Name: resolving affinity purified protein complexes by blue native page and protein correlation profiling
Uploaded: 2017-04-01T12:30:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling at JoVE.com

This work was funded by the Wellcome Trust (WT098051).

<ol>
	<li>Goudreault, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PP2A+phosphatase+high+density+interaction+network+identifies+a+novel+striatin-interacting+phosphatase+and+kinase+complex+linked+to+the+cerebral+cavernous+malformation+3+(CCM3)+protein.">A PP2A phosphatase high density interaction network identifies a novel striatin-interacting phosphatase and kinase complex linked to the cerebral cavernous malformation 3 (CCM3) protein.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (1), 157-171 (2009).</li><li>Leitner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+native+protein+structures+by+chemical+cross-linking,+mass+spectrometry,+and+bioinformatics.">Probing native protein structures by chemical cross-linking, mass spectrometry, and bioinformatics.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (8), 1634-1649 (2010).</li><li>Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginning+of+a+beautiful+friendship:+cross-linking/mass+spectrometry+and+modelling+of+proteins+and+multi-protein+complexes.">The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes.</a> J Struct Biol. 173 (3), 530-540 (2011).</li><li>Sinz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+cross-linking+and+mass+spectrometry+to+map+three-dimensional+protein+structures+and+protein-protein+interactions.">Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions.</a> Mass Spectrom Rev. 25 (4), 663-682 (2006).</li><li>Walzthoeni, T., Leitner, A., Stengel, F., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+supported+determination+of+protein+complex+structure.">Mass spectrometry supported determination of protein complex structure.</a> Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 252-260 (2013).</li><li>Kaake, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vivo+cross-linking+mass+spectrometry+platform+to+define+protein-protein+interactions+in+living+cells.">A new in vivo cross-linking mass spectrometry platform to define protein-protein interactions in living cells.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3533-3543 (2014).</li><li>Kao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+cross-linking+strategy+for+fast+and+accurate+identification+of+cross-linked+peptides+of+protein+complexes.">Development of a novel cross-linking strategy for fast and accurate identification of cross-linked peptides of protein complexes.</a> Mol Cell Proteomics. 10 (1), (2011).</li><li>Hughes, M. A., Langlais, C., Cain, K., MacFarlane, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterisation+and+reconstitution+of+cell+death+signalling+complexes.">Isolation, characterisation and reconstitution of cell death signalling complexes.</a> Methods. 61 (2), 98-104 (2013).</li><li>Lim, S., Zou, Y., Friedman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+activator+Mirk/Dyrk1B+is+sequestered+by+p38alpha/beta+MAP+kinase.">The transcriptional activator Mirk/Dyrk1B is sequestered by p38alpha/beta MAP kinase.</a> J Biol Chem. 277 (51), 49438-49445 (2002).</li><li>Havugimana, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+census+of+human+soluble+protein+complexes.">A census of human soluble protein complexes.</a> Cell. 150 (5), 1068-1081 (2012).</li><li>Kirkwood, K. J., Ahmad, Y., Larance, M., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+native+protein+complexes+and+protein+isoform+variation+using+size-fractionation-based+quantitative+proteomics.">Characterization of native protein complexes and protein isoform variation using size-fractionation-based quantitative proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3851-3873 (2013).</li><li>Kristensen, A. R., Gsponer, J., Foster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+approach+for+measuring+temporal+changes+in+the+interactome.">A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome.</a> Nat Methods. 9 (9), 907-909 (2012).</li><li>Liu, F., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+the+architecture+of+protein+assemblies+and+protein+interaction+networks+by+cross-linking+mass+spectrometry.">Interrogating the architecture of protein assemblies and protein interaction networks by cross-linking mass spectrometry.</a> Curr Opin Struct Biol. 35, 100-108 (2015).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions.">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li><li>Heide, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexome+profiling+identifies+TMEM126B+as+a+component+of+the+mitochondrial+complex+I+assembly+complex.">Complexome profiling identifies TMEM126B as a component of the mitochondrial complex I assembly complex.</a> Cell Metab. 16 (4), 538-549 (2012).</li><li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+953+human+proteins+from+a+mitochondrial+HEK293+fraction+by+complexome+profiling.">Analysis of 953 human proteins from a mitochondrial HEK293 fraction by complexome profiling.</a> PLoS One. 8 (7), 68340 (2013).</li><li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC-MS/MS+as+an+alternative+for+SDS-PAGE+in+blue+native+analysis+of+protein+complexes.">LC-MS/MS as an alternative for SDS-PAGE in blue native analysis of protein complexes.</a> Proteomics. 9 (17), 4221-4228 (2009).</li><li>Remmerie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+tobacco+BY-2+protein+complexes+with+BN+PAGE/LC-MS/MS+and+clustering+methods.">Unraveling tobacco BY-2 protein complexes with BN PAGE/LC-MS/MS and clustering methods.</a> J Proteomics. 74 (8), 1201-1217 (2011).</li><li>Sessler, N., Krug, K., Nordheim, A., Mordmuller, B., Macek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Plasmodium+falciparum+proteasome+using+Blue+Native+PAGE+and+label-free+quantitative+mass+spectrometry.">Analysis of the Plasmodium falciparum proteasome using Blue Native PAGE and label-free quantitative mass spectrometry.</a> Amino Acids. 43 (3), 1119-1129 (2012).</li><li>Bode, D., Yu, L., Tate, P., Pardo, M., Choudhary, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Two+Distinct+Nucleosome+Remodeling+and+Deacetylase+(NuRD)+Complex+Assemblies+in+Embryonic+Stem+Cells.">Characterization of Two Distinct Nucleosome Remodeling and Deacetylase (NuRD) Complex Assemblies in Embryonic Stem Cells.</a> Mol Cell Proteomics. 15 (3), 878-891 (2016).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+the+MaxQuant+computational+platform+for+SILAC-based+quantitative+proteomics.">A practical guide to the MaxQuant computational platform for SILAC-based quantitative proteomics.</a> Nat Protoc. 4 (5), 698-705 (2009).</li><li>Kim, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+regulatory+factor+recruits+the+nucleosome+remodeling+complex+to+wingless+integrated+(Wnt)+signaling+gene+promoters+in+mouse+embryonic+stem+cells.">A novel regulatory factor recruits the nucleosome remodeling complex to wingless integrated (Wnt) signaling gene promoters in mouse embryonic stem cells.</a> J Biol Chem. 287 (49), 41103-41117 (2012).</li><li>Lauberth, S. M., Rauchman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+12-amino+acid+motif+in+Sall1+recruits+the+nucleosome+remodeling+and+deacetylase+corepressor+complex.">A conserved 12-amino acid motif in Sall1 recruits the nucleosome remodeling and deacetylase corepressor complex.</a> J Biol Chem. 281 (33), 23922-23931 (2006).</li><li>Miller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sall4+controls+differentiation+of+pluripotent+cells+independently+of+the+Nucleosome+Remodelling+and+Deacetylation+(NuRD)+complex.">Sall4 controls differentiation of pluripotent cells independently of the Nucleosome Remodelling and Deacetylation (NuRD) complex.</a> Development. 143 (17), 3074-3084 (2016).</li><li>Dharmarajan, V., Lee, J. H., Patel, A., Skalnik, D. G., Cosgrove, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+WDR5+interaction+(Win)+motif+recognition+in+human+SET1+family+histone+methyltransferases.">Structural basis for WDR5 interaction (Win) motif recognition in human SET1 family histone methyltransferases.</a> J Biol Chem. 287 (33), 27275-27289 (2012).</li><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Smits, A. H., Jansen, P. W., Poser, I., Hyman, A. A., Vermeulen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+chromatin-associated+protein+complexes+revealed+by+label-free+quantitative+mass+spectrometry-based+proteomics.">Stoichiometry of chromatin-associated protein complexes revealed by label-free quantitative mass spectrometry-based proteomics.</a> Nucleic Acids Res. 41 (1), 28 (2013).</li><li>Lambert, J. P., Tucholska, M., Pawson, T., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+DNA+shearing+in+standard+affinity+purification+allows+simultaneous+identification+of+both+soluble+and+chromatin-bound+interaction+partners.">Incorporating DNA shearing in standard affinity purification allows simultaneous identification of both soluble and chromatin-bound interaction partners.</a> J Proteomics. 100, 55-59 (2014).</li><li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+PAGE.">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li><li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li><li>Schagger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li><li>Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B., Aebersold, R., Steimle, V., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+Blue+native/SDS+gel+electrophoresis+of+multi-protein+complexes+from+whole+cellular+lysates:+a+proteomics+approach.">Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).</li><li>Liu, F., Rijkers, D. T., Post, H., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+profiling+of+protein+assemblies+by+cross-linking+mass+spectrometry.">Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross-linking mass spectrometry.</a> Nat Methods. 12 (12), 1179-1184 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

כאן, אנו מתארים את שימוש טיהור זיקה ואחריו ג&#39;ל אלקטרופורזה כחולה מקורית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה כמותית כדי לפתור קומפלקסי חלבונים. גישה זו מציעה שיטה לפענח רשימות אינטראקצית חלבון חד ממדיות לתוך אסיפות חלבון פונקציונליות. אנחנו מדגימים את השיטה מבוססת על שימוש חלבונים-tagged אפיטופ. עם זאת, אם שורת תאי מבטאי חלבון מתויג אינה זמינה, אלטרנטיבה יכולה להיות להשתמש נוגדנים כנגד החלבון של עניין, בתנאים שיש פפטיד זמין להשיג elution התחרותי ילידים. כמות של חומר המוצא וכמות חרוזים ייתכן שיהיה צורך לשנות בהתאם לרמת הביטוי של חלבון המטרה. אנחנו בדרך כלל לבצע פרוטוקול זה עם 2-5 x 10 8 תאים חומר מוצאים, וזה מספיק אפילו בשביל חלבונים עם רמת ביטוי נמוכה. רכב חיץ תמוגה צריך להיבחר באופן אמפירי כדי להשיגליד כדי להשלים solubilization של פיתיון. זה עשוי להיות מאתגר עבור סוגים מסוימים של חלבונים, ב הכרומטין מסוים או חלבונים בממברנה מחייב. אפשרויות חלופיות כוללות הגדלה כמות מלח, ובלבד מורכב החלבון נחקר הוא יציב מלח גבוה, או באמצעות sonication ו / או טיפול nuclease עבור חלבוני מחייב הכרומטין 20, 29. במקרה של חלבונים בממברנה, מיתוג דטרגנט DDM או digitonin עשוי להיות רצוי 30. במקרה של ה- DNA מחייבת חלבונים, כדאי לכלול nuclease כגון benzonase במהלך שלב טיהור 20. הסרה מלאה של חומצות גרעין מבטיחה כי האינטראקציות זוהו להתרחש בין חלבונים ואינם בתיווך DNA. מרכיב קריטי להביא בחשבון בעת ​​השימוש בגישה זו היא היציבות של המתחם תחת חקירה. ההליך הוא ארוך עשוי להיות כרוך preservinגרם חלבון הלילה מורכב. השגנו הצלחה טובה עם שני מתחמי שיפוץ הכרומטין (ד בודה ומ פרדו, מידע לא מוצג), אבל זה צריך להיבדק. צעד טיהור הזיקה עשוי להתקצר אם נדרש. טכניקות חלופיות שיאפשרו חלוקה מקורית, כגון כרומטוגרפיה הדרה גודל, כבר בשימוש נרחב במשך 50 שנים לאפיין קומפלקסים חלבונים. אנחנו ואחרים הראו כי ההחלטה של עמוד כחול יליד עדיפה על זו מושגת באמצעות כרומטוגרפיה הדרה גודל 20, 31, 32, 33. יתרון נוסף של עמוד כחול ילידים הוא שזה לא דורש מערכות כרומטוגרפיה, שהם יקרים, אלא משתמש בציוד חלבון electrophoretic כי הוא נפוץ במעבדות. במונחים של הידיים על הזמן, שיטה זו אינה כרוכה בעבודה יותר מ א geLC-MS / MS המסורתיתpproach או חלוקת כרומטוגפיות מחוברת. עם זאת, כפי הטכניקות החלוקות ביותר לעשות, יש לו גבול הרזולוציה שלהם. מתחמים כי הם מאוד הומוגנית או קרובים במסה וצורה עשויים להיות מעבר ברזולוציה שמציעה עמוד ילידי כחול, ומכאן בפרוטוקול כפי שדווח כאן לא יכול להיות מוצלח אוניוורסלי בפתרון מתחמים מובהקים עם יחידות משנה משותפות. בנימה מעודדת, היינו מצליחה להפריד שני מתחמי tetrameric דומים מאוד שיתוף שלוש יחידות משנה (M. פרדו, כתב יד בהכנה). מאז ספקטרומטריית מסה הפכה רגישה יותר ויותר, אפילו בכמויות זעירות של interactors שאינו ספציפי ומזהמים ניתן בדגימות AP-MS. הגישה המוצגת כאן עשויה לסייע אפלית interactors אמיתי מפני זיהום רקע בתחום טיהור הזיקה ידי התמקדות תשומת הלב על חלבונים עם פסגות הגירה בקנה אחד עם פסגות הגירת פיתיון על משקל מולקולרי גבוה יותר מזה שלחלבוני monomeric. מספר קבוצות השתמשו בטכניקות חלוקות ואחריו פרופיל מתאם חלבון להתוות קומפלקסי חלבונים בקנה מידה הסלולר ללא צורך בבידוד קודם 10, 11, 12, 34. עם זאת, זה יכול לגרום לכשל לזהות אינטראקציות תת-stoichiometric. השילוב של צעד העשרה באמצעות טיהור זיקה יכול לעזור להתגבר על זה. הגישה המתוארת כאן צריכה להיות שימושית בדרך כלל בשביל לחקור את הטופולוגיה של קומפלקסים חלבוניים לפרום את המתחמים המרובים חלבון נתון לוקח חלק בתוך אותה בהקשר הסלולר. האסטרטגיה היא פשוט מקובל המעבדות כי לא יכול להיות ציוד חלוקת כרומטוגפיות יקר כדי לפתור קומפלקסי חלבונים.

בתאים, רוב החלבונים תפקידיהם באמצעות אינטראקציות חלבון-חלבון חולף או על ידי יצירת מכלולים חלבון יציב. אפיון אינטראקציות חלבון חיוני בתהליכים תאיים הבנה לחלוטין. טיהור זיקה בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (AP-MS) היא אחת האסטרטגיות ביותר מיושמות כלל לזהות אינטראקציות חלבון ילידים. שיפורים משמעותיים ביכולות מכשיר השיגו בעשור האחרון הפכו גישה זו עצמה אדירה. חשוב לציין כי האינטראקציות שזוהו על ידי ניסויי AP-MS כוללות תערובת של עמותות ישירות ועקיפות בין הפיתיון פושט. בנוסף, לעתים קרובות חלבונים להשתתף בכמה מתחמים שונים בתוך אותו בהקשר הסלולר, אשר עשוי להיות תפקידים ביולוגיים שונים, ולכן interactors שמזוהים על ידי AP-MS אולי מייצגות מגוון של מכלולי חלבון נפרדים או ישויות פונקציונליות. לא ניתן לגזורמידע טופולוגי כאלה מראש מהרשימות מונו-ממדי של החלבונים שיוצרים ניסויי AP-MS פשוט. עם זאת, הטכניקה ניתן לניצול נוסף כדי להגדיר את הארכיטקטורה של קומפלקסי חלבונים על ידי שילוב עם שיטות אחת או יותר כדי לפתור מכלולים אלה. על מנת לפתור את הטופולוגיה של אינטראקציות חלבון המזוהות באמצעות AP-MS, מספר אסטרטגיות יושמו. גישה אחת היא לבצע ניסויי AP-MS איטרטיבי באמצעות הפושט מזוהה בסיבוב קודם של ניסויים כמו פיתיונות 1. למרות מאוד אינפורמטיבי, זה בהחלט משימת עבודה אינטנסיבית הוא בניסוי ומדוקדק. חלבון cross-linking בשילוב עם ספקטרומטריית מסה נמצא בשימוש יותר ויותר כדי להפיק מידע טופולוגי על קומפלקסים חלבונים 2, 3, 4, 5. עם זאת, computatioניתוח סופי של פפטידים צולבים עדיין נותר משימה מאתגרת ולכן הוא צוואר הבקבוק בתהליך העבודה. הופעתו של ריאגנטים MS-cleavable cross-linking צריכה להקל מיפוי של שאריות חומצת אמינו הנמצאות בסמיכות אינטראקצית חלבונים 6, 7. חלופה נוספת היא לשלב טיהור זיקה עם טכניקות הפרדה מאונכות לפני 8, 9. חלוקת זיהוי תכונות חומרים על ידי סינון ג&#39;ל או החלפת יונים, או חלוקת שיפוע סוכרוז יש גם לאחרונה נעשתה שימוש בשילוב עם ספקטרומטריית מסה כמותית לתאר מתחמי multiprotein ברמה מערכתית, על ידי עקיפת שלב הבידוד המורכב 10, 11, 12, 13. ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide ילידי כחול (BN-עמוד) יושמה באופן נרחבלחקור אינטראקציות חלבון מקומיות, בדרך כלל אלה בקומפלקסי חלבון קרום המיטוכונדריה 14. טכניקת פרדה זו גם שמשה לאחרונה בשילוב עם כימותי חלבון ללא תווית ו פרופיל מתאם, לא רק על מתחמי המיטוכונדריה 15, 16, 17, אלא גם עבור התרת קומפלקסי חלבונים אחרים מתאי כולה 18, 19. החוקרים שערו כי השילוב של טיהור זיקה עם גישות חלוקות מקורות עוקבות וכמותיים MS אמור לספק אסטרטגיה שימושית לפתרון מכלולי חלבון מרובים המכילים חלבון מסוים. כאן אנו מתארים שיטה המשלבת טיהור זיקה מבוססת אפיטופ גנרית עם ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide ילידי הכחול של המתחמים המבודדים, ואחריו sp מסה כמותיתectrometry ו פרופיל מתאם חלבון, כדי לפתור את המכלולים המרובים חלבון עלול להיות מעורב. אנו מעסיקים תאי גזע עוברי בעכבר שבו חלבון של העניין התמזג תג epitope מתבטא מן הלוקוס אנדוגני להשיג קרוב שפע פיסיולוגי ולהבטיח ילידים יעילים בידוד מורכב. גישה זו פורמת את האינטראקציות המרובות חלבון עוסק, כדי לפתור אותן לתוך אסיפות נפרדות על פי פרופיל המתאם שלהם, בעוד שאינה מצריך עבודה יותר geLC-MS 20 הקונבנציונלי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1384">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Protein G Dynabeads</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">10003D</td>
			<td style="width:452px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">FLAG antibody M2</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">F1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Tween-20, protein grade, 10% solution</td>
			<td style="width:285px;">Millipore</td>
			<td style="width:220px;">655206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Dimethyl pimelimidate</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">80490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">0.2 M Triethanolamine buffer, pH 8.2</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">T0449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">3x FLAG peptide</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">F4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Vivaspin 5K NMWCO, PES</td>
			<td style="width:285px;">Sartorius</td>
			<td style="width:220px;">VS0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">NativePAGE 3-12% Bis-Tris gel</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">20x NativePAGE Running Buffer</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">20x NativePAGE Cathode Additive</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">4x NativePAGE sample loading buffer</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">NativeMARK</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">LC0725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NativePAGE 5% G-250 sample additive&#160;</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Nunc conical bottom 96-well plate, polypropylene</td>
			<td style="width:285px;">Thermo</td>
			<td style="width:220px;">249944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Multiscreen HTS 96-well filtration system</td>
			<td style="width:285px;">Thermo</td>
			<td style="width:220px;">MSDVN6550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Nunc 96-well cap natural</td>
			<td style="width:285px;">Thermo</td>
			<td style="width:220px;">276002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride)</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Acetonitrile, HPLC grade</td>
			<td style="width:285px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">A/0627/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Trypsin, sequencing grade</td>
			<td style="width:285px;">Roche</td>
			<td style="width:220px;">11418475001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Software</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">MaxQuant (software)</td>
			<td style="width:285px;">N.A.</td>
			<td style="width:220px;">N.A.</td>
			<td style="width:452px;">http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Perseus (software)</td>
			<td style="width:285px;">N.A.</td>
			<td style="width:220px;">N.A.</td>
			<td style="width:452px;">http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

resolving affinity purified protein complexes by blue native page and protein correlation profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

זרימת העבודה של פרופיל מתאם חלבון יליד הכחול טיהור הזיקה ידי ספקטרומטריית מסה (ABC-MS) אסטרטגיה מתוארת באיור 7. קומפלקסים חלבונים Native סביב חלבון של עניין מבודדים על ידי טיהור זיקה באמצעות נוגדנים נגד תג אפיטופ (ב FLAG במקרה זה) ו elution תחרותי. המתחמים נפתרים על ידי BN-עמוד, ואת שביל ג&#39;ל כולה הוא נכרת לתוך 48 חלקים, והכינו עבור רובה LC-MS / MS. מידע כמותי MS משמש לצורך יצירת פרופיל ההעברה של כל חלבון מזוהה ברחבי ההפרדה ילידי כחול. חלבונים כי האינטראקציה כדי ליצור פרופילי הגירה דומים מורכבת תצוגה ברורה עם פסגות superimposable. כאשר חלבון של עניין לוקח חלק בלמעלה מ הרכבה אחד, פסגות מרובות הם נצפו פרופיל ההגירה שלה, בהינתן תת-המתחמים נמצאים בתוך כושר ההפרדה של ג&#39;ל הכחול מהקורה. השוואה שיטתית של המיגפרופילים מנה יכולה להיות מושגת על ידי מתאם חלבון פרופיל משתמש אשכולות היררכי. Dendrogram ואת עוצמות השיא עבור כל השברים הם דמיינו במפה-חום, הקלת זיהוי של אינטראקצית חלבונים ששייכים קומפלקסי חלבונים נפרדים (איור 8). השתמשנו באסטרטגיה זו כדי לנתח את השותפים באינטראקציה של Mta2, למקטע הליבה של הכרומטין NuRD שיפוץ 20 מורכבים. כפי שניתן לראות בתרשים 9, פרופיל ההגירה של Mta2 מוצג שני שיאים של עוצמות מובהקות בין 700 kDa ו 1.2 מד&quot;א, עם שיא המסה התחתון מוצג שפע גבוה. תת-יחידות ליבת NuRD אחרות, כולל Mta1 / 3, Hdac1 / 2 ו Mbd3, הראו דפוס הפרדה זהה, אם כי הפסגות לכמה יחידות המשנה, כלומר Chd4, Gatad2a / b ו- Rbbp4 / 7, היה חלוקת השפע ההפוכה (איור 9 א, B). לעומת זאת, הפרופיל של CDK2ap1, גורם רגולטורים הוא מגייס את מורכבות NuRD יזמי גן Wnt 23, הציג רק את שיא המסה הגבוה יותר (איור 9 ג), וכך עשיתי Sall4, A מדכא תעתיק כי גם הוכח לאגד 20 NuRD, 24, 25. לפיכך, החלוקה של חלבוני Mta2 הקשורים מטוהר זיקה לפי דף הכחול ילידים הצליחה לפתור שתי צורות שונות של מורכבות NuRD. גם ABC-MS מאפשרת זיהוי של interactors רומן תוך הקצאה אותם גופי חלבון מסוימים. באמצעות בחינה של אשכולות חלבונים בעוצמות שבריר מיוצג א-מפת חום זיהינו מתאם חזק בין יחידות משנה NuRD ו Wdr5, למקטע רגולטוריות של המתחם methyltransferase MLL 26, עם Wdr5 מוצגות שתי פסגות הגירה חופפות עם p שני NuRDeaks (איור 8), דבר המצביע על אינטראקציה הרומן בין Wdr5 ו NuRD. אנחנו אישר אינטראקציה זו על ידי שיתוף immunoprecipitation ושיתוף ההגירה כרומטוגרפיה הדרה גודל 20. הבחירה של חישוב מרחק מטרי של האשכולות ההיררכיים תשפיע על צורת האשכולות ומכאן המתאמים. אנו ממליצים להתנסות מדדים השונים כדי להשיג את ההתאמה הטובה ביותר עם ידע אינטראקציה קיים של החלבון או מורכבות עניין. באופן כללי השגנו את התוצאות הטובות ביותר עם מטר מרחק מנהטן (L1) 20. מתאם פירסון או מדדי מרחק האוקלידית גם דווח לזיהוי מתחמים המבוססים על טכניקות חלוקה אלטרנטיבית 10, 11, 12. קוואןנתוני titative MS המתקבל שהברים הכחולים ילידים יכולים לשמש גם כדי לקבוע את והרכב של קומפלקסי חלבונים. IBAQ ערך (כימות מוחלטת מבוסס בעוצמה) מספק מדד של השפע היחסי של החלבונים שזוהו 27, 28. ערכי iBAQ לחברי מורכב החלבון בכל שהברים בתוך שיא נדידת פרופיל מתנרמלים לזה של חלבון הפיתיון כדי להשיג כמויות יחסיות. IBAQs מנורמל פני שיא פרופיל עבור חבר מורכב חלבון נתון צריך לעקוב מגמה אופקית, ואת ערכי המגמה לשקף את והרכב של חלבוני האינטראקציה ביחס חלבון הפיתיון. לקבלת ייצוג מפורט יותר של חישובים ורכב, לראות 20. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig7.jpg" /> איור 7: עבודה סכמטי המסכם את ABC-MS יםtrategy. נתון זה שונה מ 20. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="הספרה 8" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig8.jpg" /> איור 8. אשכולות היררכיים של פרופילי הגירת BN-עמוד של interactors Mta2. החלבונים הקשורים Mta2 הצטופפו על סמך מידת הדמיון של פרופילי ההגירה שלהם. רק קבוצת משנה של מפת החום המכילה קומפלקס NuRD מוצג (מצורף באריזת הכחול). התיבה הצהובה מדגישה את הקורלציה החזקה של Wdr5 עם מורכבות NuRD. המשקלים המולקולריים המבוארים נאמדו מן מרחקי ההגירה של סטנדרטי חלבון לרוץ באותו ג&#39;ל. מחקר זה פורסם במקור ב פרוטאומיקה מולקולרי ותאי 20 האגודה האמריקאית לביוכימיה מו<html> ביולוגית lecular. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 9" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig9.jpg" /> איור 9. פרופיל הגירה BN-עמוד של יחידות משנה NuRD וחלבונים הקשורים. א) יחידות משנה Mta2 ו NuRD נוכח דפוס בעוצמה דומה. B) יחידות משנת Mta2 ו NuRD עם הדפוס העוצם ההפוך. ג) Mta2 ו Cdk2ap1, המהווה כיום רק ישות NuRD משקל מולקולרי גבוה. המשקלים המולקולריים המבוארים נאמדו מפרופיל הגירה של סטנדרטי החלבון. מחקר זה פורסם במקור ב מולקולרי ותא פרוטאומיקה 20 האגודה האמריקנית לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית._blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="קובץ משלימה" src="/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.jpg" /> נתונים משלימים: נתונים לדוגמה. MaxQuant הנגזרות קובץ proteingroups.txt המכיל הזדהויות חלבון וערכי כימותים מניסוי ABC-MS. מחקר זה פורסם במקור ב מולקולרי ותא פרוטאומיקה 20 האגודה האמריקנית לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.txt" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling at JoVE.com

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לטיהור זיקה של קומפלקסי חלבונים והפרדה שלהם לפי דף ילידי כחול, ואחריו פרופיל מתאם חלבון באמצעות ספקטרומטריית מסה כמותית בחינם תווית. שיטה זו שימושית כדי לפתור interactomes לתוך מתחמי חלבון ברורים.

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

טיהור טנדם זיקה של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Multimer-עמוד: שיטה לכידת וחלבון פתרון מתחמי דגימות ביולוגיות

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

ג &#39;ל אופקי אלקטרופורזה לאיתור משופרת של חלבונים-רנ&quot;א קומפלקסים

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

פיצול-BioID — ניתוח פרוטיאומיה מבנית של חלבון ספציפי ההקשר מתחמי הסלולר בסביבתם הטבעית

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

ניתוח של מתחמי חלבון ממברנה תילקואיד מאת כחול מקורי אלקטרופורזה בג'ל

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

זיקה טיהור של מתחמי חלבון Translocon כלורופלסט בעזרת התג ברז

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

רגישות גבוהה מדידה של שעתוק הזיקות איגוד מקדם-DNA על ידי טיטור תחרותי באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

ניתוח של קיפול חלבונים, תחבורה, והשפלה בתאים חיים על ידי הדופק רדיואקטיבי צ'ייס

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...