Name: resolving affinity purified protein complexes by blue native page and protein correlation profiling
Uploaded: 2017-04-01T12:30:00
Duration: 9 min 35 s
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This work was funded by the Wellcome Trust (WT098051).

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	<li>Goudreault, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PP2A+phosphatase+high+density+interaction+network+identifies+a+novel+striatin-interacting+phosphatase+and+kinase+complex+linked+to+the+cerebral+cavernous+malformation+3+(CCM3)+protein.">A PP2A phosphatase high density interaction network identifies a novel striatin-interacting phosphatase and kinase complex linked to the cerebral cavernous malformation 3 (CCM3) protein.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (1), 157-171 (2009).</li><li>Leitner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+native+protein+structures+by+chemical+cross-linking,+mass+spectrometry,+and+bioinformatics.">Probing native protein structures by chemical cross-linking, mass spectrometry, and bioinformatics.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (8), 1634-1649 (2010).</li><li>Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginning+of+a+beautiful+friendship:+cross-linking/mass+spectrometry+and+modelling+of+proteins+and+multi-protein+complexes.">The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes.</a> J Struct Biol. 173 (3), 530-540 (2011).</li><li>Sinz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+cross-linking+and+mass+spectrometry+to+map+three-dimensional+protein+structures+and+protein-protein+interactions.">Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions.</a> Mass Spectrom Rev. 25 (4), 663-682 (2006).</li><li>Walzthoeni, T., Leitner, A., Stengel, F., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+supported+determination+of+protein+complex+structure.">Mass spectrometry supported determination of protein complex structure.</a> Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 252-260 (2013).</li><li>Kaake, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vivo+cross-linking+mass+spectrometry+platform+to+define+protein-protein+interactions+in+living+cells.">A new in vivo cross-linking mass spectrometry platform to define protein-protein interactions in living cells.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3533-3543 (2014).</li><li>Kao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+cross-linking+strategy+for+fast+and+accurate+identification+of+cross-linked+peptides+of+protein+complexes.">Development of a novel cross-linking strategy for fast and accurate identification of cross-linked peptides of protein complexes.</a> Mol Cell Proteomics. 10 (1), (2011).</li><li>Hughes, M. A., Langlais, C., Cain, K., MacFarlane, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterisation+and+reconstitution+of+cell+death+signalling+complexes.">Isolation, characterisation and reconstitution of cell death signalling complexes.</a> Methods. 61 (2), 98-104 (2013).</li><li>Lim, S., Zou, Y., Friedman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+activator+Mirk/Dyrk1B+is+sequestered+by+p38alpha/beta+MAP+kinase.">The transcriptional activator Mirk/Dyrk1B is sequestered by p38alpha/beta MAP kinase.</a> J Biol Chem. 277 (51), 49438-49445 (2002).</li><li>Havugimana, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+census+of+human+soluble+protein+complexes.">A census of human soluble protein complexes.</a> Cell. 150 (5), 1068-1081 (2012).</li><li>Kirkwood, K. J., Ahmad, Y., Larance, M., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+native+protein+complexes+and+protein+isoform+variation+using+size-fractionation-based+quantitative+proteomics.">Characterization of native protein complexes and protein isoform variation using size-fractionation-based quantitative proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3851-3873 (2013).</li><li>Kristensen, A. R., Gsponer, J., Foster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+approach+for+measuring+temporal+changes+in+the+interactome.">A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome.</a> Nat Methods. 9 (9), 907-909 (2012).</li><li>Liu, F., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+the+architecture+of+protein+assemblies+and+protein+interaction+networks+by+cross-linking+mass+spectrometry.">Interrogating the architecture of protein assemblies and protein interaction networks by cross-linking mass spectrometry.</a> Curr Opin Struct Biol. 35, 100-108 (2015).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions.">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li><li>Heide, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexome+profiling+identifies+TMEM126B+as+a+component+of+the+mitochondrial+complex+I+assembly+complex.">Complexome profiling identifies TMEM126B as a component of the mitochondrial complex I assembly complex.</a> Cell Metab. 16 (4), 538-549 (2012).</li><li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+953+human+proteins+from+a+mitochondrial+HEK293+fraction+by+complexome+profiling.">Analysis of 953 human proteins from a mitochondrial HEK293 fraction by complexome profiling.</a> PLoS One. 8 (7), 68340 (2013).</li><li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC-MS/MS+as+an+alternative+for+SDS-PAGE+in+blue+native+analysis+of+protein+complexes.">LC-MS/MS as an alternative for SDS-PAGE in blue native analysis of protein complexes.</a> Proteomics. 9 (17), 4221-4228 (2009).</li><li>Remmerie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+tobacco+BY-2+protein+complexes+with+BN+PAGE/LC-MS/MS+and+clustering+methods.">Unraveling tobacco BY-2 protein complexes with BN PAGE/LC-MS/MS and clustering methods.</a> J Proteomics. 74 (8), 1201-1217 (2011).</li><li>Sessler, N., Krug, K., Nordheim, A., Mordmuller, B., Macek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Plasmodium+falciparum+proteasome+using+Blue+Native+PAGE+and+label-free+quantitative+mass+spectrometry.">Analysis of the Plasmodium falciparum proteasome using Blue Native PAGE and label-free quantitative mass spectrometry.</a> Amino Acids. 43 (3), 1119-1129 (2012).</li><li>Bode, D., Yu, L., Tate, P., Pardo, M., Choudhary, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Two+Distinct+Nucleosome+Remodeling+and+Deacetylase+(NuRD)+Complex+Assemblies+in+Embryonic+Stem+Cells.">Characterization of Two Distinct Nucleosome Remodeling and Deacetylase (NuRD) Complex Assemblies in Embryonic Stem Cells.</a> Mol Cell Proteomics. 15 (3), 878-891 (2016).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+the+MaxQuant+computational+platform+for+SILAC-based+quantitative+proteomics.">A practical guide to the MaxQuant computational platform for SILAC-based quantitative proteomics.</a> Nat Protoc. 4 (5), 698-705 (2009).</li><li>Kim, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+regulatory+factor+recruits+the+nucleosome+remodeling+complex+to+wingless+integrated+(Wnt)+signaling+gene+promoters+in+mouse+embryonic+stem+cells.">A novel regulatory factor recruits the nucleosome remodeling complex to wingless integrated (Wnt) signaling gene promoters in mouse embryonic stem cells.</a> J Biol Chem. 287 (49), 41103-41117 (2012).</li><li>Lauberth, S. M., Rauchman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+12-amino+acid+motif+in+Sall1+recruits+the+nucleosome+remodeling+and+deacetylase+corepressor+complex.">A conserved 12-amino acid motif in Sall1 recruits the nucleosome remodeling and deacetylase corepressor complex.</a> J Biol Chem. 281 (33), 23922-23931 (2006).</li><li>Miller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sall4+controls+differentiation+of+pluripotent+cells+independently+of+the+Nucleosome+Remodelling+and+Deacetylation+(NuRD)+complex.">Sall4 controls differentiation of pluripotent cells independently of the Nucleosome Remodelling and Deacetylation (NuRD) complex.</a> Development. 143 (17), 3074-3084 (2016).</li><li>Dharmarajan, V., Lee, J. H., Patel, A., Skalnik, D. G., Cosgrove, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+WDR5+interaction+(Win)+motif+recognition+in+human+SET1+family+histone+methyltransferases.">Structural basis for WDR5 interaction (Win) motif recognition in human SET1 family histone methyltransferases.</a> J Biol Chem. 287 (33), 27275-27289 (2012).</li><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Smits, A. H., Jansen, P. W., Poser, I., Hyman, A. A., Vermeulen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+chromatin-associated+protein+complexes+revealed+by+label-free+quantitative+mass+spectrometry-based+proteomics.">Stoichiometry of chromatin-associated protein complexes revealed by label-free quantitative mass spectrometry-based proteomics.</a> Nucleic Acids Res. 41 (1), 28 (2013).</li><li>Lambert, J. P., Tucholska, M., Pawson, T., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+DNA+shearing+in+standard+affinity+purification+allows+simultaneous+identification+of+both+soluble+and+chromatin-bound+interaction+partners.">Incorporating DNA shearing in standard affinity purification allows simultaneous identification of both soluble and chromatin-bound interaction partners.</a> J Proteomics. 100, 55-59 (2014).</li><li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+PAGE.">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li><li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li><li>Schagger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li><li>Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B., Aebersold, R., Steimle, V., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+Blue+native/SDS+gel+electrophoresis+of+multi-protein+complexes+from+whole+cellular+lysates:+a+proteomics+approach.">Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).</li><li>Liu, F., Rijkers, D. T., Post, H., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+profiling+of+protein+assemblies+by+cross-linking+mass+spectrometry.">Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross-linking mass spectrometry.</a> Nat Methods. 12 (12), 1179-1184 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

A continuación, describimos el uso de purificación por afinidad seguido de electroforesis en gel nativo azul en combinación con espectrometría de masas cuantitativa para resolver los complejos de proteínas. Este enfoque ofrece un método para desentrañar listas de interacción de proteínas unidimensionales en conjuntos de proteínas funcionales. Demostramos el método basado en el uso de proteínas etiquetadas con epítopo. Sin embargo, si una línea celular que expresa una proteína etiquetada no está disponible, una alternativa podría ser el uso de anticuerpos contra la proteína de interés, siempre que haya un péptido disponible para lograr elución competitiva nativo. podría tener que ser modificada en función del nivel de expresión de la proteína diana La cantidad de material y la cantidad de granos de partida. Típicamente Realizamos este protocolo con 2-5 x 10 8 células material de partida, y esto es suficiente incluso para las proteínas con bajo nivel de expresión. La composición de tampón de lisis debe ser elegido empíricamente para lograrcerca para completar la solubilización del cebo. Esto podría ser un reto para algunos tipos de proteínas, en particular, la unión de la cromatina o proteínas de membrana. Las opciones alternativas incluyen el aumento de la cantidad de sal, siempre que el complejo de la proteína en estudio es estable en alta sal, o el uso de sonicación y / o tratamiento de nucleasa para proteínas de unión a la cromatina 20, 29. En el caso de proteínas de membrana, el cambio de detergente a DDM o digitonina puede ser aconsejable 30. En el caso de las proteínas de unión a ADN, es útil incluir una nucleasa tal como Benzonase durante la etapa de purificación 20. La eliminación completa de los ácidos nucleicos asegura que las interacciones detectadas se producen entre las proteínas y no están mediadas por ADN. Un elemento crítico a considerar cuando se utiliza este enfoque es la estabilidad del complejo bajo investigación. El procedimiento es largo y puede implicar preserving la proteína durante la noche complejo. Hemos logrado un buen éxito con dos complejos de remodelación de la cromatina (D. Bode y M. Pardo, datos no mostrados), pero esto debe ser evaluado. La etapa de purificación por afinidad se puede acortar si es necesario. Las técnicas alternativas que permiten fraccionamiento nativa, tales como cromatografía de exclusión de tamaño, se han utilizado ampliamente desde hace más de 50 años para caracterizar los complejos de proteínas. Nosotros y otros han demostrado que la resolución de PAGE nativa azul es superior a la conseguida usando la cromatografía de exclusión de tamaño 20, 31, 32, 33. Otra ventaja de PAGE natural azul es que no requiere sistemas de cromatografía, que son caros, sino que utiliza las proteínas equipos de electroforesis que está muy extendida en los laboratorios. En cuanto a la práctica en el tiempo, este método no implica más trabajo que el tradicional GELC-MS / MS de unanfoque o fuera de línea de cromatografía de fraccionamiento. Sin embargo, como la mayoría de las técnicas de fraccionamiento hacen, que tiene un límite a su resolución. Complejos que son muy homogéneos o cerca de la masa y la forma puede estar más allá de la resolución ofrecida por PAGE nativa azul, y por lo tanto el protocolo como se informó aquí no se universalmente éxito en la resolución de complejos con distintas subunidades compartidas. Alentador, hemos tenido éxito en la separación de dos complejos tetrámeros muy similares que comparten tres subunidades (M. Pardo, manuscrito en preparación). Desde la espectrometría de masas se ha convertido cada vez más sensible, incluso pequeñas cantidades de interactores y contaminantes no específicos pueden ser detectados en muestras AP-EM. El enfoque presentado aquí podría ayudar en la discriminación de los interactores reales de contaminación de fondo en la purificación por afinidad, centrándose la atención en las proteínas con picos de migración que coinciden con los picos de migración cebo en peso molecular mayor que el delas proteínas monoméricas. Varios grupos han utilizado técnicas de fraccionamiento seguido de proteína de perfiles de correlación para delinear los complejos de proteínas a escala celular sin la necesidad de aislamiento anterior 10, 11, 12, 34. Sin embargo, esto puede resultar en una falla para detectar interacciones sub-estequiométrica. La incorporación de una etapa de enriquecimiento a través de la purificación por afinidad puede ayudar a superar esto. El enfoque descrito aquí debe ser generalmente útiles para la exploración de la topología de complejos de proteínas y desentrañar los múltiples complejos de una proteína dada toma parte en dentro del mismo contexto celular. La estrategia es simple y susceptible a los laboratorios que pueden no tener el equipo de fraccionamiento cromatográfico caro para resolver los complejos de proteínas.

En las células, la mayoría de las proteínas realizan sus funciones a través de interacciones proteína-proteína transitoria o mediante la formación de conjuntos de proteínas estables. La caracterización de las interacciones proteína es crucial para los procesos celulares entender por completo. La purificación por afinidad en combinación con espectrometría de masas (AP-EM) es una de las estrategias más comúnmente aplicados para identificar interacciones proteína nativa. Mejoras significativas en las capacidades del instrumento logrados en la última década han hecho que este enfoque extremadamente potente. Es importante señalar que las interacciones identificadas por experimentos de AP-EM incluyen una mezcla de asociaciones directas e indirectas entre cebo y presas. Además, a menudo las proteínas toman parte en varios complejos diferentes dentro del mismo contexto celular, que pueden tener diferentes funciones biológicas, y por lo tanto los interactores que se identifican por AP-MS podrían representar una mezcla de los conjuntos de proteínas distintas o entidades funcionales. No es posible derivardicha información topológica a priori de la lista de mono-dimensional de las proteínas generadas por simples experimentos AP-EM. Sin embargo, la técnica puede aprovecharse más para definir la arquitectura de complejos de proteínas mediante la combinación con uno o más métodos para resolver estos conjuntos. Con el fin de resolver la topología de las interacciones de las proteínas identificadas a través de la AP-EM, se han aplicado varias estrategias. Un enfoque consiste en realizar iterativos experimentos AP-EM usando las presas identificadas en una ronda previa de experimentos como cebos 1. Aunque muy informativo, esta es una tarea intensiva bastante trabajo tanto a nivel experimental y analíticamente. Protein reticulación en combinación con espectrometría de masas se utiliza cada vez para derivar información topológica sobre complejos de proteínas 2, 3, 4, 5. Sin embargo, computatioanálisis nal de péptidos reticulados sigue siendo una tarea difícil y por lo tanto es el cuello de botella en el flujo de trabajo. El advenimiento de reactivos MS-escindibles de reticulación debe facilitar el mapeo de los residuos de aminoácidos que se encuentran en estrecha proximidad en las proteínas que interactúan 6, 7. Otra alternativa es la combinación de la purificación por afinidad con técnicas de separación ortogonales anteriores 8, 9. El fraccionamiento cromatográfico por filtración en gel o de intercambio iónico, o fraccionamiento en gradiente de sacarosa han recientemente también se ha utilizado en combinación con espectrometría de masas cuantitativa para describir complejos multiproteicos en un nivel de todo el sistema, sin pasar por el complejo etapa de aislamiento 10, 11, 12, 13. electroforesis en gel de poliacrilamida nativo azul (BN-PAGE) ha sido ampliamente aplicado ainvestigar las interacciones de proteínas nativas, típicamente los que implican complejos de proteínas de membrana mitocondrial 14. Esta técnica de separación también se utilizó recientemente en combinación con la cuantificación de proteínas libre de etiqueta y de perfiles de correlación, no sólo en complejos mitocondriales 15, 16, 17, sino también para desentrañar otros complejos de proteínas de células enteras 18, 19. La hipótesis de que la combinación de la purificación por afinidad con los enfoques de fraccionamiento nativos posteriores y MS cuantitativa debe proporcionar una estrategia útil para la resolución de múltiples conjuntos de proteínas que contienen una proteína particular. Aquí se describe un método que combina la purificación por afinidad basada en el epítopo genérico con azul electroforesis en gel de poliacrilamida nativo de los complejos aislados, seguido por sp masa cuantitativaectrometry y la proteína de perfiles de correlación, para resolver los múltiples conjuntos de una proteína podría estar involucrado en. Empleamos las células madre embrionarias de ratón, donde una proteína de interés fusionada a una etiqueta de epítopo se expresa a partir del locus endógeno de lograr cerca de abundancia fisiológica y asegurar nativa eficiente aislamiento compleja. Este enfoque se desenreda las múltiples interacciones una proteína participa en, la solución de ellos en conjuntos distintos basados en sus perfiles de correlación, mientras que no requiere más trabajo que convencional GELC-MS 20.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1384">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Protein G Dynabeads</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">10003D</td>
			<td style="width:452px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">FLAG antibody M2</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">F1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Tween-20, protein grade, 10% solution</td>
			<td style="width:285px;">Millipore</td>
			<td style="width:220px;">655206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Dimethyl pimelimidate</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">80490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">0.2 M Triethanolamine buffer, pH 8.2</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">T0449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">3x FLAG peptide</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">F4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Vivaspin 5K NMWCO, PES</td>
			<td style="width:285px;">Sartorius</td>
			<td style="width:220px;">VS0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">NativePAGE 3-12% Bis-Tris gel</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">20x NativePAGE Running Buffer</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">20x NativePAGE Cathode Additive</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">4x NativePAGE sample loading buffer</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">NativeMARK</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">LC0725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NativePAGE 5% G-250 sample additive&#160;</td>
			<td style="width:285px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">BN2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Nunc conical bottom 96-well plate, polypropylene</td>
			<td style="width:285px;">Thermo</td>
			<td style="width:220px;">249944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Multiscreen HTS 96-well filtration system</td>
			<td style="width:285px;">Thermo</td>
			<td style="width:220px;">MSDVN6550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Nunc 96-well cap natural</td>
			<td style="width:285px;">Thermo</td>
			<td style="width:220px;">276002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride)</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:285px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Acetonitrile, HPLC grade</td>
			<td style="width:285px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">A/0627/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Trypsin, sequencing grade</td>
			<td style="width:285px;">Roche</td>
			<td style="width:220px;">11418475001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Software</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">MaxQuant (software)</td>
			<td style="width:285px;">N.A.</td>
			<td style="width:220px;">N.A.</td>
			<td style="width:452px;">http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Perseus (software)</td>
			<td style="width:285px;">N.A.</td>
			<td style="width:220px;">N.A.</td>
			<td style="width:452px;">http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

resolving affinity purified protein complexes by blue native page and protein correlation profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

El flujo de trabajo de la purificación por afinidad azul perfiles de proteínas de correlación nativo por espectrometría de masas (ABC-MS) estrategia se representa en la Figura 7. complejos de proteína nativa alrededor de una proteína de interés se aíslan mediante purificación por afinidad utilizando anticuerpos contra un epítopo etiqueta (en este caso FLAG) y la elución competitiva. Los complejos se resolvieron por BN-PAGE, y todo el carril de gel se corta en 48 secciones, y se prepararon para la escopeta LC-MS / MS. La información cuantitativa MS se utiliza para generar un perfil de migración para cada proteína identificada a través de la separación nativa azul. Las proteínas que interactúan para formar una presentación compleja distintos perfiles de migración similares con picos superponibles. Cuando una proteína de interés toma parte en más de un montaje, múltiples picos se observan en su perfil de migración, dadas las sub-complejos están dentro del poder de resolución del gel nativo azul. Una comparación sistemática de los MiGperfiles de racionamiento pueden lograrse por correlación proteína de perfiles utilizando la agrupación jerárquica. El dendrograma y las intensidades de pico para todas las fracciones se visualizan en un mapa de calor, facilitando la identificación de proteínas que interactúan que pertenecen a los complejos de proteínas distintas (Figura 8). Se utilizó esta estrategia para analizar los socios que interactúan de MTA2, una subunidad central de la cromatina NuRD remodelación compleja 20. Como se muestra en la Figura 9, el perfil de migración de MTA2 muestra dos picos de intensidades distintas entre 700 kDa y 1,2 MDa, con el pico de masa inferior presentan mayor abundancia. Otras subunidades de núcleo NuRD, incluyendo MTA1 / 3, HDAC1 / 2 y Mbd3, mostraron patrón de separación idéntica, aunque los picos para algunas de las subunidades, a saber CHD4, Gatad2a / b y rbbp4 / 7, tenían la distribución abundancia inversa (Figura 9A, B). En contraste, el perfil de Cdk2ap1, un factor regulador que recluta el complejo NuRD a promotores de genes Wnt 23, sólo se muestra el mayor pico de masa (Figura 9C), y lo mismo hizo Sall4, un represor transcripcional que también se ha demostrado que se unen NuRD 20, 24, 25. Por lo tanto, el fraccionamiento de las proteínas MTA2 asociada purificados por afinidad mediante PAGE nativa azul fue capaz de resolver dos formas diferentes del complejo NuRD. ABC-MS también permite la identificación de nuevos interactores mientras asignándolos a entidades proteína particular. A través del examen de los grupos de proteínas e intensidades fracción representada en un mapa de calor se detectó una fuerte correlación entre subunidades NuRD y WDR5, una subunidad reguladora del complejo metiltransferasa MLL 26, con WDR5 que muestran dos picos de migración coincidentes con los dos NuRD pEaks (Figura 8), sugiriendo una nueva interacción entre WDR5 y NuRD. Se confirmó esta interacción por la co-inmunoprecipitación y co-migración en la cromatografía de exclusión por tamaño 20. La elección del cálculo de la métrica de distancia en la agrupación jerárquica influirá en la forma de los clusters y por lo tanto las correlaciones. Recomendamos experimentar con las diferentes métricas para lograr el mejor ajuste con el conocimiento existente interacción de la proteína o complejo de interés. Generalmente hemos conseguido los mejores resultados con la distancia métrica Manhattan (L1) 20. Correlación de Pearson o métricas de distancia euclidiana también se han reportado para la identificación de complejos basados en técnicas de fraccionamiento alternativo 10, 11, 12. el Quandatos cuanti- MS obtenidos a partir de las fracciones nativos azules también se pueden utilizar para determinar la estequiometría de los complejos de proteínas. El valor (cuantificación absoluta basada intensidad) iBAQ proporciona una medida de la abundancia relativa de las proteínas identificadas 27, 28. Los valores iBAQ para los miembros del complejo de proteínas en todas las fracciones dentro de un pico perfil de migración se normalizan a la de la proteína cebo para obtener cantidades relativas. Los iBAQs normalizados a través de un pico de perfil para un miembro de complejo proteína dada deben seguir una tendencia horizontal, y los valores de tendencia reflejar la estequiometría de las proteínas que interactúan con relación a la proteína de cebo. Para una representación más detallada de los cálculos de estequiometría, ver 20. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig7.jpg" /> Figura 7: flujo de trabajo que resume esquemática el ABC-MS sESTRATEGIA. Esta cifra se modificó a partir de 20. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig8.jpg" /> Figura 8. La agrupación jerárquica de los perfiles de migración BN-PAGE de interactores MTA2. proteínas MTA2 asociada se agruparon sobre la base de la similitud de sus perfiles de migración. Sólo se muestra un subconjunto de la mapa de calor que contiene el complejo NuRD (encerrado en la caja azul). El cuadro amarillo destaca la fuerte correlación de WDR5 con el complejo NuRD. Los pesos moleculares anotados se estimaron a partir de las distancias de migración de los patrones de proteína se ejecutan en el mismo gel. Esta investigación fue publicado originalmente en Molecular y Cellular Proteomics 20 la Sociedad Americana de Bioquímica y Mo<html> Biología lecular. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig9.jpg" /> Figura 9. perfil de migración BN-PAGE de subunidades NuRD y proteínas asociadas. A) MTA2 y NuRD subunidades presentes en un patrón de intensidad similar. B) MTA2 y NuRD subunidades con el patrón de intensidad inversa. C) MTA2 y cdk2ap1, que está presente sólo en la mayor entidad NuRD peso molecular. Los pesos moleculares anotados se estimaron a partir del perfil de migración de los patrones de proteína. Esta investigación fue publicado originalmente en Molecular y Cellular Proteomics 20 la Sociedad Americana de Bioquímica y Biología Molecular._blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="archivo suplementario" src="/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.jpg" /> Datos suplementarios: conjunto de datos de muestra. MaxQuant derivado de archivo proteingroups.txt que contiene la identificación de proteínas y los valores de cuantificación de un experimento ABC-MS. Esta investigación fue publicado originalmente en Molecular y Cellular Proteomics 20 la Sociedad Americana de Bioquímica y Biología Molecular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.txt" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Aquí presentamos protocolos para la purificación por afinidad de los complejos de proteínas y su separación por PAGE nativa azul, seguido por la proteína de perfiles de correlación utilizando etiqueta espectrometría de masa libre cuantitativo. Este método es útil para resolver interactomes en complejos de proteínas distintas.

Resolver purificado por afinidad Complejos de Proteína de Blue nativo PAGE y de proteínas de perfiles de correlación

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

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