Name: atomic force microscopy investigations of dna lesion recognition in nucleotide excision repair
Uploaded: 2017-05-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair at JoVE.com

पीयूसी19 एन, सीपीडी युक्त ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स, और पी 44 को क्रमशः शमूएल विल्सन, कोरबिनियन हेइल और थॉमस कैरेल और गुडरुन मिशेल और कैरोलीन किस्कर द्वारा प्रदान किया गया था। इस काम को ड्यूश फोर्सचुंगस्सेमिंस्काफ्ट (डीएफजी) एफजे 82 और ते -671 / 4 से आईटी के अनुदान के द्वारा समर्थित किया गया था।

1. नमूना तैयार करना <ol><li> डीएनए सबस्ट्रेट्स 11 की तैयारी <ol><li> प्लाज्मिड में एक एसएसडीएनए अंतर बना रहा है <ol><li> निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार स्थितियों का उपयोग करते हुए एंजाइम गर्मी निष्क्?...

<ol>
	<li>Janicijevic, A., Ristic, D., Wyman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+machines+of+DNA+repair:+scanning+force+microscopy+analysis+of+their+architecture.">The molecular machines of DNA repair: scanning force microscopy analysis of their architecture.</a> J. Microsc. 212 (3), 264-272 (2003).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+bending+and+unbending+by+MutS+govern+mismatch+recognition+and+specificity.">DNA bending and unbending by MutS govern mismatch recognition and specificity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14822-14827 (2003).</li><li>Tessmer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+MutS+searching+for+DNA+mismatches+and+signaling+repair.">Mechanism of MutS searching for DNA mismatches and signaling repair.</a> J. Biol. Chem. 283 (52), 36646-36654 (2008).</li><li>Wagner, K., Moolenaar, G., van Noort, J., Goosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+reveals+two+separate+DNA-binding+domains+in+the+Escherichia+coli+UvrA+dimer.">Single-molecule analysis reveals two separate DNA-binding domains in the Escherichia coli UvrA dimer.</a> Nucleic Acids Res. 37 (6), 1962-1972 (2009).</li><li>Buechner, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strand-specific+recognition+of+DNA+damages+by+XPD+provides+insights+into+nucleotide+excision+repair+substrate+versatility.">Strand-specific recognition of DNA damages by XPD provides insights into nucleotide excision repair substrate versatility.</a> J Biol. Chem. 289 (6), 3613-3624 (2014).</li><li>Van der Linden, E., Sanchez, H., Kinoshita, E., Kanaar, R., Wyman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAD50+and+NBS1+form+a+stable+complex+functional+in+DNA+binding+and+tethering.">RAD50 and NBS1 form a stable complex functional in DNA binding and tethering.</a> Nucleic Acids Res. 37 (5), 1580-1588 (2009).</li><li>Fuentes-Perez, M. E., Dillingham, M., Moreno-Herrero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM+volumetric+methods+for+the+characterization+of+proteins+and+nucleic+acids.">AFM volumetric methods for the characterization of proteins and nucleic acids.</a> Methods. 60, 113-121 (2013).</li><li>Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+binding+of+single-stranded+DNA-binding+protein+to+its+target.">Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target.</a> Biochemistry. 51, 1500-1509 (2012).</li><li>Wirth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+and+Divergence+in+Nucleotide+Excision+Repair+Lesion+Recognition.">Conservation and Divergence in Nucleotide Excision Repair Lesion Recognition.</a> J. Biol. Chem. 291 (36), 18932-18946 (2016).</li><li>Kuper, J., Kisker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damage+recognition+in+nucleotide+excision+DNA+repair.">Damage recognition in nucleotide excision DNA repair.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 22, 88-93 (2012).</li><li>Buechner, C. N., Tessmer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+substrate+preparation+for+atomic+force+microscopy+studies+of+protein-DNA+interactions.">DNA substrate preparation for atomic force microscopy studies of protein-DNA interactions.</a> J. Mol. Recognit. 26 (12), 605-617 (2013).</li><li>Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+RecG+Helicase+at+the+DNA+Replication+Fork+by+SSB+Protein.">Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein.</a> Sci. Rep. 5, 9625 (2015).</li><li>Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Crampton, N., Kirkham, J., Thomson, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+studies+of+DNA+transcription+using+atomic+force+microscopy.">Single-molecule studies of DNA transcription using atomic force microscopy.</a> Phys. Biol. 9 (2), 021001 (2012).</li><li>Maurer, S., Fritz, J., Muskhelishvili, G., Travers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase+and+an+activator+form+discrete+subcomplexes+in+a+transcription+initiation+complex.">RNA polymerase and an activator form discrete subcomplexes in a transcription initiation complex.</a> EMBO J. 25 (16), 3784-3790 (2006).</li><li>Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, (2012).</li><li>Theis, K., Chen, P. J., Skorvaga, M., Van Houten, B., Kisker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+UvrB,+a+DNA+helicase+adapted+for+nucleotide+excision+repair.">Crystal structure of UvrB, a DNA helicase adapted for nucleotide excision repair.</a> EMBO J. 18 (24), 6899-6907 (1999).</li><li>Kuper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+TFIIH,+XPD+helicase+is+exclusively+devoted+to+DNA+repair.">In TFIIH, XPD helicase is exclusively devoted to DNA repair.</a> PLoS Biol. 12 (9), e1001954 (2014).</li><li>Shlyakhtenko, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silatrane-based+surface+chemistry+for+immobilization+of+DNA,+protein-DNA+complexes+and+other+biological+materials.">Silatrane-based surface chemistry for immobilization of DNA, protein-DNA complexes and other biological materials.</a> Ultramicroscopy. 97, 279-287 (2003).</li><li>Roth, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPB+helicase+regulates+DNA+incision+by+the+Thermoplasma+acidophilum+endonuclease+Bax1.">XPB helicase regulates DNA incision by the Thermoplasma acidophilum endonuclease Bax1.</a> DNA Repair. 11 (3), 286-293 (2012).</li><li>Ratcliff, G. C., Erie, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Single-Molecule+Study+to+Determine+Protein-Protein+Association+Constants.">A Novel Single-Molecule Study to Determine Protein-Protein Association Constants.</a> J. Am. Chem. Soc. 123 (24), 5632-5635 (2001).</li><li>Yang, Y., Sass, L. E., Du, C., Hsieh, P., Erie, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+protein-DNA+binding+constants+and+specificities+from+statistical+analyses+of+single+molecules:+MutS-DNA+interactions.">Determination of protein-DNA binding constants and specificities from statistical analyses of single molecules: MutS-DNA interactions.</a> Nucleic Acids Res. 33 (13), 4322-4334 (2005).</li><li>Caron, P. R., Grossman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+a+cryptic+ATPase+activity+of+UvrB+and+its+proteolysis+product,+UvrB*+in+DNA+repair.">Involvement of a cryptic ATPase activity of UvrB and its proteolysis product, UvrB* in DNA repair.</a> Nucleic Acids Res. 16 (22), 10891-10902 (1988).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UvrB+domain+4,+an+autoinhibitory+gate+for+regulation+of+DNA+binding+and+ATPase+activity.">UvrB domain 4, an autoinhibitory gate for regulation of DNA binding and ATPase activity.</a> J. Biol. Chem. 281 (22), 15227-15237 (2006).</li><li>Chammas, O., Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Thomson, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+loops+as+fiducial+markers+for+exploring+DNA-protein+interactions+in+single+molecule+imaging.">Single-stranded DNA loops as fiducial markers for exploring DNA-protein interactions in single molecule imaging.</a> Methods. 60 (2), 122-130 (2013).</li><li>Truglio, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+DNA+recognition+and+processing+by+UvrB.">Structural basis for DNA recognition and processing by UvrB.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 13 (4), 360-364 (2006).</li><li>Kuper, J., Wolski, S. C., Michels, G., Kisker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+studies+of+the+nucleotide+excision+repair+helicase+XPD+suggest+a+polarity+for+DNA+translocation.">Functional and structural studies of the nucleotide excision repair helicase XPD suggest a polarity for DNA translocation.</a> EMBO J. 31 (2), 494-502 (2012).</li><li>Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Goosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presence+of+two+UvrB+subunits+in+the+UvrAB+complex+ensures+damage+detection+in+both+DNA+strands.">The presence of two UvrB subunits in the UvrAB complex ensures damage detection in both DNA strands.</a> EMBO J. 21 (15), 4196-4205 (2002).</li><li>Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Hoeijmakers, J. H., Goosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+nucleotide+excision+repair+complexes:+DNA+is+wrapped+by+UvrB+before+and+after+damage+recognition.">Architecture of nucleotide excision repair complexes: DNA is wrapped by UvrB before and after damage recognition.</a> EMBO J. 20 (3), 601-611 (2001).</li><li>Moolenaar, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+ATP+Binding+and+Hydrolysis+by+UvrB+during+Nucleotide+Excision+Repair.">The Role of ATP Binding and Hydrolysis by UvrB during Nucleotide Excision Repair.</a> J. Biol. Chem. 275, 8044-8050 (2000).</li></ol>

एएमएएम के सांख्यिकीय विश्लेषण में लंबे समय से डीएनए के टुकड़े पर प्रोटीन के विशिष्ट स्थानों का पता लगाया जा सकता है, जो इन साइटों 2 , 3 , 4 , 5 , 6 क?...

परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) प्रोटीन-डीएनए 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 के विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। एकल अणु स्तर पर एक संकल्प के साथ विषम नमूनों को सीधे विज़ुअलाइज़ करने के लिए केवल नमूना सामग्री की कम मात्रा की आवश्यकता होती है। विविधता एक प्रोटीन के विभिन्न गठनात्मक या ओलिगोमोरिक राज्यों से उत्पन्न हो सकती है। विशेष रूप से, प्रोटीन-डीएनए नमूनों के संदर्भ में, प्रोटीन कॉम्प्लेक्स डीएनए बाध्यकारी द्वारा डीएनए के भीतर एक विशिष्ट लक्ष्य साइट के लिए अलग-अलग स्टिइचीमेट्रिक्स और / या डीएनए बाध्यकारी द्वारा प्रेरित प्रदर्शनों को प्रदर्शित कर सकते हैं। विषम नमूने में भी दो (या अधिक) विभिन्न प्रकार के प्रोटीन, और विभिन्न प्रोटीन जटिल शामिल हो सकते हैंरूपों ( उदाहरण के लिए , केवल एक प्रकार की प्रोटीन बनाम हेटेरोमेरिक कॉम्प्लेक्स) डीएनए के साथ अलग तरह से बातचीत कर सकते हैं। यहां पर चर्चा किए गए अध्ययन में लंबे समय से (~ 900 बेस जोड़े, बीपी) डीएनए टुकड़े जो कि इन प्रोटीनों के लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करते हैं, एक घाव है, के लिए बाध्य डीएनए की मरम्मत प्रोटीन के स्थैतिक, सूखे नमूनों पर हवा में AFM इमेजिंग का फायदा उठाते हैं। एएफएम के उच्च, आणविक संकल्प, विभिन्न प्रकार के प्रोटीन परिसरों के बीच अंतर और डीएनए टुकड़ों पर प्रोटीनों की बाध्यकारी स्थिति निर्धारित करने की अनुमति देता है। महत्वपूर्ण रूप से, घावों को डीएनए सबस्ट्रेट्स में अच्छी तरह से परिभाषित स्थानों पर पेश किया जाता है। क्योंकि डीएनए में घाव साइट की स्थिति ज्ञात है, डीएनए पर बाध्य प्रोटीन के वितरण से (अलग) प्रोटीन परिसरों के (अलग-अलग) घाव मान्यता गुणों में अंतर्दृष्टि प्रदान होती है, उदाहरण के लिए , वे एक विशेष प्रकार के घावों की पहचान कैसे करते हैं (तुलना गैर-क्षतिग्रस्त डीएनए) 2 , 3 , <supवर्ग = &quot;xref&quot;&gt; 4 , 5 , 6 डीएनए पर उनकी स्थिति डीएनए पर मौजूद अन्य जगहों पर विशेष रूप से घावों और परिसरों पर प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के बीच अंतर की अनुमति देती है। इन भिन्न जटिल प्रकारों (विशेष रूप से घाट बनाम गैर विषैले परिसरों पर परिसर के संकुचित) के अलग-अलग लक्षण वर्णन लक्ष्य साइट पहचान पर प्रेरित परिसरों में संभावित गठनात्मक परिवर्तनों को प्रकट कर सकते हैं। डीएनए की मरम्मत प्रोटीन यहां पर केंद्रित हैं जो कि न्यूक्लियोटाइड छपाई की मरम्मत (एनईआर) मार्ग में घाव की पहचान के लिए जिम्मेदार हैं। बैक्टीरिया में, एनईआर प्रोटीन यूवीआरए, यूवीआरबी और यूवीआरसी द्वारा प्राप्त किया जाता है। यूवाआरए यूवाए 2 / यूवीआरबी 2 डीएनए स्कैनिंग कॉम्प्लेक्स में प्रारंभिक घावों के लिए जिम्मेदार है। यूवीआरबी द्वारा घाव सत्यापन पर यह जटिल घाव स्थल पर बंधे हुए मोनोमेरिक यूवीआरबी में धर्मान्तरित होता है और इस विशिष्ट परिसर में पीआरकोरीओटीक एनईआर एंडोन्युक्लेईज यूवीआरसी यूवीआरसी एकल फंसे डीएनए (एसएसडीएनए) के घावों वाले एक छोटे (12-13 एनटी) खंड को बढ़ाता है। लापता खंड फिर डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा refilled है अंत में, डीएनए लैगेज मूल डीएनए 9 , 10 के साथ नए संश्लेषित खंड को जवानों में लगाया जाता है। यूकेरियोट्स में, एनईआर कैस्केड के अधिकांश प्रोटीन बड़े, बहुप्रवर्तक प्रतिलेखन कारक II एच (टीएफआईआईएच) जटिल का हिस्सा हैं। त्रिआमी सीएन 2-एक्सपीसी-एचआर 23 बी कॉम्प्लेक्स के माध्यम से प्रारंभिक घावों के बाद, टीएफआईआईएच को डीएनए लक्ष्य साइट पर भर्ती किया जाता है। जब परिसर में एक्सपीड एक एनईआर लक्ष्य घाव की उपस्थिति का सत्यापन करता है, तो यूकेरियोटिक एनईआर एंडोन्यूक्लूसियस एक्सपीजी और एक्सपीएफ को एसएसडीएनए के एक छोटे (24-32 एनटी) खंड को उत्पादित किया जाता है जिसमें घाव 9 , 10 होता है । यहां, विशेष रूप से, प्रोकोरियोटिक और यूकेरियोटिक एनईआर से क्रमशः यूवीआरबी और एक्सपीडी का अध्ययन किया गया। इन helicases में एक unpaired क्षेत्र की आवश्यकता होती हैडीएनए (एक डीएनए बुलबुला) दो डीएनए एकल किलों में से एक पर धागा और बाद में एटीपी जलविद्युत द्वारा प्रेरित इस किनारा पर अनुवाद करें। डीएनए घावों के अतिरिक्त, एक डीएनए बुलबुला इसलिए substrates में पेश किया गया था जो प्रोटीन के लिए लोडिंग साइट के रूप में कार्य करता है। विशिष्ट घाव डीएनए सबस्ट्रेट्स की तैयारी की प्रक्रिया को पहले 11 वर्णित किया गया है इसके लिए एक परिपत्र डीएनए (प्लास्मिड) की आवश्यकता है जिसमें एक निकेस के लिए दो करीबी स्थान प्रतिबंध साइटों की आवश्यकता होती है। इस अध्ययन के संदर्भ में, प्लाज्मिड पीयूसी 1 9 एन (2729 बीपी) का इस्तेमाल किया गया (एस विल्सन की प्रयोगशाला, एनआईईएचएस द्वारा बनाई गई)। इस प्लास्मिड में निकेस एनटी। बीएसटीएनबीआई के लिए करीब तीन दूरी पर प्रतिबंध लगाने वाली साइटें हैं, जो कि 48 न्यूक्लियोटाइड (एनटी) खंड के फ्रेम में हैं। निकेस के साथ ऊष्मायन के बाद, इन साइटों के बीच एसएसडीएनए के खंड को हटाया जा सकता है और किसी भी लक्ष्य सुविधा वाले ओलिगोन्यूक्लियोटाइड द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है। प्रत्येक चरण के बाद, एंजाइमैटिक पाचन पूरी तरह से agarose जेल के माध्यम से परीक्षण किया जाता हैवैद्युतकणसंचलन। मूल सुपरकोइल प्लाज्मिड की तुलना में निचले इलेक्ट्रॉफ़ोरेटिक गतिशीलता के कारण निकी परिपत्र डीएनए को अलग किया जा सकता है। विशिष्ट सब्सट्रेट oligonucleotide द्वारा हटाए गए खंड के डीएनए और प्रतिस्थापन के प्रतिस्थापन एक प्रतिबंध एंजाइम के साथ पाचन के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है जो सिक्सस्ट्रेट को विशेष रूप से एनिक्स के बीच के क्षेत्र में फैलता है। एंजाइम द्वारा परिपत्र प्लाज्मिड का रेखीयकरण इसलिए विशिष्ट डीएनए के लिए दबा दिया जाएगा और विशिष्ट ओलिगोनक्लियोटाइड को सम्मिलित करने के बाद बहाल किया जाएगा। अंत में, दो एंडोन्यूसाइट प्रतिबंध साइटें (आदर्श रूप से एकल कटर) एक रेखीय डीएनए सब्सट्रेट की पीढ़ी के लिए अनुमति देते हैं, लंबाई के साथ वांछित होती है और निश्चित लक्ष्य साइट पर और साथ ही डीएनए बुलबुले भी घावों से दूरी पर 5 में &#39;या 3&#39; दिशा एनईआर हेलिसेज़ द्वारा घावों की पहचान एएफएम इमेजिंग द्वारा जांच की जा सकती है। टी में हेलिसिजों का स्थाई डीएनए स्थानांतरवह घाव साइट डीएनए पर प्रोटीन की स्थिति के वितरण में शिखर के रूप में दिखाई देता है और घाव मान्यता को इंगित करता है। क्योंकि इन हेलिसेज़ों के डीएनए ट्रांसपोर्लेशन 5&#39;-ते-3 &#39;ध्रुवीकरण के साथ दिशात्मक है, लोडिंग साइट (डीएनए बबल अपस्ट्रीम या घावों से नीचे की ओर) की स्थिति पर घाव की मान्यता पर निर्भर करता है यह भी इंगित करता है कि क्या घाव को प्राथमिकता से मान्यता प्राप्त है अनुवादित या विपरीत, गैर अनुवादित एसएसडीएनए किनारा 5 , 9 पर निम्नलिखित खंडों में, इस्तेमाल किए जाने वाले तरीके पेश किए जाएंगे और इन प्रयोगों से प्रमुख निष्कर्षों पर संक्षेप में चर्चा की जाएगी। महत्वपूर्ण रूप से, यहां दिखाए गए डीएनए की मरम्मत पर अनुकरणीय कार्य के समान, एएमएएम इमेजिंग डीएनए प्रतिकृति या ट्रांसक्रिप्शन 8 , 12 , 13 , 14 जैसे विभिन्न डीएनए बातचीत प्रणालियों के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है </sup&gt;।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Molecular Force Probe (MFP) 3D</td>
			<td>Asylum Research</td>
			<td>N/A</td>
			<td>atomic force microscope (AFM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision 390</td>
			<td>DELL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>computer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer and 1.5 ml block</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td>heat block for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotilabo Block-Heater H 250 &#38; blocks for 0.5 ml tubes</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>Y264.1 &#38; Y267.1</td>
			<td>heat block for protein-DNA incubations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Sub Cell GT</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories GmbH</td>
			<td>1704467</td>
			<td>electrophoresis chamber with gel caster and power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac Basic</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories GmbH</td>
			<td>1645050</td>
			<td>electrophoresis power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centifuge 5415 D with rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2262120-3</td>
			<td>table centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Lum electronic UV transillumonator MEB-15</td>
			<td>Ultralum</td>
			<td>900-1322-02</td>
			<td>UV irradiation table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-1000</td>
			<td>VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>UV spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TKAX-CAD with 0.2 &#956;m capsule filter</td>
			<td>Unity Lab Services</td>
			<td>N/A</td>
			<td>water deionization and filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MFP software on Igor Pro</td>
			<td>Asylum Research</td>
			<td>N/A</td>
			<td>AFM software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ (open source Java image processing)</td>
			<td>NIH Image</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel (Microsoft Office)</td>
			<td>Microsoft Corporation</td>
			<td>N/A</td>
			<td>data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin9 / Origin2016</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td>N/A</td>
			<td>statistical data analysis and graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OMCL-AC240TS</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OMCL-AC240TS</td>
			<td>AFM cantilevers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>grade V-5 muscovite</td>
			<td>SPI Supplies</td>
			<td>1805</td>
			<td>mica sheets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5ml 50k Ultracell</td>
			<td>Millipore Ireland Ltd.</td>
			<td>UFC505096</td>
			<td>centrifuge filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Extract II&#160;</td>
			<td>&#160;Macherey-Nagel GmbH</td>
			<td>740 609.250</td>
			<td>Agarose gel extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotilabo cellulose paper type 111A</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>AP59.1</td>
			<td>AFM deposition blotting paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anatop 25 (0.02 &#956;m)</td>
			<td>Whatman GmbH</td>
			<td>6809-2102</td>
			<td>syringe filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSpI, BspQI</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>R0132, R0712</td>
			<td>restriction enzymes for DNA substrate preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI, BglII</td>
			<td></td>
			<td>R0146, R0144</td>
			<td>restriction enzymes for DNA preparation controls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nicking restriction enzyme Nt.BstNBI</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>R0607</td>
			<td>nickase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>M0202S</td>
			<td>Ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, HEPES</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4855, 9105</td>
			<td>buffer chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3957, HN03, HN02, P026</td>
			<td>salt chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaAc</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td>
			<td>32318</td>
			<td>salt chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT, TCEP, EDTA</td>
			<td></td>
			<td>6908, HN95, 8040</td>
			<td>chemicals/reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose, acetic acid, HCl</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>2267, 3738, K025</td>
			<td>reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP&#404;S</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-406</td>
			<td>nucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>K054</td>
			<td>nucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide #1 in Table 1</td>
			<td>Biomers</td>
			<td>custom</td>
			<td>complementary DNA oligonucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotides #2, #3, and #6 in Table 1</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td>custom</td>
			<td>fluorescein containing oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotides #4&#160; and #5 in Table 1</td>
			<td>private (available from e.g. TriLink or GlenResearch)</td>
			<td></td>
			<td>CPD containing oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SafeSeal reaction tube 0.5 ml and 1.5 ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.704 and 72.706</td>
			<td>incubation tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1 kb</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SM0311</td>
			<td>DNA ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x concentrate gel loading dye purple</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>51406</td>
			<td>DNA loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midori Green&#160;</td>
			<td>Nippon Genetics Europe GmbH</td>
			<td>999MG28055</td>
			<td>DNA stain</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic force microscopy investigations of dna lesion recognition in nucleotide excision repair

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different molecules and molecular assemblies in a heterogeneous sample. In the particular context of DNA interacting protein systems, different protein complex forms and their corresponding binding positions on target sites containing DNA fragments can thus be distinguished. Here, an application of AFM to the study of DNA lesion recognition in the prokaryotic and eukaryotic nucleotide excision DNA repair (NER) systems is presented. The procedures of DNA and protein sample preparations are described and experimental as well as analytical details of the experiments are provided. The data allow important conclusions on the strategies by which target site verification may be achieved by the NER proteins. Interestingly, they indicate different approaches of lesion recognition and identification for the eukaryotic NER system, depending on the type of lesion. Furthermore, distinct structural properties of the two different helicases involved in prokaryotic and eukaryotic NER result in and explain the different strategies observed for these two systems. Importantly, these experimental and analytical approaches can be applied not only to the study of DNA repair but also very similarly to other DNA interacting protein systems such as those involved in replication or transcription processes.

प्रोटीन कॉम्प्लेक्स वॉल्यूम पर आधारित विभिन्न जटिल प्रकार के बीच अंतर प्रोकैरिकोटिक एनईआर हेलीकस यूवीआरबी की हेलिसेज गतिविधि डीएनए बाइंडिंग 22 , <sup class="x...

Watch this Scientific Journal Video about Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair at JoVE.com

Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

Here, the study of different DNA lesion recognition approaches via single molecule AFM imaging is demonstrated with the nucleotide excision repair system as an example. The procedures of DNA and protein sample preparations and experimental as well as analytical details for the AFM experiments are described.

न्यूक्लियोटाइड एक्साइज मरम्मत में डीएनए घाव पहचान की परमाणु बल माइक्रोस्कोपी जांच

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different ...

The overall goal of this atomic force microscopy experiment is to resolve interactions of DNA repair proteins with damage sites in DNA and to distinguish between different DNA interactions by various protein complexes. This method can help answer key questions in the DNA repair field, such as how a particular DNA repair system achieves the recognition of its target lesions in the DNA. The main advantage of this technique is that we can directly see and analyze the different types of complexes that are involved in the DNA lesion recognition process.Demonstrating the procedure will be Nicolas Wirth, who used this approach during his bachelor research. To begin, prepare a suitable DNA substrate by generating a single-stranded DNA gap in a plasmid. Refill the gap with modified, single-stranded DNA oligonucleotides, and finally, linearize the plasma DNA using appropriate restriction enzymes.For these experiments, the double-stranded DNA substrates are about 1, 000 base pairs long and contain a DNA lesion as well as an unpaired region called a DNA bubble for protein loading onto the DNA. Next, prepare a protein DNA sample for AFM analysis by first pipetting 10x Reaction Buffer and water into a microreaction tube. Then, add the DNA and proteins under investigation.For example, here, 100 nanomolar of the DNA sample and one micromolar or each of the eukaryotic nucleotide excision repair proteins XPD and p44. Then, incubate the reaction for 30 minutes at 37 degrees Celsius in a heat block. Following the incubation, briefly spin down the sample.Next, prepare a mica substrate to place the sample onto. Use a scalpel to cut a one-centimeter by one-centimeter piece of mica from a larger strip. Then, use a piece of adhesive tape to remove the top layers of the mica to reveal a clean, flat, anatomically smooth substrate surface.Dilate the protein DNA sample fifty to a hundredfold in AFM deposition buffer, and immediately deposit 20 microliters of the diluted sample onto the mica surface. The dilution factor depends on the sample concentration. Immediately after depositing the sample on the mica surface, rinse the sample three to four times with a few milliliters of filtered, deionized water and blot off excess liquid.Use a gentle stream of nitrogen to blow dry the sample. Finally, use adhesive tape to fix the sample at its edges onto a microscope slide. Place the sample in the middle of the AFM stage and use magnetic pads to fix the microscope slide on the stage.Then, insert the AFM tip into the tip holder. Fix the tip in the holder under a clamp by tightening the screw so that it is finger tight. Once secured, enter the tip holder into the AFM measurement head.Use the positioning screws to move the sample in a central position. Place the AFM measurement head on top of the sample, making sure the head stands stably with its legs inside the stage indentations. Next, align the AFM laser on the back of the cantilever for optimal signal strength.Watch the reflection signal in the AFM video window to crudely position the laser. For this AFM model, turn the wheels of the right side and back of the AFM measurement head to adjust the X and Y positions of the AFM laser in order to direct it centrally onto the end of the cantilever. Then, optimize the detector sum signal by fine-tuning the laser position with the two wheels.Direct the AFM laser reflection onto the detector center by zeroing the different signal from the top and bottom diodes of the detector array. For this step, turn the screw on the left-side of the measurement head for this AFM model. Next, determine the cantilever residence frequency by going into the master panel tune window in the software.Choose an amplitude corresponding to a one-volt input for the Piezo that drives the cantilever oscillation and then set the oscillation frequency to negative 5%slightly lower than the residence frequency. Now perform an auto frequency tune and zero the phase of the oscillation. Leave the system to reach thermal equilibrium for about one hour before you start imaging, in order to avoid drift.When you are ready to start imaging, in the software main panel, set a protecting set point and prepare to approach the tip to the sample surface by selecting engage. Lower the front wheel of the AFM head manually until the protective setting, or set point, is reached. Then, carefully lower the front wheel further until the Z sensor signal is fully extended to the left.Activate the vibration oscillation table and close the acoustic isolation enclosure. Next, lower the set point in the AFM software using the hamster wheel to fine engage the AFM tip with the sample. To perform tapping mode imaging in the repulsive regime, lower the set point until the phase signal becomes slightly lower than the free level phase.Then, begin scanning the sample. Use the scan speed of 2.5 micrometers per second in image surface areas of four micrometer by four micrometer or eight micrometer by eight micrometer squares with pixel resolutions of 2, 048 or 4, 096, respectively;and press the Do Scan button. Preselect relevant protein DNA complexes by direct visual inspection of the images in the AFM software.For XPD samples, possible complexes include XPD p44 DNA, as well as XPD DNA and p44 DNA with distinctly different sizes due to the different molecular masses of XPD and p44. Measure volumes of individual protein peaks on the DNA by using the section tool in the analysis window to measure the height and diameter of the protein peak sections with the section window cursors. Use these values to determine the volume of the peaks using simple mathematical models to verify the complex type.Finally, calibrate your AFM system with a range of proteins with known molecular weights to translate these volumes into approximate molecular weights of proteins and protein complexes. In order to determine additional features, such as DNA fragment lengths, the positions of protein complexes on the DNA and their target-site specificities or DNA band angles, see the accompanying text protocol. Shown here is an AFM image with three different types of DNA-bound complexes that can be distinguished based on their different sizes.Class one complexes are consistent with only the helicase activating co-factor p44, class two complexes consist of only the XPD protein, and class three complexes consist of both XPD and p44 as legion recognition by XPD requires the activation of its helicase activity by p44, and only the class three complexes show lesion recognition. In order to identify different lesion recognition strategies, the locations of proteins on the DNA substrates were measured for protein loading at a DNA bubble in either the five prime or three prime directions from a DNA lesion shown in red for prokaryotic and eukaryotic NER helicases. In the protein position distributions, DNA lesion recognition can be seen as a peak due to enhanced binding at the DNA lesion position.The prokaryotic NER helicase UVRB and its eukaryotic counterpart, XPD, show different strategies of CPD lesion recognition that indicate different DNA strand preferences. Specifically, CPD lesions are recognized on the translocated strand by UVRB, but preferentially on the opposite, non-translocated strand by XPD. Once mastered, this method can be done in a few hours or days including analysis.It's important to work with highly pure protein and DNA samples to be able to interpret the features in the AFM images and to carefully design the DNA substrate depending on the biological system and on the question you want to address. In addition, ensemble methods, such as gel electrophoresis space, electromobility shift, or DNA incision assays are, of course, highly complementary to these AFM experiments;and these methods can help address additional questions, such as on DNA binding affinities or DNA lesion excision activities. This technique is a relatively fast and simple approach to directly visualize protein DNA complexes, and these complexes give us a good picture of the processes that occur in a biological system.Of course, this is not only useful in understanding DNA repair processes, but it can also be applied to other protein DNA systems. After watching this video, you should have a pretty good idea of how to prepare a sample on your favorite protein DNA system, how to image it by AFM, and of how to extract useful parameters for an interpretation of your data.

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Biology

Genetics

Unit 1

DNA Structure and Function

DNA Repair and Recombination

SCIENTISTS IN ACTION

The Visual Colorimetric Detection of Multi-nucleotide Polymorphisms on a Pneumatic Droplet Manipulation Platform

एक साँस बूंद हेरफेर मंच पर मल्टी nucleotide बहुरूपताओं के दृश्य वर्णमिति जांच

A simple and visual method to detect multi-nucleotide polymorphism (MNP) was performed on a pneumatic droplet manipulation platform on an open surface. ...

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Edu धुंधला द्वारा ड्रोसोफिला एडल्ट अंडाशय में mitochondrial डीएनए प्रतिकृति के सीटू लेबलिंग में

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

ठंड-कतरा डीएनए संश्लेषण की काइनेटिक्स<em&gt; इन विट्रो</em&gt; जीवाणुभोजी T7 प्रतिकृति प्रोटीन से

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

राइबोसोमल डीएनए के आधार पर आरएनए नमूनों में डीएनए संदूषण का आकलन

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

प्रोइकन-डीएनए चेकोस के साथ-साथ जीईनोम चौड़ा मानचित्रण<em&gt; सैककोरोइनेस सीरिजिया</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

अनुक्रम-विशिष्ट और चयनात्मक पहचान डबल-असहाय RNAs पर एकल-असहाय RNAs द्वारा रासायनिक संशोधित पेप्टाइड न्यूक्लिक एसिड

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

डीएनए संशोधनों के लिए Immunostaining: फोकल छवियों की गणना विश्लेषण

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

डीएनए प्रतिकृति एक Vivo में मॉडल प्रणाली के रूप में Zebrafish का उपयोग समय की रूपरेखा

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

एक सरल, तेजी से, और मात्रात्मक परख डीएनए की मरंमत को मापने के लिए स्तनधारी कोशिकाओं में Plasmids Transfected पर प्रोटीन Crosslinks

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Mitochondrial डीएनए मिथाइल का सटीक पता लगाने के लिए क्रियाविधि

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...