Name: fat body organ culture system in aedes aegypti, a vector of zika virus
Uploaded: 2017-08-19T13:00:00
Duration: 6 min 18 s
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Diese Forschung wurde von NIH Grant #SC1AI109055, unterstützt die 2014 NMSU HHMI Grant #52008103 und NSF PGR gewähren #1238731. Wir danken die Teilnehmern der Klasse NMSU Frühjahr 2015 BIOL302 molekulare Methoden und Lavesh Bhatia für ihre technische Unterstützung mit den fetten Körper-Kultur-Experimenten.

1. Vorbereitung der Lösungen und Reagenzien <ol><li>Aminosäure-Stammlösung <ol><li>Prepare a 4 X Aminosäure-Stammlösung 23 , 24 durch Wiegen und ein Erlenmeyerkolben gemäß den in Tabelle 1 angegebenen Konzentrationen 20 verschiedene Aminosäuren hinzugefügt. 
		Hinweis: In einigen Fällen Amino acid(s) kann die Lösung ausgeschlossen und durch ersetzt werden gleiche molare Mengen von Mannit, einen gleichen Konzentration von Osmolyten beizubehalten.</li>
		<li>Fügen Sie die entsprechende Menge an DdH 2 O, das gewünschte Volumen der Lösung zu produzieren.</li>
		<li>Um sicherzustellen, dass die Aminosäuren vollständig aufgelöst haben, erhitzen schonend und ständig rühren, bis die Flüssigkeit vollständig klar ist, es wird auf einen leichten gelben Farbton nehmen. 
		Hinweis: Es möglicherweise erforderlich, den pH-Wert auf 6 zu reduzieren, durch Zugabe von HCl um einige der mehr hydrophobe Aminosäuren auflösen können.</li>
		<li>Aliquot der Lösung und Sterilfilter mit einer Spritze-Filter mit einer 0,2 µm Porengröße.</li>
		<li>Store in einem verschlossenen Behälter bei-20 ° C bis zu 6 Monate.</li>
	</ol></li> <li>APS Hinweis: 25 zu sehen.
	<ol><li>Für die 20 X Salz-Stammlösung, kombinieren die Salze in 50 mL Wasser in Tabelle 2 aufgeführt. Rühren, bis aufgelöst. 
		Hinweis: Es möglicherweise erforderlich, die Lösung, um vollständig die Salze lösen sich leicht erwärmen.</li>
		<li>Steril-Filter mit einer Spritze-Filter mit einer 0,2 µm Porengröße und speichern Sie die Lösung in einen 50-mL-Tube bei-20 ° c</li>
	</ol></li> <li>Kalzium-Stammlösung <ol><li>für die 50 X Kalzium-Stammlösung, 100 mL Wasser (Tabelle 3) 0,90 g Calciumchlorid hinzufügen; rühren vollständig aufgelöst.</li>
		<li>Steril-Filter mit einer Spritze mit einer 0,2 µm Porengröße, aliquoten die Lösung in 50 mL Röhrchen zu filtern und Lagerung bei-20 ° c</li>
	</ol></li> <li>Tris-Puffer (pH 7,4) <ol><li>der Tris Puffer, das Salz und die in Tabelle 4 aufgeführten Lösungen zu kombinieren und fügen DdH 2 O bis 100 mL.</li>
		<li>Mit einer Spritze steril-Filter Filtern mit 0,2 µm Porengröße und aliquoten die Lösung in 50 mL Röhrchen; bei Raumtemperatur lagern.</li>
	</ol></li> <li>Fetten Körper Kulturmedium <ol><li>um das Kulturmedium fetten Körper vorzubereiten, bereiten Sie alle oben aufgeführten Lösungen.</li>
		<li>Kombinieren sie nach Volumen in Tabelle 5 bis 200 mL Kulturmedium fetten Körper machen.</li>
		<li>Stellen Sie den pH-Wert auf 7.2 mit NaOH oder HCl.</li>
		<li>Steril-Filter die Lösung unter Verwendung eines Spritze-Filters mit einer Porengröße von 0,2 µm.</li>
		<li>Die Lösung in 15-mL-aliquoten teilen und bei-20 ° C bis zu 6 Monate zu speichern.</li>
	</ol></li></ol> 2. Vorbereiten der Dissektion <ol><li>bereiten ein Stereomikroskop (10-20 X Vergrößerung) mit Beleuchtung und legen Sie zwei ultra-feine Pinzette und Schere Mikro Dissektion.</li>
	<li>Bereiten Sie alle Lösungen für das Experiment notwendig. Die fetten Körper Nährmedium auf Zimmertemperatur auftauen. 
	Hinweis: Fällungsmitteln können aufgelöst werden, durch sanft Erhitzen der Lösung nicht höher als 30 ° c</li>
	<li>Mit einer Absauganlage, Erwachsene weibliche Stechmücken (3-7 Tage nach dem Aufgang) zu sammeln und sie zu betäuben mit Kohlendioxid oder Ice 
	Hinweis: Einmal betäubt, die Mücken sollten ständig CO 2 für die kürzeste Zeit möglich, nicht länger als 20 min. Alternativ, die Mücken können auf dem Eis betäubt und hielt für ca. 30 min.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 6-Well-Platte mit 3 mL APS pro Bohrloch.</li>
</ol> 3. Fetten Körper Dissektion <ol><li>sezierenden Stereomikroskop zu konzentrieren und stellen Sie den Stuhl auf eine komfortable Höhe.</li>
	<li>Stellen einen konkaven Objektträger auf die Mikroskop-Oberfläche und zwei Tropfen des APS ins Zentrum.</li>
	<li>Heben Sie eine Mücke, indem ein Bein mit einer Pinzette und überträgt es auf das APS-Oberfläche auf dem Objektträger.</li>
	<li>Sorgfältig die Mücke durch den Brustkorb mit der Zange in der linken Hand greifen und die Mücke zu drehen, so dass der Bauchseite nach oben ist.</li>
	<li>Halten den Körper stetig durch den Brustkorb, die letzten zwei Abdominalsegmente mit der Zange in der rechten Hand greifen und ziehen. 
	Hinweis: Die letzten zwei Abdominalsegmente werden von den Bauch und den angeschlossenen Eierstöcke Malpighian Tubuli, Enddarm und Mitteldarm zu trennen; Manchmal wird die Ernte aus dem Bauch gleiten. Wenn sie nicht entfernt wurden, legen Sie die geschlossenen Spitzen der Zange in das kleine Loch erstellt und das übrige Gewebe zu entfernen.</li>
	<li>Die richtige Zange beiseite und holen den Frühling-Schere. Schieben Sie eine Klinge in das Loch in den Bauch bis zu Segment unter den Brustkorb. Sanft und schnell schneiden Sie den Bauch längs. 
	Hinweis: Sobald der Schnitt gemacht hat, der Bauch sollten anfangen, nach außen erweitern obwohl dies nicht sofort auftreten kann.</li>
	<li>Fahren Sie mit den zweiten Schnitt machen einen seitlichen Schnitt unter der Brust und leicht unter dem erste Schnitt beendet werden. 
	Hinweis: Der Bauch sollte dann eröffnen und distanziert sich ausdrücklich von den Brustkorb mit der Kutikula, und das Fett stellen Seite inmitten der APS. Dieser Körper Bauchdecke ist die fetten Körper Vorbereitung für in-vitro- Kultur.</li>
	<li>Heben die Fett-Körper aus der APS-Lösung, mit der Spitze eines Paares von Zangen und übertragen Sie sie von der Lösung auf die 6-Well-Platte mit APS bei Raumtemperatur. Das Gewebe ca. 0,5 h ruhen bevor voran, um die fetten Körperkultur ermöglichen.</li>
</ol> 4. Fett-Body Culture <ol><li>brüten die Fett Körper auf APS bei Raumtemperatur mindestens 0,5 h zu ihnen equilibrate.</li>
	<li>Übertragen die Fett stellen mit der Spitze der Zange und heben Sie sie vorsichtig aus der APS-Lösung. Senken Sie die Spitze in das Fett des Körpers Kulturmedium. 
	Hinweis: Sollte der Körper Fett auf der Oberfläche des Mediums öffnen und frei schweben. Die fetten Körperkultur erfolgt in der Regel in 96-Well-Platten, mit 150-200 µL Medium in jede Vertiefung. Man kann gut passen bis zu drei einzelnen Fett Körper, und sie sind für mehr als 12 h (unveröffentlichte persönliche Ergebnisse).</li>
	<li>Nach der Inkubationszeit der Körper Fett aus dem Medium in 1,5 mL Zentrifuge Röhrchen mit den entsprechenden Reagenzien für downstream-Processing übertragen. 
	Hinweis: Typische Analysen umfassen qPCR 16 , 17 , 18 , 19, Western Blot- 18 , 20, Transkriptom 26, Proteomics 21 oder Metabolomik 22.</li>
</ol>

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Insekt Orgel Kultur wurde ausgiebig verwendet, um Insekten Endokrinologie, Entwicklung und Stoffwechsel sowie die Interaktion zwischen bestimmten Organen und bakteriellen Symbionten29,30,31untersuchen zu studieren, 32,33,34. In-vitro- fetten Körper Orgel Kultur diente speziell auf Aminosäure-Transport und die Regulierung der Dotter Proteinproduktion in Mücken und andere Dipteren16,17,35 studieren , 36. während des Prozesses der Vitellogenesis, der Moskito fetten Körper verwendet ein Array von hoher Spezifität Aminosäure-Transporter Blutmahlzeit stammenden Aminosäuren aus der Hämolymphe, große Mengen von Eigelb Eiweiß12 zu synthetisieren importieren ,19,35,36. Fetten Körperkultur war maßgeblich für die Abgrenzung von den fetten Körper ernährungsphysiologischen Bedarf in diesem Zusammenhang18.
Die Qualität des Ausgangsmaterials, weibliche Stechmücken ist entscheidend für den Erfolg dieser Experimente. Mückenlarven unter-überfüllt Bedingungen aufgewachsen und in der Regel mit hohen Nährstoff Diäten gefüttert produzieren die besten Ergebnisse. Es gibt einige wichtigen Variablen, die bei der Mücke fetten Körper Kulturbedingungen im Labor in Bezug auf die Versuchsanordnung zur Gründung. Wir zeigten in früheren Studien, die fetten Körper Genexpression erheblich je nach der individuellen Lebensgeschichte und Ernährungszustand der Mücke11,22 variiert. Die Moskito-Kulturbedingungen, die Variabilität in der Größe zu reduzieren einheitlich sein und Ernährung behält sich der experimentellen Moskitos. Darüber hinaus sollten Personal, das die Sezierungen geschult werden, um eine schnelle und genaue Sezierungen mit konsistenten Ergebnissen zu gewährleisten. Zellviabilität in isolierten Fett Körper kann mit verschiedenen befleckenden Methoden37,38geprüft werden.
Die experimentelle Gesamtplanung eines fetten Körper-Kultur-Experiments sollte die Anzahl der Sektionen in einem bestimmten Zeitraum möglich berücksichtigen. Wenn große Mengen an Fett Körper erforderlich sind, können mehrere Sitzungen der Dissektion oder mehrere Dissectors nötig sein. Es gibt eine Vielzahl künftiger Anwendungen für in-vitro- Fett Körperkultur in Mücken und andere Insekten. Es werden vor allem nützlich für die Prüfung potenzieller Wirkstoffkandidaten für Schädlingsbekämpfung. Die Verwendung von transgenen Techniken bei Insekten, spezifische Reporter Proteine im Körper Fett Trophocytes auszudrücken öffnet sich neue Methoden, um leistungsstarke Bioassays für das Studium der Physiologie der fetten Körper zu entwickeln.

Mücken sind Überträger von verheerenden menschlichen Krankheiten wie Malaria, Dengue-Fieber, Chikungunya und Zika1,2,3. Trotz intensiver internationaler Bemühungen zur Eindämmung dieser Krankheiten und Krankheit-übertragende Mücke Bevölkerung zu kontrollieren sind epidemische Ausbrüche von Moskitos übertragenen Krankheiten immer noch üblich, vor allem in den Entwicklungsländern. Wirksame Impfstoffe gegen viele dieser Krankheiten sind entweder nicht verfügbar oder der begrenzten Wirksamkeit4,5. Der effektivste Weg, um Ausbrüche zu verhindern ist, Moskito-Bevölkerung, vor allem durch den Einsatz von Insektizid-Behandlungen zu kontrollieren. Jedoch Insektizid Widerstand in vielen Moskito-Populationen entwickelt und zu einem gemeinsamen Problem rund um die Welt6,7,8geworden. Die Studie der Moskito Physiologie ist wesentlich für die Entwicklung neuartiger Werkzeuge und Strategien zur Seuchenbekämpfung.
Die Mücke fetten Körper spielt eine zentrale Rolle in der Nährstoffspeicherung, metabolische Homöostase, Reproduktion und Xenobiotika Katabolismus9,10,11,12. Es ist der Hauptspeicher Organ für Triglyceride, Glykogen und Aminosäuren in Form von Speicherproteinen. Es dient auch als Ort der Synthese für die meisten Hämolymphe Proteinen und Metaboliten. In Mücken ist die fetten Körper die einzige Quelle der Eigelb-Protein-Produktion, die bei Frauen auftritt, nachdem sie eine Blutmahlzeit13,14statt.
Die wichtigsten Zelltyp des Körpers Fett ist die große, polyploid Trophocyte oder Adipocyte3,9,10,12. Fett Körpergewebe gliedert sich in Lappen oder Hüllen und finden Sie in alle Körperteile der Mücke, wobei der größte Teil befindet sich in der Bauchhöhle, wo große Lappen der fetten Körper an der Bauchwand Körper befestigt sind.
Die Mücke fetten Körper Kultursystem hier vorgestellten entstand in den 70er und bleibt ein mächtiges Werkzeug zur Untersuchung von fetten Körper Physiologie10, insbesondere in Kombination mit aktuellen Technologien. Die Grundlage dieser Technik basiert auf der Isolierung der Bauch Körper Wände und die damit verbundenen Fett Körpergewebe. Des hydrophoben Charakters der Abdominal-Nagelhaut verursacht es zu schweben auf der Oberfläche des Kulturmediums, mit den beigefügten Lappen der Abdominal-Fett Körper eingetaucht. Die Luftlöcher und tracheolar Struktur sind gepflegt, Sauerstoffversorgung des kultivierten Gewebes zu gewährleisten. Fortan verweisen wir auf diese Präparate als"Fett". Isolierte Fett Körper bleiben für mehr als 12 h wenn in das entsprechende Medium (unveröffentlichte Ergebnisse) inkubiert. Fetten Körperkultur ist ein wertvolles Werkzeug, das eine Vielzahl von Fragen zu fetten Körper Endokrinologie und Physiologie9,10,12,15,16gerichtet hat, 17.
Kultivierte Fett Körper können verschiedene experimentelle unterworfen werden und Steuern Behandlungen, durch den Prüfer das, die Timing von denen entschieden werden kann. Am Ende der Inkubationszeit die Fett Körper gesammelt und verarbeitet für nachgelagerte Analysen, einschließlich qPCR16,17,18,19, Western Blot-18 ,20, Proteomics21oder Metabolomik22. Experimente können auf verschiedenen Ebenen, von einzelnen Fett stellen Gruppen von Hunderten durchgeführt werden, die zusammen kultiviert werden können.
Die repräsentativen Ergebnisse hier stammen aus Fett Körper kultiviert im Beisein von Aminosäuren und das Steroidhormon 20-hydroxy Ecdyson die Blutmahlzeit Aktivierung des Vitellogenesis16,17zu simulieren, 23,24. Wir haben analysiert und verglichen die differenzielle Genexpression versus aktivierte Fett Körper über Next Generation Sequencing Analyse nicht aktiviert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="508">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:64px;">Scissors&#160;</td>
			<td style="width:192px;">Fiskars</td>
			<td style="width:143px;">83872</td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:64px;">Fly pad</td>
			<td style="width:192px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:143px;">789060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:64px;">Battery-powered aspirator w/ collection vial</td>
			<td style="width:192px;">Hausherrs Machine Works, Inc.</td>
			<td style="width:143px;">3740-01-210-2368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:64px;">Fine tip forceps</td>
			<td style="width:192px;">World Precision Instruments, Inc.&#160;</td>
			<td style="width:143px;">500085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:64px;">Light microscope&#160;</td>
			<td style="width:192px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:64px;">96 well plate&#160;</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">CL S3383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:64px;">Sucrose</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Alanine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Arginine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>A5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Asparagine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>A0884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Aspartic Acid</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>A9256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Cysteine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>W326305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glutamic Acid</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>G1251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glutamine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glycine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>G2879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Histidine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>H6034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Isoleucine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Lysine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Leucine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Phenylalanine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Proline</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Serine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Threonine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tryptophan</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>T0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tyrosine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Valine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Methionine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:64px;">NaCl</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:64px;">KCl</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:64px;">MgCl2-6H2O</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:64px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:64px;">CaCl2-2H2O</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>C8106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:64px;">Tris pH8.0&#160;</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:64px;">EDTA</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:64px;">ddH2O</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fat body organ culture system in aedes aegypti, a vector of zika virus

Das Insekt fetten Körper spielt eine zentrale Rolle im Insekt Stoffwechsel und Nährstoffspeicherung, Spiegelung Funktionen der Leber und Fettgewebe bei Wirbeltieren. Insekt Fett Körpergewebe wird in der Regel das Insekt Körper verteilt. Es ist jedoch oft in den Bauch konzentriert und an der Bauchdecke Körper befestigt.
Der Moskito-Fett-Körper ist die einzige Quelle von Proteinen, Eigelb, die entscheidend für die Eierproduktion. Die in-vitro- Kultur von Moskito Fett Körpergewebe stellt daher, ein wichtiges System für das Studium der Moskito Physiologie, Stoffwechsel und letztlich, Ei-Produktion. Der fetten Körper-Kultur-Prozess beginnt mit der Vorbereitung der Lösungen und Reagenzien, einschließlich Aminosäure Stammlösungen, Aedes physiologischer Kochsalzlösung Salz-Stammlösung (APS), Kalzium-Stammlösung und fetten Körper Kulturmedium. Der Prozess wird fortgesetzt mit fetten Körper Dissektion, gefolgt von einer experimentellen Behandlung. Nach der Behandlung kann eine Vielzahl von verschiedenen Analysen durchgeführt werden, einschließlich RNA Sequenzierung (RNA-Seq), qPCR, Western Blots, Proteomik und Metabolomik.
In unserem Beispiel Experiment zeigen wir das Protokoll durch die Exzision und Kultur der Körper Fett vom Gelbfieber Moskito, Aedes Aegypti, wichtigsten Überträger von Arboviren einschließlich Dengue-Fieber, Chikungunya und Zika. RNA aus Fett Körper kultiviert unter einer physiologischen Zustand bekannt, Upregulate Eigelb Proteine im Vergleich zu der Kontrolle unterstanden RNA-Seq-Analyse zu den potenziellen Nutzen dieses Verfahrens für Untersuchungen der Genexpression zu demonstrieren.

Als Beispiel wir eine fetten Körper-Kultur-Experiment durchgeführt und isolierten Fett Körper durch sie auf eine Lösung mit einer ausgewogenen Mischung aus allen 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren und das Insekt Steroidhormon 20-hydroxy Ecdyson (10 µM) für 6 h Inkubation stimuliert . Als Kontrolle wurden Fett Körper auf APS für eine gleich lange Zeit inkubiert.
Nach der Inkubation wurde die gesamte-RNS isoliert mit einem Tri-Reagenz27 nach den Anweisungen des Herstellers. Die Qualität und Quantität der extrahierten RNA-Proben wurden mit einem Spektralfotometer, fluorometrisch Quantifizierung und Agarose-Gelelektrophorese bewertet. RNA Sequenzierung Bibliotheken erzeugt wurden, mit 4 µg Gesamt-RNS und wurden mit zwei verschiedenen Techniken quantifiziert. Anschließend wurden die Bibliotheken für die gekoppelten Ende-Sequenzierung kommerzieller Anbieter geschickt.
Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 6dargestellt. Gene zeigt die stärkste transcriptional Antwort auf Aminosäure und 20-Hydroxyecdysone waren in erster Linie Eigelb Protein Gene, die in Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen11ist.
Abbildung 1 zeigt, dass eine Heatmap zeigt gen Ausdruck Niveaus von 1.256 differentiell Gene aus kultivierten Fett Körper nach zwei unterschiedlichen Behandlungen zum Ausdruck gebracht.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55508/55508fig1.jpg"> 
Abbildung 1 . Heatmap der Gene in der fetten Körperkultur. Die Heatmap wurde basierend auf der Anzahl der spezifische Protokolle für jedes Gen in den verschiedenen Bibliotheken mit der Heatmap Paket28 , die Teil der R-Software-Umgebung ist berechnet. Dunkler Schatten stellt höhere Genexpression. 1.256 Gene mit statistisch signifikante Variation im Ausdruck (Q-Werte &#60; 0,05) werden angezeigt. Die Gene sind entsprechend ihrer gemittelten Ausdruck, angezeigt durch das Dendrogramm auf der linken Seite (nicht nach ihrer phylogenetischen Beziehungen) bestellt. Beachten Sie die hohe Zahl von Genen mit Up - oder Down-regulierte Expression nach Stimulation mit Aminosäuren (AA) und 20-Hydroxyecdysone (20E). APS = Aedes physiologischer Kochsalzlösung. Finden Sie eine Liste der Gene und ihrer relativen Ausdruck Niveaus ergänzende Datei 1 . <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55508/55508fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aminosäure</td>
			<td>Molekulargewicht g/mol</td>
			<td>mM Konzentration</td>
			<td>mg / l</td>
			<td>mg für 300 mL Volumen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alanin</td>
			<td>89,1</td>
			<td>26.68</td>
			<td>2377.19</td>
			<td>713.16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginin</td>
			<td>174,2</td>
			<td>26.68</td>
			<td>4647.66</td>
			<td>1394.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asparagin</td>
			<td>150.1</td>
			<td>26.68</td>
			<td>4004.67</td>
			<td>1201.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asparaginsäure</td>
			<td>133</td>
			<td>26.68</td>
			<td>3548.44</td>
			<td>1064.53</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cystein</td>
			<td>121.16</td>
			<td>10,68</td>
			<td>1293.99</td>
			<td>388,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaminsäure</td>
			<td>147,1</td>
			<td>26.68</td>
			<td>3924.63</td>
			<td>1177.39</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamin</td>
			<td>146</td>
			<td>26.68</td>
			<td>3895.28</td>
			<td>1168.58</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycin</td>
			<td>75</td>
			<td>53.32</td>
			<td>3999</td>
			<td>1199.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histidin</td>
			<td>155.16</td>
			<td>80</td>
			<td>12412.8</td>
			<td>3723.84</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoleucin</td>
			<td>131</td>
			<td>10,68</td>
			<td>1399.08</td>
			<td>419.72</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lycine</td>
			<td>183</td>
			<td>26.68</td>
			<td>4882.44</td>
			<td>1464.73</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucin</td>
			<td>131</td>
			<td>26.68</td>
			<td>3495.08</td>
			<td>1048.52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylalanin</td>
			<td>165</td>
			<td>10,68</td>
			<td>1762.2</td>
			<td>528.66</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLine</td>
			<td>115</td>
			<td>26.68</td>
			<td>3068.2</td>
			<td>920.46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serin</td>
			<td>105</td>
			<td>53.32</td>
			<td>5598.6</td>
			<td>1679.58</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threonin</td>
			<td>119</td>
			<td>10,68</td>
			<td>1270.92</td>
			<td>381.28</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptophan</td>
			<td>204</td>
			<td>10,68</td>
			<td>2178.72</td>
			<td>653.62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrosin</td>
			<td>181</td>
			<td>5.32</td>
			<td>962.92</td>
			<td>288.88</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valin</td>
			<td>117</td>
			<td>10,68</td>
			<td>1249.56</td>
			<td>374.87</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionin</td>
			<td>149</td>
			<td>10,68</td>
			<td>1591.32</td>
			<td>477,4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1. 4 x Aminosäure-Stammlösung.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponente</td>
			<td>Gewicht in Gramm, 50 ml DdH2O hinzugefügt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>8,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>0,074 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2-6 H2O</td>
			<td>0,120 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nahco33</td>
			<td>0,0250 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 2. 20 X Salz-Stammlösung.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponente</td>
			<td>Gewicht in Gramm, 100 ml ddH2O hinzugefügt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2-2 H2O</td>
			<td>0,90 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<stron></stron>g > Tabelle 3. 50 x Kalzium-Stammlösung.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponente</td>
			<td>Konzentration der Stammlösung</td>
			<td>Volumen-Lager für 100 ml Puffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-pH8.0</td>
			<td>1 M</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>0,25 M</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>NA</td>
			<td>0,3 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DdH2O</td>
			<td>NA</td>
			<td>100 ml (~ 93 mL)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 4. Tris-Puffer.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponente</td>
			<td>Volumen-Lager für 200 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosäure-Stammlösung</td>
			<td>150 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salz-Stammlösung</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kalzium-Stammlösung</td>
			<td>4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES Puffer</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>26 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 5. Fetten Körper Kulturmedium.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Annotation</td>
			<td>Gen-Beschreibung</td>
			<td>Falten Sie ändern</td>
			<td>P-Wert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL006138</td>
			<td>Vitellogenin-B</td>
			<td>3443</td>
			<td>2.52E-112</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL006126</td>
			<td>Vitellogenin-C</td>
			<td>2795</td>
			<td>8.64E-91</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL006563</td>
			<td>vitellogenic carboxypeptidase</td>
			<td>1002</td>
			<td>2.17E-119</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL010434</td>
			<td>Vitellogenin-A</td>
			<td>220</td>
			<td>1.14E-27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL006542</td>
			<td>vitellogenic carboxypeptidase</td>
			<td>185</td>
			<td>2.14E-65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL012678</td>
			<td>AAEL003006-PA [Aedes aegypti](65%)</td>
			<td>96</td>
			<td>4.00E-70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL000080</td>
			<td>hypothetische protein</td>
			<td>82</td>
			<td>6.69E-188</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL015312</td>
			<td>Vitellogenic Cathepsin B</td>
			<td>77</td>
			<td>1.27E-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL009588</td>
			<td>nukleare Rezeptor 3</td>
			<td>75</td>
			<td>4.58E-56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL010529</td>
			<td>hypothetische protein</td>
			<td>66</td>
			<td>1.32E-29</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 6. Experimentelle Ergebnisse.
Ergänzende Datei 1. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55508/Table_of_genes_for_figure_1.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>

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Mikroinjektion von A. aegypti Embryonen, um transgene Moskitos erhalten

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

Primäre Kultur und Plasmid Elektroporation der Murine Corti-Organ.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-vermittelte Gen-Knockdown und<em&gt; In Vivo</em&gt; Diurese Assay in Adult Female<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Moskitos

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Maus embryonalen Entwicklung in einem Serum-freien Whole Embryo Culture-System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Physiologische Aufnahmen und RNA-Sequenzierung der gustatorischen Anhangsgebilde der Gelbfieber-Moskito-<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Pflege, Aedes Aegypti Moskitos mit Wolbachia infizierte

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates)

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates EAgaL Plates

Verbesserte Fecundity und Fruchtbarkeit Assay für Aedes aegypti mit 24 Well Tissue Culture Platten (EAgaL Platten)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness ...

Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program

Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program

Vorbereitung bestrahlter und markierter männlicher Aedes aegypti-Moskitos für die Freisetzung in einem operationellen sterilen Insektentechnikprogramm

The control of such human diseases as dengue, Zika, and chikungunya relies on the control of their vector, the Aedes aegypti mosquito, because there is no ...

Using the Fluorescent Dye, Rhodamine B, to Study Mating Competitiveness in Male Aedes aegypti Mosquitoes

Using the Fluorescent Dye, Rhodamine B, to Study Mating Competitiveness in Male Aedes aegypti Mosquitoes

Verwendung des fluoreszierenden Farbstoffs Rhodamin B zur Untersuchung der Paarungswettbewerbsfähigkeit bei männlichen Aedes aegypti-Moskitos

The success of sterile or incompatible insect technique-based population suppression programs depends on the ability of released males to compete for ...