5, eine regulatorischen Untereinheit des MLL - Methyltransferase - Komplexes 26 mit WDR5 Anzeige von zwei Migrations Peaks mit dem beide NuRD p koinzidenteaks (Abbildung 8), eine neuartige Wechselwirkung zwischen WDR5 und NuRD hindeutet. Wir bestätigten diese Interaktion durch Co-Immunpräzipitation und Co-Migration in Grßenausschlußchromatographie 20. Die Auswahl der Abstandsmetrik-Berechnung in dem hierarchischen Clustering wird die Form der Cluster beeinflussen und damit die Zusammenhänge. Wir empfehlen, mit den verschiedenen Metriken experimentieren die beste Lösung mit bestehenden Interaktion Wissen des Proteins oder ein Komplex von Interesse zu erreichen. Im allgemeinen erreicht man die besten Ergebnisse mit der Manhattan (L1) Distanzmaß 20. Pearson - Korrelation oder euklidische Abstandsmetriken sind auch zur Identifizierung von Komplexen basierend auf alternative Fraktionierungstechniken 10 berichtet, 11, 12. die quantitative MS Daten aus den blauen nativen erhaltenen Fraktionen können auch die Stöchiometrie von Proteinkomplexen zu bestimmen, verwendet werden. Die iBAQ (Intensität basierend absolute Quantifizierung) -Wert liefert ein Maß für die relative Häufigkeit der identifizierten Proteine 27, 28. Die iBAQ Werte für die Protein-Komplex Mitglieder in allen Fraktionen innerhalb einer peak Migrationsprofil sind, dass der Köder-Protein normalisiert relativen Mengen zu erhalten. Die normalisierten iBAQs über eine Profilspitze für ein Protein-Komplex gegeben Element sollten einen horizontalen Trend folgen, und die Trendwerte spiegeln die Stöchiometrie der interagierenden Proteine ​​relativ zu dem Köder-Protein. Für eine detailliertere Darstellung der Stöchiometrie Berechnungen, siehe 20. <img alt="Abbildung 7" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig7.jpg" /> Abbildung 7: Schematische Workflow einer Zusammenfassung der ABC-MS strategie. Diese Zahl wird aus 20 modifiziert ist . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig7large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 8" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig8.jpg" /> Abbildung 8. Hierarchical Clustering von BN-PAGE Migrationsprofile der MTA2 Interaktoren. MTA2-assoziierte Proteine ​​wurden auf der Grundlage der Ähnlichkeit ihrer Migrationsprofile gruppierten. Nur eine Teilmenge der wärme Karte des NuRD Komplex enthält, wird (eingeschlossen in der blauen Box) gezeigt. Das gelbe Feld unterstreicht die starke Korrelation von WDR5 mit dem NuRD Komplex. Die kommentierten Molekulargewichte wurden aus den Wanderungsstrecken von Proteinstandards in demselben Gel laufen geschätzt. Diese Forschung wurde ursprünglich in Molecular and Cellular Proteomics 20 der amerikanischen Gesellschaft für Biochemie und Mo veröffentlicht<html> molekulare Biologie. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig8large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="9" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig9.jpg" /> Abbildung 9. BN-PAGE Migrationsprofil von NuRD Untereinheiten und assoziierten Proteinen. A) MTA2 und NuRD Untereinheiten , die in einem ähnlichen Intensitätsmuster. B) MTA2 und NuRD Untereinheiten mit dem inversen Intensitätsmuster. C) MTA2 und Cdk2ap1, die in der höheren Molekulargewicht NuRD Entität nur vorhanden ist. Die kommentierten Molekulargewichte wurden aus dem Migrationsprofil der Proteinstandards geschätzt. Diese Forschung wurde ursprünglich in Molecular and Cellular Proteomics 20 der amerikanischen Gesellschaft für Biochemie und Molekularbiologie veröffentlicht._blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Supplemental Datei" src="/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.jpg" /> Ergänzende Daten: Beispieldatensatz. MaxQuant abgeleitete proteingroups.txt Datei Protein Identifikationen und Quantifizierungswerte von einem ABC-MS-Experiment enthält. Diese Forschung wurde ursprünglich in Molecular and Cellular Proteomics 20 der amerikanischen Gesellschaft für Biochemie und Molekularbiologie veröffentlicht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.txt" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.txt" target="_blank">diese Datei herunterzuladen.</a>

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Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Hier stellen wir Protokolle für die Affinitätsreinigung von Proteinkomplexen und deren Trennung durch blaue native PAGE, gefolgt von Proteinkorrelationsprofilierungs freie quantitative Massenspektrometrie Label. Diese Methode ist nützlich Interaktom in verschiedene Proteinkomplexe zu lösen.

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

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