Name: detection of ligand-activated g protein-coupled receptor internalization by confocal microscopy
Uploaded: 2017-04-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy at JoVE.com

The authors of this paper would like to thank Prof. Jiayan Xie for technical assistance and equipment usage. This work was financially supported by the National Natural Science Foundation of China (41406137).

1. Zellpräparation <ol><li> Zellgewinnung <ol><li> Übertragen der kryokonservierten menschlichen embryonalen Nieren-293-Zellen (HEK293) aus einem Flüssigstickstofftank zu einem 37 ° C Wasserbad und schütteln kontinuierlich für 1 bis 2 min. </li><li> 10 ml äquilibriertem Wachstumsmedium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), das 10% fötales Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung) zu einer 10-cm Zellkulturschale. fügen Sie vorsichtig die aufgetauten Zellen auf das ins G...

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	<li>Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+and+molecular+sorting.">Endocytosis and molecular sorting.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 575-625 (1996).</li><li>Hausott, B., Klimaschewski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+turnover+and+receptor+trafficking+in+regenerating+axons.">Membrane turnover and receptor trafficking in regenerating axons.</a> Eur J Neuro. 43, 309-317 (2016).</li><li>Kallal, L., Benovic, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+green+fluorescent+proteins+to+study+G-protein-coupled+receptor+localization+and+trafficking.">Using green fluorescent proteins to study G-protein-coupled receptor localization and trafficking.</a> Trends Pharmacol Sci. 21, 175-180 (2000).</li><li>Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+structure+of+the+Aequorea+victoria+green-fluorescent+protein.">Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein.</a> Gene. 111, 229-233 (1992).</li><li>Spector, D. L., Goldman, R. 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A., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+G+protein-coupled+receptor+kinases+and+arrestins+during+receptor+desensitization.">Regulation of G protein-coupled receptor kinases and arrestins during receptor desensitization.</a> Mol Pharmacol. 63, 9-18 (2003).</li><li>Ferguson, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+beta-arrestin+in+mediating+agonist-promoted+G+protein-coupled+receptor+internalization.">Role of beta-arrestin in mediating agonist-promoted G protein-coupled receptor internalization.</a> Science. 271, 363-366 (1996).</li><li>Stojilkovic, S. S., Reinhart, J., Catt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadotropin-releasing+hormone+receptors:+structure+and+signal+transduction+pathways.">Gonadotropin-releasing hormone receptors: structure and signal transduction pathways.</a> Endocr Rev. 15, 462-499 (1994).</li><li>Yan, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Expression+Profile+of+the+Gonadotropin-Releasing+Hormone+Receptor+in+Common+Chinese+Cuttlefish,+Sepiella+japonica.">Identification and Expression Profile of the Gonadotropin-Releasing Hormone Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica.</a> J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. , (2016).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+activation+of+the+G+protein-coupled+receptor+BNGR-A21+by+the+neuropeptide+corazonin+from+the+silkworm,+Bombyx+mori,+dually+couples+to+the+G(q)+and+G(s)+signaling+cascades.">Specific activation of the G protein-coupled receptor BNGR-A21 by the neuropeptide corazonin from the silkworm, Bombyx mori, dually couples to the G(q) and G(s) signaling cascades.</a> J Biol Chem. 288, 11662-11675 (2013).</li><li>Lu, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning,+Characterization,+and+Expression+Profile+of+Estrogen+Receptor+in+Common+Chinese+Cuttlefish,+Sepiella+japonica.">Cloning, Characterization, and Expression Profile of Estrogen Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica.</a> J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 325, 181-193 (2016).</li></ol>

Das Protokoll hier vorgestellten bietet eine effiziente und einfach zu interpretierende Methode, um die subzelluläre Lokalisierung und Internalisierung von exprimierten GPCR-Fusionsprotein in HEK293-Zellen zu erkennen. Die Technik kann leicht für viele verschiedene Gene und Zelltypen angepasst werden, wie für die zelluläre Lokalisation und Internalisierung des Rezeptors corazonin von Bombyx mori in HEK293 und BmN Zellen 16. Die erfolgreiche Anwendung dies...

Zellen Frachthandel Maschinen besitzen extrazelluläre Materialien-wie Liganden, Mikroorganismen, Nährstoffe zu transportieren und Transmembranproteine-in die Zelle für Information, Energie und andere Zwecke 1, 2. Es ist von entscheidender Bedeutung für die zelluläre Homöostase, Gewebefunktion, und die allgemeine Überleben der Zelle. Die zellbasierte Expression von fluoreszierenden Fusionsproteinen ist eine leistungsfähige Methode die Lokalisierung und Internalisierung von Transmembran - Rezeptoren, wie G - Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) zu untersuchen, in Signalweg 3. Die Expression von Fusionsproteinen mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) markiert aus Qualle Aequorea victoria, direkte Fluoreszenznachweistechniken kombiniert werden , hat breite Akzeptanz in Protein-Targeting Research 4, 5, 6 gewonnen. GFP-basierte DETECTIauf den Vorteil der Echtzeit - Abbildung von lebenden Zellen ermöglicht , während Fixations Artefakte vermieden 7. Eine Reihe von vielseitigen Klonierungsvektoren wurde in verschiedenen Zellen 8, 9 , die Expression von Proteinfusionen auf GFP zu erleichtern konstruiert. Der pEGFP-N1-Vektor ist ein weit verbreiteter und kommerzialisierte Plasmidvektor ein verbessertes grün fluoreszierendes Protein (EGFP) kodieren, die für hellere Fluoreszenz und höhere Expression in Säugerzellen von Wildtyp-GFP optimiert wurde. Um das Fluoreszenzsignal von EGFP zu beobachten in Säugerzellen exprimiert, sollte die Fluoreszenzmikroskopie mit einer Anregung bei 488 nm und der Emission bei 507 nm, vorzugsweise mit konfokaler Mikroskopie durchgeführt werden. Überwachung der subzellulären Lokalisation und Ligand-vermittelte Internalisierung der Rezeptoren ist eine übliche Technik , die die Signaltransduktion und Funktion von GPCRs 10 zu untersuchen , </sbis&gt; 11. In den meisten Fällen führt zu Internalisierung Desensibilisierung der GPCRs (die Dämpfung der Reizantwort , trotz der Anwesenheit von Agonisten) 12, 13. Die internalisierten Rezeptoren können in die Lysosomen aufgenommen werden und abgebaut werden, oder sie können wieder an die Zelloberfläche zurückgeführt werden, abhängig von der Art der Rezeptoren und die in den Experimenten verwendeten Zelllinien. Die Gonadotropin-Releasing - Hormon - Rezeptoren (GnRHRs) gehören zu der GPCR - Familie und haben eine typische GPCR - Proteinstruktur, mit einer extrazellulären aminoterminalen, ein intrazelluläres -COOH - Terminal, und sieben Transmembran (TM) -Domäne 14. Die Transfektion des rekombinanten Plasmids Sj GnRHR-EGFP (mit den GnRHR - Genen aus Sepiella japonica) und der konfokalen Mikroskopie Nachweis von EGFP-markierten Sj GnRHR (in HEK293 - Zellen exprimiert) wurden berichtet früsly und GFP - Fluoreszenz wurde 15 als Reporter für Transmembranprotein Lokalisierungs Assays etabliert. Nun wird die Internalisierung von Sj GnRHR, aktiviert durch S. japonica Gonadotropin-Releasing - Hormon (GnRH Sj) wurde in zeit- und dosisabhängigen Art und Weise durch konfokale Mikroskopie demonstriert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="857">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">HEK293 cell line&#160;</td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">DMEM/High glucose</td>
			<td style="width:236px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SH30022.01</td>
			<td>High glucose 4.0 mM L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:236px;">PuFei</td>
			<td style="width:119px;">1101-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:236px;">Genom</td>
			<td style="width:119px;">GNM10010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:236px;">Genom</td>
			<td style="width:119px;">GNM15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">0.25% Trypsin &#38; 0.02% EDTA</td>
			<td style="width:236px;">Genom</td>
			<td style="width:119px;">GNM25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Opti-MEM (1X)</td>
			<td style="width:236px;">GIBCO, by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">31985-062</td>
			<td>reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:300px;">Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td style="width:236px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11668027</td>
			<td>Reagent 1</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:300px;">X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent</td>
			<td style="width:236px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">6366236001</td>
			<td>Reagent 2</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:300px;">DAPI Staining Solution</td>
			<td style="width:236px;">Beyotime</td>
			<td style="width:119px;">C1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">DiI</td>
			<td style="width:236px;">Beyotime</td>
			<td style="width:119px;">C1036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Antifade Mounting Medium</td>
			<td style="width:236px;">Beyotime</td>
			<td style="width:119px;">P0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:300px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:236px;">Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC)</td>
			<td style="width:119px;">80096618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">100 mm cell culture</td>
			<td style="width:236px;">CORNING</td>
			<td style="width:119px;">430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">6-well plate&#160;</td>
			<td style="width:236px;">ExCell Bio</td>
			<td style="width:119px;">CS016-0092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">12-well plate&#160;</td>
			<td style="width:236px;">ExCell Bio</td>
			<td style="width:119px;">CS016-0093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Cover Glass</td>
			<td style="width:236px;">NEST</td>
			<td style="width:119px;">801007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Microscope Slides</td>
			<td style="width:236px;">Citoglas</td>
			<td style="width:119px;">10127105P-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Thermo Scientific Forma CO2 Incubator</td>
			<td style="width:236px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">3111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">TCS SP5II laser scanning confocal microscope</td>
			<td style="width:236px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:119px;">5100001311</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of ligand-activated g protein-coupled receptor internalization by confocal microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.

Figur 1 zeigt ein Beispiel eines konfokalen Mikroskopsystems. Abbildung 2 zeigt die Expression von pEGFP-N1 in HEK293 - Zellen. Das GFP-Signal wurde im Zytoplasma und Zellkern nachgewiesen werden. Abbildung 3 zeigt die subzelluläre Lokalisation von GnRH von S. japonica in HEK293 - Zellen, im Einklang mit unseren bisher veröffentlichten Ergebnissen 15. Das Fusionsprotein mit dem EGFP - Tag am C-Terminus ...

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Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Dieses Protokoll beschreibt Konfokalmikroskopie Nachweis von G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) Internalisierung in Säugerzellen. Es umfasst die Grundzellkultur, Transfektion und Konfokalmikroskopie Verfahren und stellt ein effizientes und leicht interpretierbares Verfahren, die subzelluläre Lokalisierung und Internalisierung von Fusion exprimierten GPCR zu detektieren.

Detektion von Liganden-aktivierte G-Protein gekoppelten Rezeptor-Internalisierung durch konfokale Mikroskopie

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Forschung

Biologie

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

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In vivo Quantifizierung der G Protein-gekoppelten Rezeptor-Wechselwirkungen mit spektral aufgelöste Zwei-Photonen-Mikroskopie

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Imaging G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR)-vermittelten Signaltransduktion, die Steuerung der Chemotaxis Dictyostelium discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

Die Quantifizierung der Wirkung als Agonist am G-Protein-gekoppelte Rezeptoren

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Genetisch kodierte Molecular Probes, um G-Protein-gekoppelte Rezeptoren Studieren

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

Charakterisierung von G-Protein gekoppelten Rezeptoren durch eine Fluoreszenz-basierte Calciummobilisierungsassay

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

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In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

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In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Visualisierung Clathrin-vermittelte Endozytose von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren an Einzelereignis Resolution über TIRF-Mikroskopie

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

Tracking-Drug-induzierte Veränderungen der Post-Rezeptor-Internalisierung Handel durch Colocalizational Analysis

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and ...