Name: fat body organ culture system in aedes aegypti, a vector of zika virus
Uploaded: 2017-08-19T13:00:00
Duration: 6 min 18 s
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इस अनुसंधान NIH अनुदान #SC1AI109055, २०१४ NMSU HHMI अनुदान #52008103, और NSF पीजीआर अनुदान #1238731 द्वारा समर्थित किया गया था । हम वसा शरीर संस्कृति प्रयोगों के साथ उनके तकनीकी सहायता के लिए NMSU स्प्रिंग २०१५ BIOL302 आणविक तरीकों वर्ग और लवेश भाटिया के प्रतिभागियों को धंयवाद ।

1. समाधान और रिएजेंट तैयार कर रहा है <ol> <li> एमिनो एसिड स्टॉक समाधान <ol> <li> एक 4x एमिनो एसिड स्टॉक समाधान तैयार करें < सुप class = "xref" > 23 , < सुप class = "xref" > 24 तक वजनी और तालिका 1 . में दी गई सांद्रता के अनुसार एक Erlenmeyer कुप्पी के लिए 20 अलग अमीनो एसिड जोड़ना
		नोट: कुछ मामलों में, एमिनो एसिड (ओं) समाधान से बाहर रखा जा सकता है और osmolytes के बराबर एकाग्रता बनाए रखने के लिए mannitol के बराबर दाढ़ मात्रा द्वारा प्रतिस्थापित. </li>
		<li> उपयुक्त मात्रा में जोड़ें ddH 2 O समाधान की वांछित मात्रा का उत्पादन करने के लिए. </li>
		<li> यह सुनिश्चित करने के लिए कि एमिनो एसिड पूरी तरह से भंग कर दिया है, धीरे जबकि लगातार सरगर्मी जब तक तरल पूरी तरह से स्पष्ट है; यह थोड़ी सी पीली छटा पर ले जाएगा । 
		नोट: यह 6 से पीएच को कम करने के लिए आवश्यक हो सकता है एचसीएल जोड़कर कुछ अधिक hydrophobic अमीनो एसिड को भंग करने की अनुमति है । </li>
		<li> Aliquot समाधान और बाँझ-फिल्टर के साथ एक सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर ०.२-& #181; मी पोरे आकार. </li>
		<li> स्टोर एक सील कंटेनर में-20 & #176; C 6 माह तक के लिए । </li>
	</ol> </li> <li> अनुप नोट: See < सुप वर्ग = "xref" > २५ .
	<ol> <li> 20X नमक स्टॉक समाधान के लिए, तालिका में सूचीबद्ध लवण 2 पानी की ५० मिलीलीटर में गठबंधन । हलचल जब तक पूरी तरह भंग. 
		नोट: यह करने के लिए थोड़ा नमक पूरी तरह से भंग समाधान गर्मी आवश्यक हो सकता है । </li>
		<li> बाँझ-फ़िल्टर एक ०.२-& #181 के साथ एक सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर; m ताकना आकार और एक में समाधान की दुकान ५०-एमएल ट्यूब पर-20 & #176; ग. </li>
	</ol> </li> <li> कैल्शियम स्टॉक सॉल्यूशन <ol> <li> 50X कैल्शियम स्टॉक समाधान के लिए, कैल्शियम क्लोराइड के ०.९० ग्राम को १०० मिलीलीटर पानी ( Table 3 ) में जोड़ें; पूरी तरह से भंग होने तक हलचल । </li>
		<li> बाँझ-०.२-& #181 के साथ एक सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर फिल्टर; मी पोरे आकार, aliquot में समाधान ५०-एमएल ट्यूबों, और स्टोर पर-20 & #176; C. </li>
	</ol> </li> <li> Tris बफर (pH ७.४) <ol> <li> Tris बफर के लिए, नमक और समाधान तालिका 4 में सूचीबद्ध है और जोड़ें ddH 2 O अप करने के लिए १०० मिलीलीटर. </li>
		<li> बाँझ-एक ०.२-& #181 के साथ एक सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर फिल्टर; m ताकना आकार और aliquot में समाधान ५०-एमएल ट्यूबों; कमरे के तापमान पर स्टोर । </li>
	</ol> </li> <li> वसा शरीर संस्कृति मध्यम <ol> <li> वसा शरीर संस्कृति माध्यम तैयार करने के लिए, ऊपर सूचीबद्ध सभी समाधानों को तैयार करें । </li>
		<li> उंहें तालिका 5 में मात्रा के अनुसार वसा शरीर संस्कृति मध्यम के २०० मिलीलीटर बनाने के लिए गठबंधन । </li>
		<li> ७.२ NaOH या एचसीएल का उपयोग करने के लिए पीएच समायोजित करें. </li>
		<li> बाँझ-एक ०.२-& #181 के साथ एक सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर समाधान फ़िल्टर; मी पोरे आकार. </li>
		<li> घोल को 15-एमएल aliquots में बांटें और स्टोर पर-20 & #176; ग को 6 माह तक के लिए । </li>
	</ol> </li> </ol> 2. विच्छेदन के लिए तैयार करना <ol> <li> रोशनी के साथ एक stereomicroscope (10-20x आवर्धन) तैयार है और दो अल्ट्रा ठीक चिमटी और सूक्ष्म विच्छेदन कैंची की एक जोड़ी बाहर करना । </li>
	<li> प्रयोग के लिए आवश्यक सभी समाधान तैयार करते हैं । वसा शरीर संस्कृति मध्यम कमरे के तापमान गल । 
	नोट: Precipitants को धीरे से हल ताप से भंग किया जा सकता है कोई 30 से अधिक & #176; C. </li>
	एक aspirator के साथ <li>, वयस्क मादा मच्छरों इकट्ठा (3-7 दिनों के बाद उद्भव) और उंहें anesthetize कार्बन डाइऑक्साइड या बर्फ का उपयोग कर । 
	नोट: एक बार anesthetized, मच्छरों सह 2 के तहत कम से अधिक संभव समय के लिए रखा जाना चाहिए, से अधिक नहीं 20 मिनट । वैकल्पिक रूप से, मच्छरों बर्फ पर anesthetized किया जा सकता है और लगभग 30 मिनट के लिए रखा । </li>
	<li> अच्छी तरह से प्रति एपीएस के 3 मिलीलीटर के साथ एक 6 अच्छी तरह से थाली तैयार करते हैं । </li>
</ol> 3. वसा शरीर विच्छेदन <ol> <li> ध्यान विदारक stereomicroscope और कुर्सी को एक आरामदायक ऊंचाई पर समायोजित करें । </li>
	<li> माइक्रोस्कोप की सतह पर एक गुफा माइक्रोस्कोप स्लाइड जगह और केंद्र के लिए एपीएस के दो बूंदें जोड़ें. </li>
	<li> एक संदंश का उपयोग कर एक पैर से एक मच्छर उठाओ और यह खुर्दबीन स्लाइड पर ए पी एस सतह पर स्थानांतरण । </li>
	<li> सावधानी से छाती द्वारा मच्छर पकड़, बाएं हाथ में संदंश के साथ, और मक्खी मच्छर इतना है कि ventral पक्ष ऊपर की ओर है । </li>
	<li> जबकि छाती द्वारा स्थिर शरीर धारण, पिछले दो उदर खंडों समझ, दाहिने हाथ में संदंश के साथ, और धीरे खींचो । 
	नोट: पिछले दो उदर खंडों पेट और संलग्न अंडाशय, Malpighian नलिकाओं, hindgut, और midgut से अलग होगा; कभी-कभार फसल को पेट के बाहर स्लाइड कर देंगे । यदि उन्हें हटाया नहीं गया है, तो बनाए गए छोटे छेद में संदंश के बंद सुझावों को डालें और शेष ऊतकों को हटा दें. </li>
	<li> एक तरफ सही संदंश सेट और वसंत कैंची उठाओ । छाती नीचे खंड करने के लिए पेट में छेद में एक ब्लेड स्लाइड । धीरे से और तेजी से पेट काट लंबाई. 
	नोट: एक बार काट दिया गया है, पेट के लिए जावक विस्तार शुरू कर देना चाहिए, हालांकि यह तुरंत नहीं हो सकता है । </li>
	<li> आगे बढ़ने के लिए दूसरी कट, जो छाती नीचे एक पार्श्व कटौती और थोड़ा नीचे जहां पहली कटौती समाप्त हो जाएगा । 
	नोट: पेट तो खुला होना चाहिए और छाती से अलग, छल्ली ऊपर और वसा वाले शरीर के साथ-साथ एपीएस के भीतर डूबे. इस पेट के शरीर की दीवार में के लिए फैट बॉडी तैयारी है इन विट्रो कल्चर. </li>
	<li> संदंश की एक जोड़ी की नोक का उपयोग कर ए पी एस समाधान से वसा शरीर लिफ्ट और उंहें समाधान से 6 अच्छी तरह से कमरे के तापमान पर एपीएस युक्त थाली स्थानांतरण । ऊतक वसा शरीर संस्कृति को आगे बढ़ाने से पहले लगभग ०.५ ज के लिए आराम करने के लिए अनुमति दें । </li>
</ol> 4. फैट शारीरिक संस्कृति <ol> <li> कम से equilibrate के लिए कमरे के तापमान पर ए पी एस पर वसा शरीर की गर्मी उंहें करने के लिए ०.५ ज । </li>
	<li> संदंश के टिप का उपयोग कर वसा निकायों हस्तांतरण और धीरे से उंहें पी ए एस समाधान के बाहर उठा । वसा शरीर संस्कृति माध्यम में टिप कम । 
	नोट: फैट शरीर मध्यम की सतह पर खुला और स्वतंत्र रूप से नाव चाहिए । वसा शरीर की संस्कृति आम तौर पर ९६-अच्छी तरह से प्लेटों में प्रदर्शन किया है, 150-200 & #181 के साथ, एक अच्छी तरह से में माध्यम के एल । एक अच्छी तरह से तीन व्यक्तिगत वसा शरीर के लिए फिट कर सकते हैं, और वे 12 से अधिक एच (अप्रकाशित व्यक्तिगत परिणाम) के लिए व्यवहार्य हैं । </li>
	<li> मशीन अवधि के बाद, १.५ में मध्यम से वसा शरीर हस्तांतरण-एमएल, बहाव प्रसंस्करण के लिए उपयुक्त एजेंट युक्त ट्यूबों केंद्रापसारक । 
	नोट: विशिष्ट विश्लेषण शामिल qPCR < सुप वर्ग = "xref" > १६ , < सुप class = "xref" > 17 , < सुप class = "xref" > 18 , < सुप class = "xref" > 19 , वेस्टर्न सोख्ता < सुप क्लास = "xref" > 18 , < सुप वर्ग = "xref" > 20 , transcriptomics < सुप क्लास = "xref" > 26 , प्रोटियोमिक् < सुप क्लास = "xref" > 21 , या metabolomics < सुप क्लास = "xref" > 22 . </li>
</ol>

<ol>
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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+and+transport+mechanism+of+amino-acid+transceptor+Slimfast+from+Aedes+aegypti.">Substrate specificity and transport mechanism of amino-acid transceptor Slimfast from Aedes aegypti.</a> Nat Commun. 6, 8546 (2015).</li><li>Fleischer, J., Bumbalo, R., Bautze, V., Strotmann, J., Breer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+odorant+receptor+Olfr78+in+enteroendocrine+cells+of+the+colon.">Expression of odorant receptor Olfr78 in enteroendocrine cells of the colon.</a> Cell Tissue Res. 361 (3), 697-710 (2015).</li><li>Jones, K. H., Senft, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+to+determine+cell+viability+by+simultaneous+staining+with+fluorescein+diacetate-propidium+iodide.">An improved method to determine cell viability by simultaneous staining with fluorescein diacetate-propidium iodide.</a> J Histochem Cytochem. 33 (1), 77-79 (1985).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr Protoc Immunol. A3B, (2001).</li></ol>

हमारे पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

कीट अंग संस्कृति बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया था कीट अंतःस्त्राविका, विकास, और चयापचय का अध्ययन करने के लिए, साथ ही विशिष्ट अंगों और बैक्टीरियल symbionts के बीच बातचीत की जांच करने के लिए29,30,31, ३२,३३,३४. इन विट्रो में वसा शरीर अंग संस्कृति विशेष रूप से एमिनो एसिड परिवहन और मच्छरों और अन्य Dipteraमें जर्दी प्रोटीन उत्पादन के विनियमन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था16,17,३५ , ३६. vitellogenesis की प्रक्रिया के दौरान, मच्छर वसा शरीर उच्च विशिष्टता एमिनो एसिड ट्रांसपोर्टरों की एक सरणी का उपयोग करता है रक्त भोजन का आयात करने के लिए hemolymph से प्राप्त अमीनो एसिड की जर्दी प्रोटीन की बड़ी मात्रा को संश्लेषित करने के लिए12 ,19,३५,३६. फैट शारीरिक संस्कृति इस संदर्भ में वसा शरीर पोषण संबंधी आवश्यकताओं के विरेखा के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी18।
प्रारंभिक सामग्री की गुणवत्ता, मादा मच्छरों, इन प्रयोगों की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है । मच्छर लार्वा के तहत भीड़ की स्थिति में उठाया और उच्च पोषक आहार पर खिलाया आम तौर पर सबसे अच्छा परिणाम का उत्पादन । वहां कुछ महत्वपूर्ण चर जब प्रयोगात्मक डिजाइन के संदर्भ में प्रयोगशाला में मच्छर वसा शरीर संस्कृति की स्थिति को स्थापित करने पर विचार कर रहे हैं । हम पिछले अध्ययनों में पता चला है कि वसा शरीर जीन अभिव्यक्ति काफी अलग जीवन के इतिहास और मच्छर11,22के पोषण की स्थिति के आधार पर बदलता है । प्रयोगात्मक मच्छरों के आकार और पोषण के भंडार में परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए मच्छर संस्कृति की स्थितियां एकसमान होनी चाहिए । इसके अलावा, विच्छेदों प्रदर्शन कर्मियों लगातार परिणाम के साथ तेजी से और सही विच्छेदन सुनिश्चित करने के लिए प्रशिक्षित किया जाना चाहिए । अलग वसा निकायों में कोशिका व्यवहार्यता विभिंन धुंधला तरीके३७,३८का उपयोग कर जांच की जा सकती है ।
एक वसा शरीर संस्कृति प्रयोग के प्रायोगिक डिजाइन ध्यान में एक निश्चित समय अवधि में संभव विच्छेदन की संख्या में ले जाना चाहिए । जब वसा निकायों की बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है, तो एकाधिक विच्छेदन सत्र या एकाधिक विखण्डन आवश्यक हो सकते हैं । इन विट्रो में के लिए भविष्य अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला है मच्छरों और अन्य कीड़ों में वसा शरीर संस्कृति. यह कीट नियंत्रण के लिए संभावित दवा उम्मीदवारों के परीक्षण के लिए विशेष रूप से उपयोगी होगा । कीड़ों में ट्रांसजेनिक तकनीक का उपयोग करने के लिए वसा शरीर में विशिष्ट रिपोर्टर प्रोटीन व्यक्त trophocytes नए तरीकों को खोलने के लिए वसा शरीर शरीर क्रिया विज्ञान के अध्ययन के लिए शक्तिशाली परख विकसित होगा ।

मच्छर मलेरिया, डेंगू बुखार, chikungunya, और Zika1,2,3सहित विनाशकारी मानव रोगों के वैक्टर हैं । तीव्र अंतरराष्ट्रीय इन रोगों पर अंकुश लगाने और रोग संचारण मच्छर आबादी को नियंत्रित करने के प्रयासों के बावजूद, मच्छर जनित रोगों के महामारी फैलने अभी भी आम है, विशेष रूप से विकासशील देशों में । इन रोगों के कई के खिलाफ प्रभावी टीके या तो उपलब्ध नहीं है या सीमित प्रभावकारिता4,5। प्रकोप को रोकने के लिए सबसे प्रभावी तरीका है मच्छर आबादी को नियंत्रित करने के लिए, मुख्य रूप से कीटनाशक उपचार के उपयोग के माध्यम से । हालांकि, कीटनाशक प्रतिरोध कई मच्छर आबादी में विकसित किया गया है और दुनिया6,7,8के आसपास एक आम समस्या बन जाते हैं । मच्छर फिजियोलॉजी के अध्ययन से रोग को नियंत्रित करने के लिए उपन्यास उपकरणों और रणनीतियों के विकास के लिए आवश्यक है ।
मच्छर वसा शरीर पोषक तत्व भंडारण, चयापचय homeostasis, प्रजनन, और xenobiotic catabolism9,10,11,12में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है । यह भंडारण प्रोटीन के रूप में ट्राइग्लिसराइड्स, ग्लाइकोजन, और एमिनो एसिड के लिए मुख्य भंडारण अंग है । यह सबसे hemolymph प्रोटीन और चयापचयों के लिए संश्लेषण के स्थान के रूप में भी कार्य करता है । मच्छरों में, वसा शरीर की जर्दी प्रोटीन उत्पादन का एकमात्र स्रोत है कि महिलाओं में होता है के बाद वे एक रक्त भोजन13,14ले ।
वसा शरीर के प्रमुख कोशिका प्रकार बड़े, polyploid trophocyte या adipocyte3,9,10,12है । वसा शरीर के ऊतकों पालि या खोल में आयोजित किया जाता है और मच्छर के सभी शरीर के अंगों में पाया जा सकता है, पेट में स्थित सबसे बड़ा भाग के साथ, वसा शरीर के बड़े पालियों उदर शरीर की दीवार से जुड़े होते हैं ।
मच्छर वसा शरीर संस्कृति प्रणाली यहां प्रस्तुत 70 में विकसित किया गया था और वसा शरीर फिजियोलॉजी10, विशेष रूप से वर्तमान विश्लेषण प्रौद्योगिकियों के साथ संयोजन में अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण रहता है । इस तकनीक की नींव पेट के शरीर की दीवारों और जुड़े वसा शरीर के ऊतकों के अलगाव पर आधारित है । उदर छल्ली की hydrophobic प्रकृति यह संस्कृति माध्यम की सतह पर तैरता करने के लिए कारण बनता है, पेट वसा शरीर के संलग्न पालियों के साथ डूबे । spiracles और tracheolar संरचना बनाए रखा है, संस्कृतिक ऊतक के ऑक्सीजन सुनिश्चित करने । इसके बाद, हम ' के रूप में वसा निकायों इन तैयारियों का उल्लेख करेंगे । अलग वसा निकायों 12 से अधिक ज जब उचित माध्यम (अप्रकाशित परिणाम) में मशीन के लिए व्यवहार्य रहते हैं । वसा शरीर संस्कृति एक महत्वपूर्ण उपकरण है कि वसा शरीर अंतःस्त्राविका और फिजियोलॉजी9,10,12,15,16के बारे में सवालों की एक किस्म को संबोधित किया है, 17.
प्रसंस्कृत वसा निकायों विभिंन प्रयोगात्मक और नियंत्रण उपचार के अधीन किया जा सकता है, जिस समय के अंवेषक द्वारा पर फैसला किया जा सकता है । गर्मी की अवधि के अंत में, वसा निकायों को एकत्र किया जा सकता है और बहाव के विश्लेषण के लिए संसाधित, जिसमें qPCR16,17,18,19, पश्चिमी सोख्ता18 ,२०, प्रोटियोमिक्२१, या metabolomics२२. प्रयोगों अलग तराजू पर किया जा सकता है, व्यक्तिगत वसा निकायों से सैकड़ों के समूहों के लिए है कि एक साथ किया जा सकता है ।
प्रतिनिधि परिणाम यहां शामिल वसा एमिनो एसिड और स्टेरॉयड हार्मोन 20-hydroxy ecdysone की उपस्थिति में प्रसंस्कृत शरीर से व्युत्पंन थे vitellogenesis के रक्त भोजन सक्रियण का अनुकरण करने के लिए16,17, 23,24. हम विश्लेषण और नहीं की विभेदक जीन अभिव्यक्ति की तुलना सक्रिय बनाम सक्रिय वसा निकायों अगली पीढ़ी अनुक्रमण विश्लेषण के माध्यम से ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="508">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:64px;">Scissors&#160;</td>
			<td style="width:192px;">Fiskars</td>
			<td style="width:143px;">83872</td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:64px;">Fly pad</td>
			<td style="width:192px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:143px;">789060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:64px;">Battery-powered aspirator w/ collection vial</td>
			<td style="width:192px;">Hausherrs Machine Works, Inc.</td>
			<td style="width:143px;">3740-01-210-2368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:64px;">Fine tip forceps</td>
			<td style="width:192px;">World Precision Instruments, Inc.&#160;</td>
			<td style="width:143px;">500085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:64px;">Light microscope&#160;</td>
			<td style="width:192px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:64px;">96 well plate&#160;</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">CL S3383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:64px;">Sucrose</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Alanine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Arginine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>A5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Asparagine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>A0884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Aspartic Acid</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>A9256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Cysteine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>W326305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glutamic Acid</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>G1251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glutamine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glycine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>G2879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Histidine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>H6034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Isoleucine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Lysine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Leucine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Phenylalanine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Proline</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Serine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Threonine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tryptophan</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>T0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tyrosine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Valine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Methionine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:64px;">NaCl</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:64px;">KCl</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:64px;">MgCl2-6H2O</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:64px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:64px;">CaCl2-2H2O</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>C8106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:64px;">Tris pH8.0&#160;</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:64px;">EDTA</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:64px;">ddH2O</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fat body organ culture system in aedes aegypti, a vector of zika virus

कीट वसा शरीर कीट चयापचय और पोषक तत्व भंडारण में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है, जिगर और रीढ़ में वसा ऊतक के कार्यों को प्रतिबिंबित । कीट वसा शरीर के ऊतकों आमतौर पर कीट शरीर भर में वितरित किया जाता है । हालांकि, यह अक्सर पेट में केंद्रित है और उदर शरीर की दीवार से जुड़ी है ।
मच्छर वसा शरीर की जर्दी प्रोटीन का एकमात्र स्रोत है, जो अंडे के उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण हैं । इसलिए, मच्छर वसा शरीर के ऊतकों की इन विट्रो संस्कृति मच्छर शरीर क्रिया विज्ञान, चयापचय के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण प्रणाली का प्रतिनिधित्व करता है, और, अंत में , अंडा उत्पादन. वसा शरीर संस्कृति प्रक्रिया के समाधान और रिएजेंट की तैयारी के साथ शुरू होता है, अमीनो एसिड स्टॉक समाधान सहित, एडीज शारीरिक खारा नमक स्टॉक समाधान (ए पी एस), कैल्शियम स्टॉक समाधान, और वसा शरीर संस्कृति माध्यम । प्रक्रिया वसा शरीर विच्छेदन के साथ जारी है, एक प्रयोगात्मक उपचार के बाद । उपचार के बाद, विभिन्न विश्लेषणों की एक किस्म है, आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-Seq), qPCR, पश्चिमी दाग, प्रोटियोमिक्, और metabolomics सहित प्रदर्शन किया जा सकता है ।
हमारे उदाहरण प्रयोग में, हम पीले बुखार मच्छर, एडीज aegypti, डेंगू, chikungunya, और Zika सहित arboviruses के एक प्रमुख वेक्टर से वसा शरीर के उत्पाद और संस्कृति के माध्यम से प्रोटोकॉल का प्रदर्शन । वसा शरीर से आरएनए एक शारीरिक की जर्दी प्रोटीन को नियंत्रित करने के लिए जाना जाता हालत के तहत संस्कृति बनाम नियंत्रण आरएनए-Seq विश्लेषण के लिए जीन अभिव्यक्ति की जांच के लिए इस प्रक्रिया की क्षमता की उपयोगिता प्रदर्शित करने के लिए विषय थे ।

एक उदाहरण के रूप में, हम एक वसा शरीर संस्कृति प्रयोग प्रदर्शन किया और उंहें एक संतुलित मिश्रण के सभी बीस स्वाभाविक रूप से होने वाली अमीनो एसिड और कीट स्टेरॉयड हार्मोन 20-hydroxy ecdysone (10 µ एम) के लिए 6 ज युक्त समाधान पर उंहें मशीन द्वारा अलग वसा शरीर उत्तेजित . एक नियंत्रण के रूप में, वसा निकायों समय की एक बराबर राशि के लिए ए पी एस पर मशीन थे ।
मशीनीकरण के बाद, कुल आरएनए एक त्रि-एजेंट27 निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए पृथक किया गया था । गुणवत्ता और निकाली आरएनए नमूनों की मात्रा एक spectrophotometer, fluorometric quantitation, और agarose जेल ट्रो का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया । आरएनए अनुक्रमण पुस्तकालयों कुल आरएनए के 4 µ जी का उपयोग कर उत्पन्न किया गया और दो विभिन्न तकनीकों का उपयोग कर मात्रा थे. बाद में, पुस्तकालयों युग्मित अंत अनुक्रमण के लिए एक वाणिज्यिक प्रदाता के लिए भेजा गया था ।
इस प्रयोग के परिणाम तालिका 6में दिखाए जाते हैं । एमिनो एसिड और 20-hydroxyecdysone के लिए सबसे मजबूत transcriptional प्रतिक्रिया दिखा जीन मुख्य रूप से जर्दी प्रोटीन जीन थे, जो पिछले परिणामों के साथ समझौते में है11।
चित्रा 1 एक गर्मी १,२५६ के जीन अभिव्यक्ति के स्तर का संकेत है कि दो अलग उपचार के बाद संस्कृतिपूर्ण वसा शरीर से जीन व्यक्त के नक्शे से पता चलता है ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55508/55508fig1.jpg"> 
चित्र 1 . वसा शरीर की संस्कृति में व्यक्त जीन की हीट मानचित्र । हीट मानचित्र अलग पुस्तकालयों में प्रत्येक जीन के लिए विशिष्ट टेप की संख्या के आधार पर गणना की गई heatmap पैकेज28 का उपयोग कर रहा है कि आर सॉफ्टवेयर पर्यावरण का हिस्सा है । गहरा शेड उच्च जीन अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व करता है । अभिव्यक्ति में सांख्यिकीय महत्वपूर्ण भिन्नता के साथ १,२५६ जीन (Q-values & #60; ०.०५) दिखाए जाते हैं. जीन उनके औसत अभिव्यक्ति के स्तर के अनुसार आदेश दिए जाते हैं, बाईं तरफ dendrogram द्वारा संकेत (नहीं उनके वंशावली रिश्तों के अनुसार) । उच्च संख्या के साथ जीन के ऊपर या नीचे विनियमित अभिव्यक्ति अमीनो एसिड (एए) और 20-hydroxyecdysone (20E) के साथ उत्तेजना के बाद ध्यान दें । ए पी ए = एडीज शारीरिक खारा । पूरक फ़ाइल देखें 1 जीन और उनके सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर की सूची के लिए । <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55508/55508fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>एमिनो एसिड</td>
			<td>आणविक वजन जी/</td>
			<td>mM एकाग्रता</td>
			<td>मिलीग्राम प्रति लीटर</td>
			<td>३०० मिलीलीटर की मात्रा के लिए मिलीग्राम</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alanine</td>
			<td>८९.१</td>
			<td>२६.६८</td>
			<td>२३७७.१९</td>
			<td>७१३.१६</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>arginine</td>
			<td>१७४.२</td>
			<td>२६.६८</td>
			<td>४६४७.६६</td>
			<td>१३९४.३</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asparagine</td>
			<td>१५०.१</td>
			<td>२६.६८</td>
			<td>४००४.६७</td>
			<td>१२०१.४</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>एसपारटिक अम्ल</td>
			<td>१३३</td>
			<td>२६.६८</td>
			<td>३५४८.४४</td>
			<td>१०६४.५३</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cysteine</td>
			<td>१२१.१६</td>
			<td>१०.६८</td>
			<td>१२९३.९९</td>
			<td>३८८.२</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamic अम्ल</td>
			<td>१४७.१</td>
			<td>२६.६८</td>
			<td>३९२४.६३</td>
			<td>११७७.३९</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamine</td>
			<td>१४६</td>
			<td>२६.६८</td>
			<td>३८९५.२८</td>
			<td>११६८.५८</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>७५</td>
			<td>५३.३२</td>
			<td>३९९९</td>
			<td>११९९.७</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histidine</td>
			<td>१५५.१६</td>
			<td>८०</td>
			<td>१२४१२.८</td>
			<td>३७२३.८४</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoleucine</td>
			<td>१३१</td>
			<td>१०.६८</td>
			<td>१३९९.०८</td>
			<td>४१९.७२</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lycine</td>
			<td>१८३</td>
			<td>२६.६८</td>
			<td>४८८२.४४</td>
			<td>१४६४.७३</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>leucine</td>
			<td>१३१</td>
			<td>२६.६८</td>
			<td>३४९५.०८</td>
			<td>१०४८.५२</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>फेनिलएलनिन</td>
			<td>१६५</td>
			<td>१०.६८</td>
			<td>१७६२.२</td>
			<td>५२८.६६</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proline</td>
			<td>११५</td>
			<td>२६.६८</td>
			<td>३०६८.२</td>
			<td>९२०.४६</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serine</td>
			<td>१०५</td>
			<td>५३.३२</td>
			<td>५५९८.६</td>
			<td>१६७९.५८</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threonine</td>
			<td>११९</td>
			<td>१०.६८</td>
			<td>१२७०.९२</td>
			<td>३८१.२८</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptophan</td>
			<td>२०४</td>
			<td>१०.६८</td>
			<td>२१७८.७२</td>
			<td>६५३.६२</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tyrosine</td>
			<td>१८१</td>
			<td>५.३२</td>
			<td>९६२.९२</td>
			<td>२८८.८८</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>वैलिन</td>
			<td>११७</td>
			<td>१०.६८</td>
			<td>१२४९.५६</td>
			<td>३७४.८७</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>मिथीयोनाईन</td>
			<td>१४९</td>
			<td>१०.६८</td>
			<td>१५९१.३२</td>
			<td>४७७.४</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
तालिका 1. 4x एमिनो एसिड स्टॉक समाधान ।
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>घटक</td>
			<td>ग्राम में वजन ५० मिलीलीटर ddH2हे जोड़ा गया</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nacl</td>
			<td>८.० छ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kcl</td>
			<td>०.०७४ छ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl२-6H२हे</td>
			<td>०.१२० छ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>०.०२५० छ</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
तालिका 2. 20X नमक स्टॉक समाधान.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>घटक</td>
			<td>ग्राम में वजन १०० मिलीलीटर ddH2O को जोड़ा</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl२-2H२हे</td>
			<td>०.९० छ</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<stron></stron>g > Table 3. 50X कैल्शियम स्टॉक समाधान ।
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>घटक</td>
			<td>स्टॉक समाधान की एकाग्रता</td>
			<td>१०० एमएल बफर के लिए वॉल्यूम स्टॉक</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris पीएच 8.0</td>
			<td>1 मीटर</td>
			<td>5 मिलीलीटर</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>edta</td>
			<td>०.२५ मीटर</td>
			<td>2 मिलीलीटर</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nacl</td>
			<td>ना</td>
			<td>०.३ छ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH२हे</td>
			<td>ना</td>
			<td>१०० मिलीलीटर (~ ९३ मिलीलीटर)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
तालिका 4. Tris बफ़र.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>घटक</td>
			<td>२०० एमएल के लिए वॉल्यूम स्टॉक</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>एमिनो एसिड स्टॉक समाधान</td>
			<td>१५० एमएल</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>नमक स्टॉक समाधान</td>
			<td>10 मिलीलीटर</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>कैल्शियम स्टॉक समाधान</td>
			<td>4 मिलीलीटर</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>द्वीतीय बफर</td>
			<td>10 मिलीलीटर</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>26 एमएल</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
तालिका 5. वसा शरीर संस्कृति माध्यम।
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>एनोटेशन</td>
			<td>जीन विवरण</td>
			<td>फ़ोल्ड बदलें</td>
			<td>पी-मान</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL006138</td>
			<td>Vitellogenin-बी</td>
			<td>३४४३</td>
			<td>2.52 ई-११२</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL006126</td>
			<td>Vitellogenin-सी</td>
			<td>२७९५</td>
			<td>8.64 ई-९१</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL006563</td>
			<td>vitellogenic carboxypeptidase</td>
			<td>१००२</td>
			<td>2.17 ई-११९</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL010434</td>
			<td>Vitellogenin-एक</td>
			<td>२२०</td>
			<td>1.14 ई-27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL006542</td>
			<td>vitellogenic carboxypeptidase</td>
			<td>१८५</td>
			<td>2.14 ई-६५</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL012678</td>
			<td>AAEL003006-पा [एडीज aegypti] (65%)</td>
			<td>९६</td>
			<td>4.00 ई-७०</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL000080</td>
			<td>काल्पनिक प्रोटीन</td>
			<td>८२</td>
			<td>6.69 ई-१८८</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL015312</td>
			<td>Vitellogenic cathepsin बी</td>
			<td>७७</td>
			<td>1.27 ई-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL009588</td>
			<td>परमाणु रिसेप्टर 3</td>
			<td>७५</td>
			<td>4.58 ई-५६</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL010529</td>
			<td>काल्पनिक प्रोटीन</td>
			<td>६६</td>
			<td>1.32 ई-29</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
तालिका 6. प्रायोगिक परिणाम.
पूरक फ़ाइल 1. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55508/Table_of_genes_for_figure_1.xlsx" target="_blank">इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.</a>

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