Name: resolving affinity purified protein complexes by blue native page and protein correlation profiling
Uploaded: 2017-04-01T12:30:00
Duration: 9 min 35 s
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This work was funded by the Wellcome Trust (WT098051).

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	<li>Goudreault, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PP2A+phosphatase+high+density+interaction+network+identifies+a+novel+striatin-interacting+phosphatase+and+kinase+complex+linked+to+the+cerebral+cavernous+malformation+3+(CCM3)+protein.">A PP2A phosphatase high density interaction network identifies a novel striatin-interacting phosphatase and kinase complex linked to the cerebral cavernous malformation 3 (CCM3) protein.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (1), 157-171 (2009).</li><li>Leitner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+native+protein+structures+by+chemical+cross-linking,+mass+spectrometry,+and+bioinformatics.">Probing native protein structures by chemical cross-linking, mass spectrometry, and bioinformatics.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (8), 1634-1649 (2010).</li><li>Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginning+of+a+beautiful+friendship:+cross-linking/mass+spectrometry+and+modelling+of+proteins+and+multi-protein+complexes.">The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes.</a> J Struct Biol. 173 (3), 530-540 (2011).</li><li>Sinz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+cross-linking+and+mass+spectrometry+to+map+three-dimensional+protein+structures+and+protein-protein+interactions.">Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions.</a> Mass Spectrom Rev. 25 (4), 663-682 (2006).</li><li>Walzthoeni, T., Leitner, A., Stengel, F., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+supported+determination+of+protein+complex+structure.">Mass spectrometry supported determination of protein complex structure.</a> Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 252-260 (2013).</li><li>Kaake, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vivo+cross-linking+mass+spectrometry+platform+to+define+protein-protein+interactions+in+living+cells.">A new in vivo cross-linking mass spectrometry platform to define protein-protein interactions in living cells.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3533-3543 (2014).</li><li>Kao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+cross-linking+strategy+for+fast+and+accurate+identification+of+cross-linked+peptides+of+protein+complexes.">Development of a novel cross-linking strategy for fast and accurate identification of cross-linked peptides of protein complexes.</a> Mol Cell Proteomics. 10 (1), (2011).</li><li>Hughes, M. A., Langlais, C., Cain, K., MacFarlane, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterisation+and+reconstitution+of+cell+death+signalling+complexes.">Isolation, characterisation and reconstitution of cell death signalling complexes.</a> Methods. 61 (2), 98-104 (2013).</li><li>Lim, S., Zou, Y., Friedman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+activator+Mirk/Dyrk1B+is+sequestered+by+p38alpha/beta+MAP+kinase.">The transcriptional activator Mirk/Dyrk1B is sequestered by p38alpha/beta MAP kinase.</a> J Biol Chem. 277 (51), 49438-49445 (2002).</li><li>Havugimana, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+census+of+human+soluble+protein+complexes.">A census of human soluble protein complexes.</a> Cell. 150 (5), 1068-1081 (2012).</li><li>Kirkwood, K. J., Ahmad, Y., Larance, M., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+native+protein+complexes+and+protein+isoform+variation+using+size-fractionation-based+quantitative+proteomics.">Characterization of native protein complexes and protein isoform variation using size-fractionation-based quantitative proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3851-3873 (2013).</li><li>Kristensen, A. R., Gsponer, J., Foster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+approach+for+measuring+temporal+changes+in+the+interactome.">A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome.</a> Nat Methods. 9 (9), 907-909 (2012).</li><li>Liu, F., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+the+architecture+of+protein+assemblies+and+protein+interaction+networks+by+cross-linking+mass+spectrometry.">Interrogating the architecture of protein assemblies and protein interaction networks by cross-linking mass spectrometry.</a> Curr Opin Struct Biol. 35, 100-108 (2015).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions.">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li><li>Heide, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexome+profiling+identifies+TMEM126B+as+a+component+of+the+mitochondrial+complex+I+assembly+complex.">Complexome profiling identifies TMEM126B as a component of the mitochondrial complex I assembly complex.</a> Cell Metab. 16 (4), 538-549 (2012).</li><li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+953+human+proteins+from+a+mitochondrial+HEK293+fraction+by+complexome+profiling.">Analysis of 953 human proteins from a mitochondrial HEK293 fraction by complexome profiling.</a> PLoS One. 8 (7), 68340 (2013).</li><li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC-MS/MS+as+an+alternative+for+SDS-PAGE+in+blue+native+analysis+of+protein+complexes.">LC-MS/MS as an alternative for SDS-PAGE in blue native analysis of protein complexes.</a> Proteomics. 9 (17), 4221-4228 (2009).</li><li>Remmerie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+tobacco+BY-2+protein+complexes+with+BN+PAGE/LC-MS/MS+and+clustering+methods.">Unraveling tobacco BY-2 protein complexes with BN PAGE/LC-MS/MS and clustering methods.</a> J Proteomics. 74 (8), 1201-1217 (2011).</li><li>Sessler, N., Krug, K., Nordheim, A., Mordmuller, B., Macek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Plasmodium+falciparum+proteasome+using+Blue+Native+PAGE+and+label-free+quantitative+mass+spectrometry.">Analysis of the Plasmodium falciparum proteasome using Blue Native PAGE and label-free quantitative mass spectrometry.</a> Amino Acids. 43 (3), 1119-1129 (2012).</li><li>Bode, D., Yu, L., Tate, P., Pardo, M., Choudhary, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Two+Distinct+Nucleosome+Remodeling+and+Deacetylase+(NuRD)+Complex+Assemblies+in+Embryonic+Stem+Cells.">Characterization of Two Distinct Nucleosome Remodeling and Deacetylase (NuRD) Complex Assemblies in Embryonic Stem Cells.</a> Mol Cell Proteomics. 15 (3), 878-891 (2016).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+the+MaxQuant+computational+platform+for+SILAC-based+quantitative+proteomics.">A practical guide to the MaxQuant computational platform for SILAC-based quantitative proteomics.</a> Nat Protoc. 4 (5), 698-705 (2009).</li><li>Kim, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+regulatory+factor+recruits+the+nucleosome+remodeling+complex+to+wingless+integrated+(Wnt)+signaling+gene+promoters+in+mouse+embryonic+stem+cells.">A novel regulatory factor recruits the nucleosome remodeling complex to wingless integrated (Wnt) signaling gene promoters in mouse embryonic stem cells.</a> J Biol Chem. 287 (49), 41103-41117 (2012).</li><li>Lauberth, S. M., Rauchman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+12-amino+acid+motif+in+Sall1+recruits+the+nucleosome+remodeling+and+deacetylase+corepressor+complex.">A conserved 12-amino acid motif in Sall1 recruits the nucleosome remodeling and deacetylase corepressor complex.</a> J Biol Chem. 281 (33), 23922-23931 (2006).</li><li>Miller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sall4+controls+differentiation+of+pluripotent+cells+independently+of+the+Nucleosome+Remodelling+and+Deacetylation+(NuRD)+complex.">Sall4 controls differentiation of pluripotent cells independently of the Nucleosome Remodelling and Deacetylation (NuRD) complex.</a> Development. 143 (17), 3074-3084 (2016).</li><li>Dharmarajan, V., Lee, J. H., Patel, A., Skalnik, D. G., Cosgrove, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+WDR5+interaction+(Win)+motif+recognition+in+human+SET1+family+histone+methyltransferases.">Structural basis for WDR5 interaction (Win) motif recognition in human SET1 family histone methyltransferases.</a> J Biol Chem. 287 (33), 27275-27289 (2012).</li><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Smits, A. H., Jansen, P. W., Poser, I., Hyman, A. A., Vermeulen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+chromatin-associated+protein+complexes+revealed+by+label-free+quantitative+mass+spectrometry-based+proteomics.">Stoichiometry of chromatin-associated protein complexes revealed by label-free quantitative mass spectrometry-based proteomics.</a> Nucleic Acids Res. 41 (1), 28 (2013).</li><li>Lambert, J. P., Tucholska, M., Pawson, T., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+DNA+shearing+in+standard+affinity+purification+allows+simultaneous+identification+of+both+soluble+and+chromatin-bound+interaction+partners.">Incorporating DNA shearing in standard affinity purification allows simultaneous identification of both soluble and chromatin-bound interaction partners.</a> J Proteomics. 100, 55-59 (2014).</li><li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+PAGE.">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li><li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li><li>Schagger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li><li>Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B., Aebersold, R., Steimle, V., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+Blue+native/SDS+gel+electrophoresis+of+multi-protein+complexes+from+whole+cellular+lysates:+a+proteomics+approach.">Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).</li><li>Liu, F., Rijkers, D. T., Post, H., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+profiling+of+protein+assemblies+by+cross-linking+mass+spectrometry.">Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross-linking mass spectrometry.</a> Nat Methods. 12 (12), 1179-1184 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Qui, si descrive l&#39;utilizzo di purificazione di affinità seguita da elettroforesi su gel nativo blu in combinazione con la spettrometria di massa quantitativa per risolvere complessi proteici. Questo approccio offre un metodo di svelare elenchi interazione proteina unidimensionali in assiemi proteina funzionale. Dimostriamo il metodo basato sull&#39;utilizzo di proteine ​​epitopo-tag. Tuttavia, se una linea cellulare che esprime una proteina tag non è disponibile, in alternativa potrebbe essere quella di utilizzare gli anticorpi contro la proteina di interesse, purché vi sia un peptide a disposizione per raggiungere eluizione competitiva nativo. La quantità di materiale di partenza e la quantità di perline potrebbe essere necessario modificare a seconda del livello di espressione della proteina bersaglio. Noi di solito effettuare questo protocollo con 2-5 x 10 8 cellule materiale di partenza, e questo è sufficiente anche per le proteine a basso livello di espressione. La composizione del tampone di lisi dovrebbe essere scelto empiricamente per ottenerevicino alla completa solubilizzazione dell&#39;esca. Questo potrebbe essere difficile per alcuni tipi di proteine, in particolare legame cromatina o proteine ​​di membrana. Opzioni alternative includono l&#39;aumento della quantità di sale, purché il complesso proteina in esame è stabile in alto sale, o utilizzando sonicazione e / o il trattamento nucleasi per cromatina proteine leganti 20, 29. Nel caso delle proteine di membrana, il passaggio detersivo DDM o digitonina può essere consigliabile 30. Nel caso di legame al DNA proteine, è utile includere un nucleasi come benzonasi durante la fase di purificazione 20. La rimozione completa di acidi nucleici assicura che le interazioni rilevate si verificano tra le proteine ​​e non sono mediati da DNA. Un elemento fondamentale da considerare quando si utilizza questo approccio è la stabilità del complesso sotto inchiesta. La procedura è lunga e può comportare preserving proteina overnight complesso. Abbiamo raggiunto un buon successo con due complessi di rimodellamento della cromatina (D. Bode e M. Pardo, dati non mostrati), ma questo deve essere valutato. La fase di purificazione per affinità può essere abbreviato se necessario. tecniche alternative che consentono frazionamento nativo, come cromatografia di esclusione dimensionale, sono stati ampiamente utilizzati per oltre 50 anni per caratterizzare complessi proteici. Noi e altri hanno dimostrato che la risoluzione del blu PAGE nativa è superiore a quella ottenuta mediante cromatografia di esclusione dimensionale 20, 31, 32, 33. Un altro vantaggio di blu PAGINA nativa è che non richiede sistemi di cromatografia, che sono costosi, ma piuttosto utilizza proteine ​​attrezzature elettroforetico che è molto diffusa nei laboratori. In termini di hands-on tempo, questo metodo non comporta più lavoro rispetto al tradizionale geLC-MS / MS unAPPROCCIO o offline cromatografica frazionamento. Tuttavia, come la maggior parte delle tecniche di frazionamento fanno, ha un limite alla loro risoluzione. Complessi che sono molto omogenei o chiudere in massa e la forma può essere oltre la risoluzione offerta dal blu PAGE nativa, e quindi il protocollo come riportato qui potrebbe non essere universalmente riuscito a risolvere complessi distinti con subunità condivisi. È incoraggiante, abbiamo avuto successo nel separare due complessi tetrameriche molto simili che condividono tre subunità (M. Pardo, manoscritto in preparazione). Poiché spettrometria di massa è diventata sempre più sensibile, anche piccole quantità di interattori e contaminanti non specifici possono essere rilevati in campioni di AP-MS. L&#39;approccio qui presentato potrebbe aiutare nel discriminare interattori reali dalla contaminazione di fondo nella purificazione di affinità focalizzando l&#39;attenzione sulle proteine ​​con picchi di migrazione che coincidono con picchi di migrazione esche a più alto peso molecolare di quello dile proteine ​​monomeriche. Diversi gruppi hanno utilizzato tecniche di frazionamento seguite da proteine correlazione profilatura a delineare complessi proteici in scala cellulare senza bisogno di precedente isolamento 10, 11, 12, 34. Tuttavia, ciò può comportare il mancato rilevamento interazioni sub-stechiometrico. L&#39;incorporazione di una fase di arricchimento attraverso la purificazione di affinità può aiutare a superare questo. L&#39;approccio qui descritto dovrebbe essere generalmente utile per esplorare la topologia di complessi proteici e disfare le molteplici complessi una data proteina partecipa nello stesso contesto cellulare. La strategia è semplice e suscettibili di laboratori che non possono avere costose apparecchiature di frazionamento cromatografico per risolvere complessi proteici.

Nelle cellule, maggior parte delle proteine ​​svolgere le loro funzioni attraverso transitori interazioni proteina-proteina o formando complessi proteici stabili. Caratterizzare le interazioni delle proteine ​​è fondamentale per i processi cellulari completamente comprensione. purificazione di affinità in combinazione con la spettrometria di massa (AP-SM) è una delle strategie più comunemente applicati per identificare le interazioni proteina nativa. Miglioramenti significativi nella capacità dello strumento raggiunti negli ultimi dieci anni hanno reso questo approccio estremamente potente. E &#39;importante notare che le interazioni identificate da esperimenti di AP-MS comprendono una miscela di associazioni dirette e indirette tra esche e prede. Inoltre, spesso proteine ​​partecipano a numerosi complessi diversi all&#39;interno dello stesso contesto cellulare, che potrebbero avere diversi ruoli biologici, e quindi le interattori identificati da AP-MS possono rappresentare una miscela di complessi proteici distinte o entità funzionali. Non è possibile derivaretali informazioni topologica a priori dalle liste mono-dimensionale di proteine generati da semplici esperimenti AP-MS. Tuttavia, la tecnica può essere sfruttata ulteriormente per definire l&#39;architettura di complessi proteici combinandolo con uno o più metodi per risolvere questi gruppi. Al fine di risolvere la topologia delle interazioni proteiche individuati attraverso AP-MS, sono stati applicati diverse strategie. Un approccio è quello di eseguire esperimenti iterativi AP-MS utilizzando le prede identificati in un precedente round di esperimenti come esche 1. Anche se molto informativo, questo è piuttosto un compito alta intensità di lavoro sia sperimentalmente e analiticamente. Proteina reticolazione in combinazione con la spettrometria di massa è sempre più utilizzata per ricavare informazioni topologiche su complessi proteici 2, 3, 4, 5. Tuttavia, computatioanalisi nale peptidi reticolati rimane ancora un compito impegnativo e quindi è il collo di bottiglia nel flusso di lavoro. L&#39;avvento di MS-scindibili reagenti di reticolazione dovrebbe facilitare la mappatura dei residui di amminoacidi che si trovano in prossimità di proteine interagenti 6, 7. Un&#39;altra alternativa è quella di combinare la purificazione per affinità con le precedenti tecniche di separazione ortogonali 8, 9. Frazionamento cromatografico mediante gel filtrazione o scambio ionico, o saccarosio frazionamento gradiente sono recentemente stato usato in combinazione con la spettrometria di massa quantitativa per descrivere complessi multiproteici a livello di tutto il sistema, by-passando la fase di complesso di isolamento 10, 11, 12, 13. Blu gel di poliacrilammide nativo elettroforesi (BN-PAGE) è stato ampiamente applicato aindagare le interazioni proteina nativa, in genere quelli che coinvolgono membrana mitocondriale complessi proteici 14. Questa tecnica di separazione è stato recentemente utilizzato in combinazione con quantificazione della proteina priva di etichetta e correlazione profilatura, non solo su complessi mitocondriali 15, 16, 17, ma anche per dipanare altri complessi proteici da cellule intere 18, 19. Abbiamo ipotizzato che la combinazione di purificazione di affinità con i successivi approcci frazionamento nativi e MS quantitativa dovrebbe fornire una strategia utile per risolvere più assembly proteina contenente una particolare proteina. Qui si descrive un metodo che combina nucleo purificazione per affinità epitopo-based con blu nativo elettroforesi su gel di poliacrilammide dei complessi isolati, seguita da sp massa quantitativaectrometry e proteine ​​correlazione profilatura, per risolvere i più assembly una proteina potrebbe essere coinvolta. Impieghiamo cellule staminali embrionali di topo in cui una proteina di interesse fusa ad un epitopo è espresso dal locus endogeno per ottenere vicino all&#39;abbondanza fisiologica e garantire nativo efficiente isolamento complesso. Questo approccio svela i molteplici interazioni proteina impegna in, risolverli in assiemi distinti sulla base dei loro profili di correlazione, mentre non richiede più lavoro rispetto ai tradizionali geLC-MS 20.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1384">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Protein G Dynabeads</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">10003D</td>
			<td style="width:452px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">FLAG antibody M2</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">F1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Tween-20, protein grade, 10% solution</td>
			<td style="width:285px;">Millipore</td>
			<td style="width:220px;">655206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Dimethyl pimelimidate</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">80490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">0.2 M Triethanolamine buffer, pH 8.2</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">T0449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">3x FLAG peptide</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">F4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Vivaspin 5K NMWCO, PES</td>
			<td style="width:285px;">Sartorius</td>
			<td style="width:220px;">VS0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">NativePAGE 3-12% Bis-Tris gel</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">20x NativePAGE Running Buffer</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">20x NativePAGE Cathode Additive</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">4x NativePAGE sample loading buffer</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">NativeMARK</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">LC0725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NativePAGE 5% G-250 sample additive&#160;</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Nunc conical bottom 96-well plate, polypropylene</td>
			<td style="width:285px;">Thermo</td>
			<td style="width:220px;">249944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Multiscreen HTS 96-well filtration system</td>
			<td style="width:285px;">Thermo</td>
			<td style="width:220px;">MSDVN6550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Nunc 96-well cap natural</td>
			<td style="width:285px;">Thermo</td>
			<td style="width:220px;">276002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride)</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Acetonitrile, HPLC grade</td>
			<td style="width:285px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">A/0627/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Trypsin, sequencing grade</td>
			<td style="width:285px;">Roche</td>
			<td style="width:220px;">11418475001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Software</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">MaxQuant (software)</td>
			<td style="width:285px;">N.A.</td>
			<td style="width:220px;">N.A.</td>
			<td style="width:452px;">http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Perseus (software)</td>
			<td style="width:285px;">N.A.</td>
			<td style="width:220px;">N.A.</td>
			<td style="width:452px;">http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

resolving affinity purified protein complexes by blue native page and protein correlation profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Il flusso di lavoro della purificazione di affinità Blu nativa delle proteine Correlazione profilatura mediante spettrometria di massa (ABC-MS) strategia è rappresentata in figura 7. complessi proteici nativi intorno ad una proteina di interesse sono isolati da purificazione per affinità utilizzando anticorpi contro un tag epitopo (in questo caso FLAG) ed eluizione competitivo. I complessi si risolvono con BN-PAGE, e tutta la corsia di gel viene asportato in 48 sezioni, e preparati per il fucile da caccia LC-MS / MS. Quantitative informazioni MS viene utilizzato per generare un profilo di migrazione per ogni proteina identificata attraverso la separazione nativo blu. Proteine ​​che interagiscono per formare un distinti profili migratori simili visualizzazione complesso con picchi sovrapponibili. Quando una proteina di interesse partecipa a più di un assemblaggio, picchi multipli si osservano nel suo profilo migrazione, date le sotto-complessi sono nel potere di risoluzione del gel nativo blu. Un confronto sistematico del migprofili razione può essere ottenuto mediante correlazione proteina profilatura usando clustering gerarchico. Dendrogramma e l&#39;intensità dei picchi per tutte le frazioni vengono visualizzati in una mappa termica, facilitando l&#39;identificazione di proteine interagenti che appartengono a distinti complessi proteici (Figura 8). Abbiamo usato questa strategia per analizzare i partner che interagiscono di MTA2, una subunità nucleo della cromatina nurd rimodellamento complesso 20. Come mostrato in figura 9, il profilo di migrazione MTA2 visualizzata due picchi di intensità distinti tra 700 kDa e 1,2 MDa, con il picco di massa inferiore visualizzazione maggiore abbondanza. Altre subunità nucleo nurd, tra mta1 / 3, HDAC1 / 2 e Mbd3, mostravano modello separazione identici, sebbene i picchi per alcune delle subunità, cioè Chd4, Gatad2a / b e Rbbp4 / 7, avevano la distribuzione abbondanza inversa (Figura 9A, B). Al contrario, il profilo di Cdk2ap1, un fattore di regolazione che recluta il complesso nurd di promotori genici Wnt 23, visualizzato solo il picco di massa superiore (Figura 9C), e così pure SALL4, un repressore trascrizionale che ha anche dimostrato di impegnare nurd 20, 24, 25. Così, frazionamento di affinità purificate proteine ​​MTA2-associata di blu PAGE nativa è riuscito a risolvere due diverse forme del complesso nurd. ABC-MS permette anche l&#39;identificazione di nuovi interattori mentre assegnandoli a particolari entità proteiche. Attraverso l&#39;esame dei cluster proteine e intensità frazione rappresentata in una mappa termica abbiamo rilevato una forte correlazione tra subunità nurd e Wdr5, una subunità regolatrice del complesso metiltransferasi MLL 26, con Wdr5 visualizzazione due picchi migrazione coincidenti con i due nurd peaks (Figura 8), suggerendo una nuova interazione tra Wdr5 e nurd. Abbiamo confermato questa interazione mediante co-immunoprecipitazione e co-migrazione cromatografia di esclusione dimensionale 20. La scelta di calcolo della metrica distanza nel clustering gerarchico influenzerà la forma dei cluster e quindi le correlazioni. Si consiglia di sperimentare le diverse metriche per raggiungere la migliore forma con la conoscenza dell&#39;interazione esistente della proteina o complessi di interesse. Generalmente abbiamo ottenuto risultati migliori con il Manhattan (L1) distanza metrica 20. Correlazione di Pearson o metriche distanza euclidea sono stati riportati anche per identificare complessi basati su tecniche di frazionamento alternative 10, 11, 12. la quandati titative MS ottenuti da frazioni native blu possono anche essere utilizzati per determinare la stechiometria dei complessi proteici. Il valore iBAQ (intensità basato assoluta quantificazione) fornisce una misura della relativa abbondanza di proteine identificate 27, 28. I valori iBAQ per la proteina membri complessi in tutte le frazioni all&#39;interno di un profilo di migrazione picco vengono normalizzati a quella della proteina esca per ottenere quantità relative. I iBAQs normalizzati attraverso un profilo di picco di un membro complessa data proteina dovrebbero seguire un andamento orizzontale, e i valori delle curve riflettere la stechiometria delle proteine ​​interagenti relativi alla proteina esca. Per una rappresentazione più dettagliata di calcoli stechiometrici, vedi 20. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig7.jpg" /> Figura 7: Schema flusso che sintetizza l&#39;ABC-MS sSTRATEGIA. Questa figura è modificata da 20. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig7large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig8.jpg" /> Figura 8. raggruppamento gerarchico dei profili migratori BN-PAGE di interattori MTA2. proteine ​​MTA2-associati sono stati raggruppati in base alla somiglianza delle loro profili migratori. È mostrata solo un sottoinsieme della mappa termica contenente il complesso nurd (racchiuso nella scatola blu). La scatola gialla evidenzia la forte correlazione del Wdr5 con il complesso nurd. I pesi molecolari annotati sono stati stimati dalle distanze di migrazione degli standard proteine ​​eseguite sullo stesso gel. Questa ricerca è stato originariamente pubblicato in molecolare e cellulare Proteomica 20 l&#39;American Society for Biochimica e Mo<html> Biologia lecular. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig8large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig9.jpg" /> Figura 9. BN-PAGE profilo migrazione delle subunità nurd e proteine associate. A) subunità MTA2 e nurd presenti in un modello simile intensità. B) MTA2 e nurd subunità con il modello intensità inversa. C) MTA2 e Cdk2ap1, che è presente solo nell&#39;entità nurd peso molecolare superiore. I pesi molecolari annotati sono stati stimati dal profilo migrazione degli standard proteina. Questa ricerca è stato originariamente pubblicato in Cellular Proteomics 20 l&#39;American Society for Biochimica e Biologia Molecolare Molecolare e._blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="File supplementare" src="/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.jpg" /> Dati supplementari: set di dati campione. MaxQuant-derivato del file contenente proteingroups.txt identificazioni di proteine ​​e valori di quantificazione da un esperimento ABC-MS. Questa ricerca è stato originariamente pubblicato in Cellular Proteomics 20 l&#39;American Society for Biochimica e Biologia Molecolare Molecolare e. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.txt" target="_blank">Cliccate qui per scaricare questo file.</a>

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Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Presentiamo qui protocolli per purificazione per affinità di complessi proteici e la loro separazione dal blu PAGE nativa, seguiti da proteine ​​correlazione profilatura mediante un&#39;etichetta disponibile spettrometria di massa quantitativa. Questo metodo è utile per risolvere interattomi in distinti complessi proteici.

Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine ​​correlazione Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

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