Name: resolving affinity purified protein complexes by blue native page and protein correlation profiling
Uploaded: 2017-04-01T12:30:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling at JoVE.com

This work was funded by the Wellcome Trust (WT098051).

<ol>
	<li>Goudreault, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PP2A+phosphatase+high+density+interaction+network+identifies+a+novel+striatin-interacting+phosphatase+and+kinase+complex+linked+to+the+cerebral+cavernous+malformation+3+(CCM3)+protein.">A PP2A phosphatase high density interaction network identifies a novel striatin-interacting phosphatase and kinase complex linked to the cerebral cavernous malformation 3 (CCM3) protein.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (1), 157-171 (2009).</li><li>Leitner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+native+protein+structures+by+chemical+cross-linking,+mass+spectrometry,+and+bioinformatics.">Probing native protein structures by chemical cross-linking, mass spectrometry, and bioinformatics.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (8), 1634-1649 (2010).</li><li>Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginning+of+a+beautiful+friendship:+cross-linking/mass+spectrometry+and+modelling+of+proteins+and+multi-protein+complexes.">The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes.</a> J Struct Biol. 173 (3), 530-540 (2011).</li><li>Sinz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+cross-linking+and+mass+spectrometry+to+map+three-dimensional+protein+structures+and+protein-protein+interactions.">Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions.</a> Mass Spectrom Rev. 25 (4), 663-682 (2006).</li><li>Walzthoeni, T., Leitner, A., Stengel, F., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+supported+determination+of+protein+complex+structure.">Mass spectrometry supported determination of protein complex structure.</a> Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 252-260 (2013).</li><li>Kaake, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vivo+cross-linking+mass+spectrometry+platform+to+define+protein-protein+interactions+in+living+cells.">A new in vivo cross-linking mass spectrometry platform to define protein-protein interactions in living cells.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3533-3543 (2014).</li><li>Kao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+cross-linking+strategy+for+fast+and+accurate+identification+of+cross-linked+peptides+of+protein+complexes.">Development of a novel cross-linking strategy for fast and accurate identification of cross-linked peptides of protein complexes.</a> Mol Cell Proteomics. 10 (1), (2011).</li><li>Hughes, M. A., Langlais, C., Cain, K., MacFarlane, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterisation+and+reconstitution+of+cell+death+signalling+complexes.">Isolation, characterisation and reconstitution of cell death signalling complexes.</a> Methods. 61 (2), 98-104 (2013).</li><li>Lim, S., Zou, Y., Friedman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+activator+Mirk/Dyrk1B+is+sequestered+by+p38alpha/beta+MAP+kinase.">The transcriptional activator Mirk/Dyrk1B is sequestered by p38alpha/beta MAP kinase.</a> J Biol Chem. 277 (51), 49438-49445 (2002).</li><li>Havugimana, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+census+of+human+soluble+protein+complexes.">A census of human soluble protein complexes.</a> Cell. 150 (5), 1068-1081 (2012).</li><li>Kirkwood, K. J., Ahmad, Y., Larance, M., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+native+protein+complexes+and+protein+isoform+variation+using+size-fractionation-based+quantitative+proteomics.">Characterization of native protein complexes and protein isoform variation using size-fractionation-based quantitative proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3851-3873 (2013).</li><li>Kristensen, A. R., Gsponer, J., Foster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+approach+for+measuring+temporal+changes+in+the+interactome.">A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome.</a> Nat Methods. 9 (9), 907-909 (2012).</li><li>Liu, F., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+the+architecture+of+protein+assemblies+and+protein+interaction+networks+by+cross-linking+mass+spectrometry.">Interrogating the architecture of protein assemblies and protein interaction networks by cross-linking mass spectrometry.</a> Curr Opin Struct Biol. 35, 100-108 (2015).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions.">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li><li>Heide, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexome+profiling+identifies+TMEM126B+as+a+component+of+the+mitochondrial+complex+I+assembly+complex.">Complexome profiling identifies TMEM126B as a component of the mitochondrial complex I assembly complex.</a> Cell Metab. 16 (4), 538-549 (2012).</li><li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+953+human+proteins+from+a+mitochondrial+HEK293+fraction+by+complexome+profiling.">Analysis of 953 human proteins from a mitochondrial HEK293 fraction by complexome profiling.</a> PLoS One. 8 (7), 68340 (2013).</li><li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC-MS/MS+as+an+alternative+for+SDS-PAGE+in+blue+native+analysis+of+protein+complexes.">LC-MS/MS as an alternative for SDS-PAGE in blue native analysis of protein complexes.</a> Proteomics. 9 (17), 4221-4228 (2009).</li><li>Remmerie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+tobacco+BY-2+protein+complexes+with+BN+PAGE/LC-MS/MS+and+clustering+methods.">Unraveling tobacco BY-2 protein complexes with BN PAGE/LC-MS/MS and clustering methods.</a> J Proteomics. 74 (8), 1201-1217 (2011).</li><li>Sessler, N., Krug, K., Nordheim, A., Mordmuller, B., Macek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Plasmodium+falciparum+proteasome+using+Blue+Native+PAGE+and+label-free+quantitative+mass+spectrometry.">Analysis of the Plasmodium falciparum proteasome using Blue Native PAGE and label-free quantitative mass spectrometry.</a> Amino Acids. 43 (3), 1119-1129 (2012).</li><li>Bode, D., Yu, L., Tate, P., Pardo, M., Choudhary, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Two+Distinct+Nucleosome+Remodeling+and+Deacetylase+(NuRD)+Complex+Assemblies+in+Embryonic+Stem+Cells.">Characterization of Two Distinct Nucleosome Remodeling and Deacetylase (NuRD) Complex Assemblies in Embryonic Stem Cells.</a> Mol Cell Proteomics. 15 (3), 878-891 (2016).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+the+MaxQuant+computational+platform+for+SILAC-based+quantitative+proteomics.">A practical guide to the MaxQuant computational platform for SILAC-based quantitative proteomics.</a> Nat Protoc. 4 (5), 698-705 (2009).</li><li>Kim, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+regulatory+factor+recruits+the+nucleosome+remodeling+complex+to+wingless+integrated+(Wnt)+signaling+gene+promoters+in+mouse+embryonic+stem+cells.">A novel regulatory factor recruits the nucleosome remodeling complex to wingless integrated (Wnt) signaling gene promoters in mouse embryonic stem cells.</a> J Biol Chem. 287 (49), 41103-41117 (2012).</li><li>Lauberth, S. M., Rauchman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+12-amino+acid+motif+in+Sall1+recruits+the+nucleosome+remodeling+and+deacetylase+corepressor+complex.">A conserved 12-amino acid motif in Sall1 recruits the nucleosome remodeling and deacetylase corepressor complex.</a> J Biol Chem. 281 (33), 23922-23931 (2006).</li><li>Miller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sall4+controls+differentiation+of+pluripotent+cells+independently+of+the+Nucleosome+Remodelling+and+Deacetylation+(NuRD)+complex.">Sall4 controls differentiation of pluripotent cells independently of the Nucleosome Remodelling and Deacetylation (NuRD) complex.</a> Development. 143 (17), 3074-3084 (2016).</li><li>Dharmarajan, V., Lee, J. H., Patel, A., Skalnik, D. G., Cosgrove, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+WDR5+interaction+(Win)+motif+recognition+in+human+SET1+family+histone+methyltransferases.">Structural basis for WDR5 interaction (Win) motif recognition in human SET1 family histone methyltransferases.</a> J Biol Chem. 287 (33), 27275-27289 (2012).</li><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Smits, A. H., Jansen, P. W., Poser, I., Hyman, A. A., Vermeulen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+chromatin-associated+protein+complexes+revealed+by+label-free+quantitative+mass+spectrometry-based+proteomics.">Stoichiometry of chromatin-associated protein complexes revealed by label-free quantitative mass spectrometry-based proteomics.</a> Nucleic Acids Res. 41 (1), 28 (2013).</li><li>Lambert, J. P., Tucholska, M., Pawson, T., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+DNA+shearing+in+standard+affinity+purification+allows+simultaneous+identification+of+both+soluble+and+chromatin-bound+interaction+partners.">Incorporating DNA shearing in standard affinity purification allows simultaneous identification of both soluble and chromatin-bound interaction partners.</a> J Proteomics. 100, 55-59 (2014).</li><li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+PAGE.">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li><li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li><li>Schagger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li><li>Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B., Aebersold, R., Steimle, V., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+Blue+native/SDS+gel+electrophoresis+of+multi-protein+complexes+from+whole+cellular+lysates:+a+proteomics+approach.">Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).</li><li>Liu, F., Rijkers, D. T., Post, H., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+profiling+of+protein+assemblies+by+cross-linking+mass+spectrometry.">Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross-linking mass spectrometry.</a> Nat Methods. 12 (12), 1179-1184 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Здесь мы опишем использование аффинной очистки с последующим синим электрофореза нативного гель в сочетании с количественной масс-спектрометрии для решения белковых комплексов. Этот подход предлагает способ распутать одномерные списки взаимодействия белка в функциональных белковых агрегатов. Мы демонстрируем метод, основанный на использовании эпитопов меченых белков. Однако, если линия клеток, экспрессирующих белок, помеченный не доступна, альтернативой может быть использование антител против белка, представляющего интерес, при условии, есть пептид, доступный для достижения нативный конкурентного элюирования. Количество исходного материала и количества гранул, возможно, должно быть изменено в зависимости от уровня экспрессии белка-мишени. Мы обычно выполняют этот протокол с 2-5 × 10 8 клеток исходного материала, и этого достаточно даже для белков с низким уровнем экспрессии. Состав буфера для лизиса должен быть выбран эмпирический для достижениярядом с полной солюбилизации приманки. Это может быть сложным для некоторых типов белков, в частности хроматина связывания или мембранных белков. Альтернативные варианты включают в себя увеличение количества соли, при условии , что сложный белок при исследовании устойчиво в высокой концентрации соли, или с помощью ультразвука и / или лечения нуклеазы для хроматина связывающих белков 20, 29. В случае мембранных белков, переключая моющее средство DDM или дигитонину может быть целесообразным 30. В случае ДНК - связывающие белки, это полезно включать нуклеазу , такую как бензоназу во время стадии очистки 20. Полное удаление нуклеиновых кислот гарантирует, что взаимодействие обнаруженное происходит между белками и не опосредованы ДНК. Критический элемент следует учитывать при использовании этого подхода является стабильность комплекса под следствием. Процедура долго и может включать в себя preservinг белка комплекс в течение ночи. Мы достигли хороших успехов с двух хроматина комплексов (Д. Боде и М. Пардо, данные не показаны), но это должно быть оценено. Стадия аффинной очистки может быть сокращена, если это необходимо. Альтернативные методы, позволяющие родное фракционирование, такие как гель-проникающая хроматография, которые широко используются в течение более 50 лет, чтобы охарактеризовать белковые комплексы. Мы и другие показали , что разрешение синего нативного PAGE превосходит , что достигается с помощью эксклюзионной хроматографии на 20, 31, 32, 33. Еще одно преимущества голубого нативного ПААГА является то, что он не требует системы хроматографии, которые являются дорогостоящими, а использует белка электрофоретическое оборудование, которое широко распространен в лабораториях. С точки зрения практического времени, этот метод не предполагает больше работы, чем традиционные НЕЛЦ-MS / MS аpproach или отсутствует хроматографического фракционирования. Однако, как и большинство методов фракционирования, она имеет предел их разрешения. Комплексы, которые очень однородна или близки по массе и форме, может быть за разрешением, предложенной синим нативного ПААГ, и, следовательно, протокол, как сообщалось здесь не может быть универсально успешным в решении различных комплексов с общими субъединиц. Обнадеживает то, что мы добились успеха в выделении двух очень похожих тетрамерные комплексов обмена трех субъединиц (М. Пардо, рукописи в процессе подготовки). Так как масс-спектрометрия становится все более чувствительным, даже незначительные количества неспецифических interactors и загрязняющих веществ могут быть обнаружены в образцах АП-MS. Подход, представленный здесь, может помочь в различении реальных interactors от фонового загрязнения в аффинных очистках, сосредоточив внимание на белках с миграционными пиками, совпадающий с приманкой миграции пиками при более высокой молекулярной массе, чем умономерные белки. Несколько групп использовали методы фракционирования с последующими профилированием белка корреляции очертить белковые комплексы на клеточном уровне без необходимости предварительного выделения 10, 11, 12, 34. Тем не менее, это может привести к невозможности обнаружить суб-стехиометрических взаимодействия. Включение обогащения, шаг через аффинной очистки может помочь преодолеть это. Описанный здесь подход должен быть в целом полезен для изучения топологии белковых комплексов и разгадывая множество комплексов данного белка принимает участие в пределах одной и той же сотовой связи. Стратегия проста и поддающийся лабораторию, которые не могут иметь дорогое хроматографическое фракционирование оборудования для решения белковых комплексов.

В клетках, большинство белков выполняют свои функции через транзиторных белок-белковых взаимодействий, или путем формирования стабильных белковых агрегатов. Характеризуя белковые взаимодействия имеет решающее значение для полного понимания клеточных процессов. Сродство очистки в сочетании с масс-спектрометрией (AP-MS) является одним из наиболее часто применяемых стратегий для выявления нативные белковых взаимодействий. Значительные улучшения в возможностях инструментов, достигнутых в последнее десятилетие сделали этот подход чрезвычайно мощным. Важно отметить, что взаимодействия, выявленные в экспериментах AP-MS включают смесь прямых и косвенных ассоциаций между приманкой и охотится. Кроме того, часто белки принимают участие в нескольких различных комплексов в пределах одной и той же сотовой связи, которые могут иметь различные биологические функции, и, следовательно, interactors, которые определены с помощью AP-MS может представлять собой смесь различных белковых агрегатов или функциональных объектов. Это не возможно получитьтакая топологическая информация априори из моно-мерных списков белков , полученных с помощью простых экспериментов AP-MS. Тем не менее, этот метод может быть использован в дальнейшем, чтобы определить архитектуру белковых комплексов путем объединения его с одним или несколькими способами, чтобы решить эти сборки. Для решения топологии белковых взаимодействий, определенных с помощью AP-MS, несколько стратегий, которые были применены. Один из подходов заключаются в выполнении итеративных экспериментов AP-MS с использованием охотится , указанные в предыдущем туре экспериментов , как приманки 1. Хотя очень информативный, это довольно интенсивная задача труда экспериментально и аналитически. Белок сшивание в сочетании с масс - спектрометрией все чаще используется для получения топологической информации о белковых комплексов 2, 3, 4, 5. Тем не менее, computatioNAL анализ сшитых пептидов по-прежнему остается сложной задачей, и, следовательно, является узким местом в процессе. Появление МС-расщепляемые сшивающих реагентов должно облегчить отображение аминокислотных остатков , которые находятся в непосредственной близости от взаимодействующих белков в 6, 7. Другой альтернативой является сочетание аффинной очистки с предыдущими методами разделения ортогональных 8, 9. Хроматографическое фракционирование с помощью гель - фильтрации или ионного обмена, или градиенте сахарозы фракционирования также недавно были использованы в сочетании с количественным масс - спектрометрии для описания мультибелковых комплексов на уровне всей системы, минуя сложный этап изоляции 10, 11, 12, 13. Электрофорез Синий гель родной полиакриламид (BN-PAGE) широко применяется дляисследовать нативные белковые взаимодействия, как правило , те , которые вовлекают митохондриальную мембрану белковых комплексов 14. Этот метод разделения был также недавно использован в сочетании с этикеткой , свободной от белков и количественной оценкой корреляции профилирования, а не только на митохондриальных комплексах 15, 16, 17, но и для распутывания других белковых комплексов из целых клеток 18, 19. Мы предположили, что комбинация аффинной очистки с последующими нативными подходами фракционирования и количественным MS должна обеспечивать полезную стратегию для решения нескольких сборок белков, содержащих конкретный белок. Здесь мы опишем метод, который сочетает в себе общий эпитоп на основе аффинной очистки с синим нативного электрофореза в полиакриламидном геле выделенных комплексов, с последующим количественным массового зрectrometry и белок корреляция профилирование, чтобы решить многочисленные сборки белок, может быть задействованы. Мы используем мышиные эмбриональные стволовые клетки, где интерес белок слит с эпитоп теге экспрессируется эндогенным локус для достижения близких к физиологическому изобилию и обеспечить эффективную уроженку комплекс изоляции. Этот подход распутывает множественные взаимодействия белка участвует в, разрешая их в различные сборки на основе их корреляция профилей, в то время как не требующие больше работы , чем обычные НЕЦЫ-MS 20.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1384">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Protein G Dynabeads</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">10003D</td>
			<td style="width:452px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">FLAG antibody M2</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">F1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Tween-20, protein grade, 10% solution</td>
			<td style="width:285px;">Millipore</td>
			<td style="width:220px;">655206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Dimethyl pimelimidate</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">80490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">0.2 M Triethanolamine buffer, pH 8.2</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">T0449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">3x FLAG peptide</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">F4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Vivaspin 5K NMWCO, PES</td>
			<td style="width:285px;">Sartorius</td>
			<td style="width:220px;">VS0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">NativePAGE 3-12% Bis-Tris gel</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">20x NativePAGE Running Buffer</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">20x NativePAGE Cathode Additive</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">4x NativePAGE sample loading buffer</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">NativeMARK</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">LC0725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NativePAGE 5% G-250 sample additive&#160;</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Nunc conical bottom 96-well plate, polypropylene</td>
			<td style="width:285px;">Thermo</td>
			<td style="width:220px;">249944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Multiscreen HTS 96-well filtration system</td>
			<td style="width:285px;">Thermo</td>
			<td style="width:220px;">MSDVN6550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Nunc 96-well cap natural</td>
			<td style="width:285px;">Thermo</td>
			<td style="width:220px;">276002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride)</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Acetonitrile, HPLC grade</td>
			<td style="width:285px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">A/0627/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Trypsin, sequencing grade</td>
			<td style="width:285px;">Roche</td>
			<td style="width:220px;">11418475001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Software</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">MaxQuant (software)</td>
			<td style="width:285px;">N.A.</td>
			<td style="width:220px;">N.A.</td>
			<td style="width:452px;">http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Perseus (software)</td>
			<td style="width:285px;">N.A.</td>
			<td style="width:220px;">N.A.</td>
			<td style="width:452px;">http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

resolving affinity purified protein complexes by blue native page and protein correlation profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Рабочий процесс аффинной очистки Синий профилирования нативный белок корреляции методом масс - спектрометрии (АВС-МС) стратегия показана на рисунке 7. Коренные белковые комплексы вокруг интересующего белка изолированы с помощью аффинной очистки с использованием антител против эпитопов тега (в данном случае FLAG) и конкурентного элюирования. Комплексы разрешаются BN-PAGE, и весь гель полосы вырезают на 48 секций, и подготовлены к Ружье LC-MS / MS. Количественные данные МСА используются для создания профиля миграции для каждого идентифицированного белка через голубое родное разделение. Белки, которые взаимодействуют с образованием различных комплексных отображения аналогичных профилей миграции с наложимо пиками. Когда интересующий белок принимает участие в более чем одной сборки, множественные пики наблюдаются в его миграции профиль, учитывая суб-комплексы находятся в пределах разрешающей способности голубого нативного геля. Систематическое сравнение МИГПрофили рацион может быть достигнуто за счет корреляции белка профилирования с использованием иерархической кластеризации. Дендрограммы и интенсивности пиков для всех фракций визуализируются в тепловой карте, что облегчают идентификацию взаимодействующих белков , которые принадлежат к различным белковым комплексам (Рисунок 8). Мы использовали эту стратегию для анализа взаимодействующих партнеров mta2, основной субъединица NuRD хроматина комплекса 20. Как показано на рисунке 9, профиль миграции mta2 показаны два пика различных интенсивностей между 700 кДа и 1,2 МДа, с меньшей массой пика , где отображаются более высокую численность. Другая основные NuRD субъединица, в том числе mta1 / 3, HDAC1 / 2 и mbd3, показала одинаковую картину разделения, хотя и пики для некоторых из субъединиц, а именно chd4, Gatad2a / б и rbbp4 / 7, имели обратное распределение численности (9, Б). В отличие от этого, профиль Cdk2ap1, регулирующий фактор , который принимает на работу NuRD комплекса к Wnt промоторов генов 23, отображается только более высокий массовый пик (рис 9c), и так же, Sall4 репрессор транскрипции , что также было показано , чтобы связать NuRD 20, 24, 25. Таким образом, фракционирование аффинных очищенных mta2 белков, ассоциированные с синим нативным ПААГОМ удалось решить две различных формы NuRD комплекса. АВС-МС также позволяет идентифицировать новые interactors в то время присвоения им определенных белковых образований. Через рассмотрения белков кластеров и интенсивностей фракций , представленных в тепловой карте мы обнаружили сильную корреляцию между NuRD субъединиц и WDR5, регуляторной субъединицей комплекса метилтрансферазы MLL 26, с WDR5 , отображающих два пика миграции совпадает с два р NuRDeaks (Фигура 8), предполагая новое взаимодействие между WDR5 и NuRD. Мы подтвердили это взаимодействие путем совместной иммунопреципитации и совместной миграции в вытеснительной хроматографии 20. Выбор расстояния вычислении метрики в иерархической кластеризации будет влиять на форму кластеров и, следовательно, корреляций. Мы рекомендуем поэкспериментировать с различными метриками для достижения наилучшего соответствия с имеющимися знаниями взаимодействия белка или комплекса интереса. Как правило , мы добились наилучших результатов с Manhattan (L1) расстояния метрики 20. Корреляции Пирсона или евклидовы показатели расстояния также сообщалось для идентификации комплексов на основе методов альтернативы фракционирования 10, 11, 12. цюаньДанные ственный MS, полученные из синих нативных фракций также может быть использованы для определения стехиометрии белковых комплексов. Значение iBAQ (интенсивность на основе абсолютного Количественная) представляет собой меру относительной численности идентифицированных белков 27, 28. Значения iBAQ для белкового комплекса членов во всех фракциях в пределах пика миграции профиля нормированы к тому, что части белка приманки для получения относительных количеств. Нормированное iBAQs через пик профиля для комплексного элемента данного белка должно следовать горизонтальной тенденции, а значения тренда отражает стехиометрию взаимодействующих белков по сравнению с белком приманки. Для более детального представления расчетов стехиометрии см 20. <img alt="Рисунок 7" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig7.jpg" /> Рисунок 7: Схема рабочего процесса обобщения АВС-МС сегии. Этот показатель изменяется от 20. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig7large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig7large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig7large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 8" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig8.jpg" /> Рисунок 8. Иерархическая кластеризация БН-PAGE миграции профилей mta2 interactors. Mta2-ассоциированные белки были сгруппированы на основе сходства их миграции профилей. Только часть тепловой карты, содержащей комплекс NuRD показана (заключенный в синей коробке). Желтый ящик подчеркивает сильную корреляцию WDR5 с NuRD комплексом. Аннотированные молекулярные массы были оценены по миграции расстояний белковых стандартов работают в том же самом геле. Это исследование было первоначально опубликовано в молекулярной и клеточной протеомике 20 Американского общества биохимии и Мо<html> лярных биология. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig8large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig8large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig8large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="На рисунке 9" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig9.jpg" /> Рисунок 9. БН-ПААГ миграции профиля NuRD субъединиц и связанных с ними белков. А) mta2 и NuRD субъединицы , присутствующие на аналогичную схему интенсивности. Б) mta2 и NuRD субъединиц с рисунком обратной интенсивности. С) mta2 и Cdk2ap1, который присутствует только в более высокой молекулярной массой NuRD сущности. Аннотированные молекулярные массы оценивались по миграции профиля стандартов белка. Это исследование было первоначально опубликовано в молекулярной и клеточной протеомики 20 Американского общества биохимии и молекулярной биологии._blank &quot;&gt; Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. <img alt="Справочная файла" src="/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.jpg" /> Справочная данные: Образец набора данных. MaxQuant полученный файл proteingroups.txt, содержащий белковые идентификаций и значения количественного определения из эксперимента АВС-MS. Это исследование было первоначально опубликовано в молекулярной и клеточной протеомики 20 Американского общества биохимии и молекулярной биологии. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.txt" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.txt" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.txt" target="_blank">чтобы скачать этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling at JoVE.com

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Здесь представлены протоколы для аффинной очистки белковых комплексов и их разделения по синим нативного PAGE с последующим профилированием белка корреляции с использованием меток бесплатного количественного масс-спектрометрии. Этот метод полезен для решения интерактомов Into различных белковых комплексов.

Разрешающая Affinity Очищенная Белковые комплексы от Синей Native ПААГ и белка корреляции профилирование

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Белковый комплекс Affinity Capture от Cryomilled клеток млекопитающих

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Тандем аффинной очистки белковых комплексов из эукариотические клетки

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Мультимеру-PAGE: метод для захвата и Разрешающая белковых комплексов в биологических образцах

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Горизонтальный гель-электрофорез для расширенного обнаружения комплексов протеин-РНК

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Сплит BioID — Протеомного анализа контекстно зависимых белковых комплексов в их родной среде сотовой

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 в 1: один шаг очищение сродства для параллельного анализа протеин протеина и белка метаболит комплексов

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Анализ тилакоидной мембраны белковых комплексов, синий родной гель-электрофорез

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Очищение сродства хлоропласта Translocon белковых комплексов с помощью тега крана

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Высокая чувствительность измерение транскрипции фактор ДНК привязки родство по конкурентоспособным титрования, с помощью микроскопии флуоресцирования

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Анализ сворачивание белков, транспорта и деградации в живых клетках, радиоактивных пульс Чейз

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...