Name: optimization and comparative analysis of plant organellar dna enrichment methods suitable for next-generation sequencing
Uploaded: 2017-07-28T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing at JoVE.com

ونود أن نعترف بتمويل من وزارة الزراعة الأمريكية - دائرة البحوث الزراعية ومن المؤسسة الوطنية للعلوم (يوس 1025881 و يوس 1361554). نشكر R. كاسبرز لصيانة الدفيئة ورعاية النبات. كما نشكر جامعة مينيسوتا مركز الجينوميات، حيث تم إجراء التحضيرات مكتبة إلومينا والتسلسل. كما نعرب عن امتناننا للتعليقات التي أبداها محررو المجلة وأربعة مراجعين مجهولين من شأنها تعزيز مخطوطةنا. كما نشكر منظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي على زمالة ل سك لدمج هذه البروتوكولات للمشاريع التعاونية مع الزملاء في اليابان.

1. جيل من المواد النباتية لعزل أورغانيلار واستخراج الحمض النووي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النمو القياسي لشتلات القمح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بذور النبات في الفيرميكوليت في الأواني الصغيرة، مربع مع 4 - 6 بذور لك...

<ol>
	<li>Liberatore, K. L., Dukowic-Schulze, S., Miller, M. E., Chen, C., Kianian, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondria+in+plant+development+and+stress+tolerance.">The role of mitochondria in plant development and stress tolerance.</a> Free Radic Biol Med. 100, 238-256 (2016).</li><li>Samaniego Castruita, J. A., Zepeda Mendoza, M. L., Barnett, R., Wales, N., Gilbert, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odintifier--A+computational+method+for+identifying+insertions+of+organellar+origin+from+modern+and+ancient+high-throughput+sequencing+data+based+on+haplotype+phasing.">Odintifier--A computational method for identifying insertions of organellar origin from modern and ancient high-throughput sequencing data based on haplotype phasing.</a> BMC Bioinformatics. 16 (232), 1-13 (2015).</li><li>Zhang, T., Zhang, X., Hu, S., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+procedure+for+plant+organellar+genome+assembly,+based+on+whole+genome+data+from+the+454+GS+FLX+sequencing+platform.">An efficient procedure for plant organellar genome assembly, based on whole genome data from the 454 GS FLX sequencing platform.</a> Plant Methods. 7 (38), 1-8 (2011).</li><li>Wambugu, P. W., Brozynska, M., Furtado, A., Waters, D. L., Henry, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+of+wild+and+domesticated+rices+(Oryza+AA+genome+species)+based+upon+whole+chloroplast+genome+sequences.">Relationships of wild and domesticated rices (Oryza AA genome species) based upon whole chloroplast genome sequences.</a> Sci Rep. 5 (13957), 1-9 (2015).</li><li>Iorizzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+assembly+of+the+carrot+mitochondrial+genome+using+next+generation+sequencing+of+whole+genomic+DNA+provides+first+evidence+of+DNA+transfer+into+an+angiosperm+plastid+genome.">De novo assembly of the carrot mitochondrial genome using next generation sequencing of whole genomic DNA provides first evidence of DNA transfer into an angiosperm plastid genome.</a> BMC Plant Biol. 12 (61), 1-17 (2012).</li><li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+sequences+of+organelle+genomes+from+the+medicinal+plant+Rhazya+stricta+(Apocynaceae)+and+contrasting+patterns+of+mitochondrial+genome+evolution+across+asterids.">Complete sequences of organelle genomes from the medicinal plant Rhazya stricta (Apocynaceae) and contrasting patterns of mitochondrial genome evolution across asterids.</a> BMC Genomics. 15 (405), 1-18 (2014).</li><li>Skippington, E., Barkman, T. J., Rice, D. W., Palmer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+mitogenome+of+the+parasitic+plant+Viscum+scurruloideum+is+extremely+divergent+and+dynamic+and+has+lost+all+nad+genes.">Miniaturized mitogenome of the parasitic plant Viscum scurruloideum is extremely divergent and dynamic and has lost all nad genes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (27), E3515-E3524 (2015).</li><li>Wicke, S., Schneeweiss, G. M., H&#246;randl, E., Appelhans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+1.">Chapter 1.</a> Next Generation Sequencing in Plant Systematics. , (2015).</li><li>Sloan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+ring+to+rule+them+all?+Genome+sequencing+provides+new+insights+into+the+'master+circle'+model+of+plant+mitochondrial+DNA+structure.">One ring to rule them all? Genome sequencing provides new insights into the 'master circle' model of plant mitochondrial DNA structure.</a> New Phytol. 200 (4), 978-985 (2013).</li><li>Woloszynska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteroplasmy+and+stoichiometric+complexity+of+plant+mitochondrial+genomes--though+this+be+madness,+yet+there's+method+in't.">Heteroplasmy and stoichiometric complexity of plant mitochondrial genomes--though this be madness, yet there's method in't.</a> J Exp Bot. 61 (3), 657-671 (2010).</li><li>Ahmed, Z., Fu, Y. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+with+a+wider+applicability+to+isolate+plant+mitochondria+for+mtDNA+extraction.">An improved method with a wider applicability to isolate plant mitochondria for mtDNA extraction.</a> Plant Methods. 11 (56), 1-11 (2015).</li><li>Ejaz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+small+scale+methods+for+the+rapid+and+efficient+extraction+of+mitochondrial+DNA+from+wheat+crop+suitable+for+down-stream+processes.">Comparison of small scale methods for the rapid and efficient extraction of mitochondrial DNA from wheat crop suitable for down-stream processes.</a> Genet Mol Res. 13 (4), 10320-10331 (2014).</li><li>Eubel, H., Heazlewood, J. L., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+plant+mitochondria+for+proteomic+analysis.">Isolation and subfractionation of plant mitochondria for proteomic analysis.</a> Methods Mol Biol. 355, 49-62 (2007).</li><li>Hao, W., Fan, S., Hua, W., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+extraction+and+assembly+methods+for+simultaneously+obtaining+plastid+and+mitochondrial+genomes.">Effective extraction and assembly methods for simultaneously obtaining plastid and mitochondrial genomes.</a> PLoS One. 9 (9), e108291 (2014).</li><li>Pomeroy, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+respiratory+properties+of+mitochondria+isolated+from+developing+winter+wheat+seedlings.">Studies on the respiratory properties of mitochondria isolated from developing winter wheat seedlings.</a> Plant Physiol. 53 (4), 653-657 (1974).</li><li>Taylor, N. L., Stroher, E., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+organelle+isolation+and+characterization.">Arabidopsis organelle isolation and characterization.</a> Methods Mol Biol. 1062, 551-572 (2014).</li><li>Triboush, S. O., Danilenko, N. G., Davydenko, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+isolation+of+chloroplast+DNA+and+mitochondrial+DNA+from+Sunflower.">A method for isolation of chloroplast DNA and mitochondrial DNA from Sunflower.</a> Plant Mol Biol Rep. 16 (2), 183-189 (1998).</li><li>Pinard, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+whole+genome+amplification-induced+bias+through+high-throughput,+massively+parallel+whole+genome+sequencing.">Assessment of whole genome amplification-induced bias through high-throughput, massively parallel whole genome sequencing.</a> BMC Genomics. 7 (216), 1-21 (2006).</li><li>Lamble, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+workflows+for+high+throughput+library+preparation+using+the+transposome-based+Nextera+system.">Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based Nextera system.</a> BMC Biotechnol. 13 (104), 1-10 (2013).</li><li>Raley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+next-generation+DNA+sequencing+libraries+from+ultra-low+amounts+of+input+DNA:+Application+to+single-molecule,+real-time+(SMRT)+sequencing+on+the+Pacific+Biosciences+RS+II.">Preparation of next-generation DNA sequencing libraries from ultra-low amounts of input DNA: Application to single-molecule, real-time (SMRT) sequencing on the Pacific Biosciences RS II.</a> bioRxiv. , (2014).</li><li>Tsai, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+Complexity+of+Human+Skin+Metagenomes+Using+Single-Molecule+Sequencing.">Resolving the Complexity of Human Skin Metagenomes Using Single-Molecule Sequencing.</a> MBio. 7 (1), e01948 (2016).</li><li>Feehery, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+selectively+enriching+microbial+DNA+from+contaminating+vertebrate+host+DNA.">A method for selectively enriching microbial DNA from contaminating vertebrate host DNA.</a> PLoS One. 8 (10), e76096 (2013).</li><li>Yigit, E., Hernandez, D. I., Trujillo, J. T., Dimalanta, E., Bailey, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+and+metagenome+sequencing:+Using+the+human+methyl-binding+domain+to+partition+genomic+DNA+derived+from+plant+tissues.">Genome and metagenome sequencing: Using the human methyl-binding domain to partition genomic DNA derived from plant tissues.</a> Appl Plant Sci. 2 (11), 1-6 (2014).</li><li>Noyszewski, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+evolution+of+the+mitochondrial+genome+in+an+alloplasmic+line+of+durum+wheat.">Accelerated evolution of the mitochondrial genome in an alloplasmic line of durum wheat.</a> BMC Genomics. 15 (67), 1-16 (2014).</li><li>. QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook Available from: <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/ch/resources/">https://www.qiagen.com/ch/resources/</a> (2016)</li><li>. User developed protocol: Isolation of genomic DNA from plants and filamentous fungi using the QIAGEN Genomic-tip - (EN) Available from: <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/ch/resources/">https://www.qiagen.com/ch/resources/</a> (2001)</li><li>. QIAGEN Genomic DNA Handbook Available from: <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/ch/resources/">https://www.qiagen.com/ch/resources/</a> (2012)</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Ogihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+cereal+mitochondrial+genomes+as+revealed+by+complete+nucleotide+sequencing+of+the+wheat+mitochondrial+genome.">Structural dynamics of cereal mitochondrial genomes as revealed by complete nucleotide sequencing of the wheat mitochondrial genome.</a> Nucleic Acids Res. 33 (19), 6235-6250 (2005).</li><li>Ogihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+features+of+a+wheat+plastome+as+revealed+by+complete+sequencing+of+chloroplast+DNA.">Structural features of a wheat plastome as revealed by complete sequencing of chloroplast DNA.</a> Mol Genet Genomics. 266 (5), 740-746 (2002).</li><li>International Wheat Genome Sequencing Consortium (IWGSC). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromosome-based+draft+sequence+of+the+hexaploid+bread+wheat+(Triticum+aestivum)+genome.">A chromosome-based draft sequence of the hexaploid bread wheat (Triticum aestivum) genome.</a> Science. 345 (6194), (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Bendich, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+do+chloroplasts+and+mitochondria+contain+so+many+copies+of+their+genome?.">Why do chloroplasts and mitochondria contain so many copies of their genome?.</a> Bioessays. 6 (6), 279-282 (1987).</li><li>Kumar, R. A., Oldenburg, D. J., Bendich, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+DNA+damage,+molecular+integrity,+and+copy+number+for+plastid+DNA+and+mitochondrial+DNA+during+maize+development.">Changes in DNA damage, molecular integrity, and copy number for plastid DNA and mitochondrial DNA during maize development.</a> J Exp Bot. 65 (22), 6425-6439 (2014).</li><li>Ma, J., Li, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organellar+genome+copy+number+variation+and+integrity+during+moderate+maturation+of+roots+and+leaves+of+maize+seedlings.">Organellar genome copy number variation and integrity during moderate maturation of roots and leaves of maize seedlings.</a> Curr Genet. 61 (4), 591-600 (2015).</li><li>Lang, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+isolation+of+pure+and+intact+chloroplasts+and+mitochondria+from+moss+as+the+basis+for+sub-cellular+proteomics.">Simultaneous isolation of pure and intact chloroplasts and mitochondria from moss as the basis for sub-cellular proteomics.</a> Plant Cell Rep. 30 (2), 205-215 (2011).</li><li>Tobin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+fractionation+of+plant+tissues.+Isolation+of+chloroplasts+and+mitochondria+from+leaves.">Subcellular fractionation of plant tissues. Isolation of chloroplasts and mitochondria from leaves.</a> Methods Mol Biol. 59, 57-68 (1996).</li></ol>

حتى الآن، تركز معظم الدراسات التسلسل العضوي على أساليب دس التقليدية لإثراء الحمض النووي المحدد. وقد وصفت طرق لعزل العضيات من النباتات المتنوعة، بما في ذلك الطحلب 40 ؛ مونوكوتس مثل القمح 15 والشوفان 11 ؛ و ديكوتس مثل أرابيدوبسيس <sup...

<html> تسلسل الجينوم هو أداة قوية لتشريح الأساس الجيني الكامن وراء الصفات النباتية الهامة. تركز معظم الدراسات التسلسل الجينوم على محتوى الجينوم النووي، حيث أن غالبية الجينات تقع في النواة. ومع ذلك، فإن الجينوم العضوي، بما في ذلك الميتوكوندريا (عبر حقيقيات النوى) والبلاستيدات (في النباتات، والشكل المتخصص، والكلوروبلاست، ويعمل في عملية التمثيل الضوئي) يسهم معلومات وراثية هامة ضرورية لتنمية الكائنات الحية، والاستجابة للضغط، واللياقة البدنية العامة 1 . وعادة ما يتم تضمين جينومات أورغانيلار في الاستخراج الكلي للحمض النووي المقصود لتسلسل الجينوم النووي، على الرغم من أن أساليب للحد من عدد العضيات قبل استخراج الحمض النووي تستخدم أيضا 2 . وقد استخدمت العديد من الدراسات نتائج التسلسل من مجموع الاستخراج غنا لتجميع جينوم أورغانيلار 3 ، 4 ، 5 ،كريف &quot;&gt; 6 ، 7. ومع ذلك، عندما يكون الهدف من الدراسة هو التركيز على الجينوم العضلي، وذلك باستخدام مجموع غنا يزيد من تكاليف التسلسل لأن العديد من يقرأ&quot; فقدت &quot;تسلسل الحمض النووي النووي، وخاصة في النباتات ذات الجينوم النووية الكبيرة ، وعلاوة على ذلك، نظرا للازدواجية ونقل تسلسل الكيس العضلي في الجينوم النووي وبين العضيات، وحل موقف رسم الخرائط الصحيح من تسلسل يقرأ إلى الجينوم الصحيح هو بيوانفورماتيكالي تحدي 2 ، 8. تنقية جينوم عضوي من الجينوم النووي هو واحد استراتيجية للحد من هذه المشاكل.ويمكن استخدام مزيد من الاستراتيجيات المعلوماتية الحيوية لفصل يقرأ تلك الخريطة إلى مناطق التماثل بين الميتوكوندريا والكلوروبلاست. في حين أن الجينوم العضوي من العديد من الأنواع النباتية قد تم تسلسلها، لا يعرف إلا القليل عن اتساع تنوع جينوم عضويالمتاحة في مجموعات البرية أو في تربية تربية المزارع. ومن المعروف أيضا جينومات أورغانيلار أن تكون الجزيئات الحيوية التي تخضع لإعادة ترتيب هيكلية كبيرة بسبب إعادة التركيب بين تسلسل تكرار 9 . وعلاوة على ذلك، يتم تضمين نسخ متعددة من الجينوم العضلي داخل كل عضلة، وترد عضيات متعددة داخل كل خلية. ليس كل نسخ هذه الجينوم متطابقة، والتي تعرف باسم هيتيروبلاسمي. على النقيض من الصورة الكنسي &quot;الدوائر الرئيسية&quot;، هناك الآن أدلة متزايدة على صورة أكثر تعقيدا من الهياكل الجينوم العضوي، بما في ذلك الدوائر شبه الجينومية، الكروموسومات الخطية، الخطية كونكاتامرس، والهياكل المتفرعة 10 . وتجدر الإشارة إلى أن تجميع الجينوم العضوي النباتي يزداد تعقيدا بسبب أحجامها الكبيرة نسبيا وتكرارها المقلوب والمباشر الكبير. البروتوكولات التقليدية لعزل العضل، وتنقية الحمض النووي، والجنوم اللاحقة<html> e التسلسل غالبا ما تكون مرهقة وتتطلب كميات كبيرة من إدخال الأنسجة، مع عدة غرامات إلى ما يزيد عن مئات غرام من الأنسجة ورقة الشباب اللازمة كنقطة انطلاق 11 ، 12 ، 13 ، 14 ، 15 ، 16 ، 17 . وهذا يجعل التسلسل الجينوم العضوي لا يمكن الوصول إليها عندما الأنسجة محدودة. في بعض الحالات، تكون كميات البذور محدودة، مثل عندما يكون ذلك ضروريا للتسلسل على أساس الأجيال أو في الخطوط العقيمة الذكرية التي يجب الحفاظ عليها عبر المعبر. في هذه الحالات، يمكن تنقيته الحمض النووي العضلي ثم تعرض لتضخيم الجينوم كله. ومع ذلك، يمكن أن تضخيم الجينوم كله إدخال التحيز تسلسل كبير، وهو مشكلة خاصة عند تقييم التباين الهيكلي، والهياكل شبه الجينومية، ومستويات هيتيروبلاسمي&gt; 18. وقد ساهمت التطورات الحديثة في إعداد المكتبة للتكنولوجيات التسلسلية القصيرة القراءة في التغلب على الحواجز ذات المدخلات المنخفضة لتجنب تضخيم الجينوم بأكمله. على سبيل المثال، مجموعة إعداد مكتبة إلومينا نكستيرا شت تسمح بأقل من 1 نانوغرام من الحمض النووي لاستخدامها كمدخل 19 . ومع ذلك، فإن الاستعدادات القياسية للمكتبات لتطبيقات تسلسل قراءة طويلة، مثل تقنيات تسلسل باكبيو أو أكسفورد نانوبور، لا تزال تتطلب كمية عالية نسبيا من الحمض النووي المدخلات، والتي يمكن أن تشكل تحديا لتسلسل الجينوم العضوي. في الآونة الأخيرة، تم تطوير بروتوكولات تسلسل جديدة طويلة الصنع الصنع وقراءة طويلة للحد من كميات المدخلات والمساعدة في تسهيل تسلسل الجينوم في العينات حيث الحصول على كميات ميكروغرام من الحمض النووي صعب 20 ، 21 . ومع ذلك، لا يزال الحصول على الوزن الجزيئي عالية، الكسور العضوي النقي لتغذية هذه الاستعدادات مكتبة تحديا. سعينا رo مقارنة وتحسين التخصيب الحمض النووي العضلي وطرق العزل مناسبة ل نغس دون الحاجة إلى تضخيم الجينوم كله. على وجه التحديد، كان هدفنا هو تحديد أفضل الممارسات لإثراء الحمض النووي العضلي عالي الوزن الجزيئي من مواد البدء المحدودة، مثل عينة فرعية من ورقة. يقدم هذا العمل تحليلا مقارنا لأساليب إثراء الحمض النووي العضوي: (1) تعديل، بروتوكول الطرد المركزي التفاضلي المعدل مقابل (2) بروتوكول تجزئة الحمض النووي على أساس استخدام دنا المتاحة تجاريا كبغ الميثيل ملزم نهج سحب البروتين المجال 22 تطبق على الأنسجة النباتية 23 . نوصي أفضل الممارسات لعزل الحمض النووي العضوي من الأنسجة ورقة القمح، والتي يمكن أن تمتد بسهولة إلى النباتات وأنواع الأنسجة الأخرى.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="685">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2-mercaptoethanol (beta-mercaptoethanol; BME)</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M3148-100ml</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2-propanol (Isopropyl alcohol/isopropanol), bioreagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">agarose, Bio-Rad Cetified Megabase agarose</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1613108</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">analytical balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>AB54-S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>PB1502-S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B4287-25G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ceramic grinding cylinders, 3/8in x 7/8in</td>
			<td>SPEX SamplePrep</td>
			<td>2183</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Cryogenic Blocks compatible with tissue homogenizer for holding 50 ml tubes</td>
			<td>SPEX SamplePrep</td>
			<td>2664</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNaseI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ethanol, absolute</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2716</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), 0.5M Solution, pH8.0</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2482-500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">gel imaging system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">gel stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">Such as GelRed or Ethidium Bromide</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">grinding pestle, wide tip for 2 ml conical tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Guanidine-HCl, 8M solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>24115</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LightCycler 480 SYBR Green I Master</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4707516001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lysing enzymes from Trichoderma harzianum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1412</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnesium Chloride</td>
			<td>G Bioscience</td>
			<td>24115</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">magnetic rack</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A13346</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">microcentrifuge tubes, LoBind 1.5 ml&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">microcentrifuge tubes, standard nuclease-free 1.5 ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:216px;">microcentrifuge, refrigerated</td>
			<td>Sorvall&#160;</td>
			<td>Legend X1R</td>
			<td style="width:167px;">Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotors for 50 ml tubes, Oak Ridge tubes, and 1.5 ml tubes</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:216px;">microcentrifuge, room temperature</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td style="width:167px;">Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotor for 1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microcon DNA Fast Flow Centrifugal Filter Units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>MRCFOR100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Miracloth, 1 square per sample cut to fit funnel</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>475855</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2612L</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">parafilm</td>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>PM992</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">plastic pots and trays</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">polyvinylpyrrolidone (PVP)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP431-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Proteinase K</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19131</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pulsed-Field Gel Electrophoresis rig (e.g. CHEF DR III)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703697</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">purification beads, Agencourt AMpureXP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QIAamp DNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51304</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qiagen 20/g Genomic Tip DNA Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>10223</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Qiagen Buffer EB (elution buffer)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qiagen DNA Extraction Buffer Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19060</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QiaRack</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19015</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">qPCR machine (e.g. Roche Light Cycler 480)</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">qPCR plate sealing film</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729757001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">qPCR plate, 96 well plate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Qubit&#160;assay tubes</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32856</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Qubit Broad Spectrum assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32850</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Qubit High Sensitivity assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32851</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RNaseA</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Serological pipettes (20 ml) and pipet-aid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-11</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Small funnels, 1 per sample</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9759</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Soft paintbrush, 2 per sample</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="260">
			<td height="260" style="height:260px;width:216px;">SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder or another type of tissue homogenizer</td>
			<td>SPEX SamplePrep</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">Or another comparable tissue homogenizer. If you do not have access to a tissue homogenizer, then grinding in a pre-chilled mortar and pestle will suffice (see protocol for details). However, a homogenizer will give more consistent results and total homogenization time is reduced.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td>Omnipure</td>
			<td>8550</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TBE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">thermomixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2819-100ml</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5142</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">tube rotater</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">tubes, 50 mL conical polypropylene</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">tubes, 50 ml high-speed polypropylene&#160;</td>
			<td>ThermoScientific/Nalgene</td>
			<td>3119-0050</td>
			<td style="width:167px;">e.g. Nalgene Oakridge tubes or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">vermiculite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">water, sterile and certified Nuclease-free&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1481</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">water, sterile milliQ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization and comparative analysis of plant organellar dna enrichment methods suitable for next-generation sequencing

يحتوي الجينوم العضوي النباتي على عناصر كبيرة ومتكررة قد تخضع لعملية الاقتران أو إعادة التركيب لتشكيل هياكل معقدة و / أو شظايا دون الجينومية. توجد جينومات أورغانيلار أيضا في خلطات داخل خلية أو نوع معين من الأنسجة (هيتيروبلاسمي)، وقد تتغير وفرة الأنواع الفرعية في جميع مراحل التنمية أو عندما تكون تحت الضغط (التحول شبه المتكافئ). مطلوب الجيل التالي من تقنيات التسلسل (نغس) للحصول على فهم أعمق لهيكل الجينوم العضوي وظيفة. تستخدم دراسات التسلسل التقليدية عدة طرق للحصول على الحمض النووي العضوي: (1) إذا تم استخدام كمية كبيرة من الأنسجة بدءا، فمن المتجانسة وتعرض الطرد المركزي التفاضلي و / أو تنقية التدرج. (2) إذا تم استخدام كمية أقل من الأنسجة ( أي إذا كانت البذور أو المواد أو الفضاء محدودة)، يتم تنفيذ نفس العملية كما هو الحال في (1)، تليها تضخيم الجينوم كله للحصول على الحمض النووي كافية. (3) التحليل المعلوماتية الحيوية يمكن استخدامها ليقوموبالتالي الحمض النووي الجيني الكلي وتحليل قراءات أورغانيلار. كل هذه الأساليب لها تحديات ومواقف متأصلة. في (1)، قد يكون من الصعب الحصول على كمية كبيرة من الأنسجة بدءا. في (2)، يمكن أن تضخيم الجينوم كله إدخال التحيز التسلسل. وفي (3)، يمكن التماثل بين الجينوم النووية والعضلية التداخل مع التجمع والتحليل. في النباتات ذات الجينومات النووية الكبيرة، من المفيد إثراء الحمض النووي للعضلات للحد من تكاليف التسلسل وتعقيد تسلسل لتحليلات المعلوماتية الحيوية. هنا، قارنا طريقة الطرد المركزي التفاضلية التقليدية مع الطريقة الرابعة، نهج كبغ الميثيل المنسدلة تكييفها، لفصل الحمض النووي الجيني الكلي إلى الكسور النووية والعضلات. كلا الطرازين تعطي الحمض النووي كافية ل نغس، الحمض النووي التي هي المخصب للغاية لتسلسل أورغانيلار، وإن كان بنسب مختلفة في الميتوكوندريا والبلاستيك الكلور. نقدم الأمثل لهذه الأساليب لنسيج أوراق القمح ومناقشة المزايا الرئيسية و دوعيوب كل نهج في سياق مدخلات العينة، وسهولة البروتوكول، وتطبيق المصب.

البروتوكولات الواردة في هذه المخطوطة تصف طريقتين متميزتين لإثراء الحمض النووي العضوي من الأنسجة النباتية. وتعكس الشروط المعروضة هنا التحسين لأنسجة القمح. يتم وصف مقارنة بين الخطوات الرئيسية في البروتوكولات، والمدخلات الأنسجة المطلوبة، وإخراج ال...

Watch this Scientific Journal Video about Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing at JoVE.com

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

يتم عرض المقارنة والاستفادة المثلى من اثنين من أساليب التخصيب دنا النبات العضوي: الطرد المركزي التفاضلي التقليدي وتجزئة من غنا الكلي على أساس حالة مثيلة. نقوم بتقييم كمية الحمض النووي الناتجة والجودة، وإظهار الأداء في قراءة قصيرة الجيل القادم التسلسل، ومناقشة إمكانات للاستخدام في قراءة طويلة تسلسل جزيء واحد.

الأمثل والتحليل المقارن لطرق التخصيب الحمض النووي النباتي أورغانيلار مناسبة للجيل القادم التسلسل

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

The overall goal of this experiment is to compare two methods used to isolate high quality organellar DNA, both plastid and mitochondria DNA from plant leaf tissue that is suitable for next-generation sequencing. These methods can help answer key questions in plant biology such as the extent of organellar diversity across taxa and how changes in organellar genome sequence or structure affect development and stress response. We will compare two techniques, the differential centrifugation method that enriches for one specific organellar type and the meta fractionation technique that recovers total organellar DNA from smaller frozen tissue samples.The standard procedure for growing wheat seedlings, is to plant seeds in vermiculite, in square pots with four to six seeds per corner. Transfer the pots to a greenhouse with a 16 hour light cycle. Water the plants each day.Fertilize the plants with one quarter teaspoon of granular 20-20-20 MPK fertilizer upon germination, and again at seven days post germination. For adulation of wheat seedlings, plant seeds and care for plants as in the standard procedure. But place the pots in a dark growth chamber.An alternative to growing these seedlings at a dark growth chamber is to cover the plants in the greenhouse but with proper ventilation. The first step in this procedure is to isolate the organelles. Harvest five grams of fresh tissue and rinse it in cold, sterile water in a chilled beaker on ice.Using scissors, cut the leaf tissue into approximately one centimeter pieces directly into a pre-chilled 50 millimeter tube containing two ceramic grinding cylinders. Keep the samples on ice throughout the procedure. To avoid cross-contamination, it is important to change the scissors between samples.Take the samples to the fume hood and add 20 milliliters of STE buffer to each 50 milliliter tube. Place the samples into pre-chilled cryogenic grinding blocks in a tissue grinding apparatus and grind the samples for 30 seconds at 1, 750 rotations per minute. Place the samples on ice for about one minute.Rotate the sample positions and grind for another 30 seconds at 1, 750 rotations per minute. Return the samples to the ice bucket. For each sample, insert a funnel into a clean 50 milliliter tube placed in ice and place one layer of filtration cloth into the funnel.Pre-wet the filtration cloth with five milliliters of STE buffer and save the flow through. Pour the homogenized tissue into the funnel. Rinse the grinding tube with 15 milliliters of STE buffer, recap and invert the tube to rinse walls and lid and pour its contents into the funnel.Carefully remove the ceramic stones and then squeeze and wring out the filtration cloth into the funnel. To avoid cross-contamination, change gloves between samples. Wrap the tube caps with paraffin film to avoid spillage.Centrifuge at 2, 000 x G, at four degree celsius for 10 minutes. Next, use a serological pipette to carefully aspirate the supernatant without disturbing the pellet and place it in a 50 milliliter high speed centrifuge tube with a tight sealing gasket. Place a small beaker of ice on a scale, tear the scale and weigh each supernatant.Use STE buffer to balance the tubes to within 0.1 grams and then centrifuge at 18, 000 x G in four degree celsius for 20 minutes. When the centrifugation is complete, return samples to the fume hood and discard the supernatant. Add one milliliter of ST buffer to the pellet and resuspend gently using a soft paintbrush.Add 24 milliliters of ST buffer to get a final volume of 25 milliliters. Gently swirl the paintbrush around in a suspension to mix, and then press the paintbrush on the side of a tube to remove all liquid before removing the paintbrush. After balancing the tubes, centrifuge at 18, 000 x G in four degree celsius for 20 minutes.During this centrifugation, prepare DNA's 1 solution as described in the text protocol and aliquot 200 microliters to a 1.5 milliliter tube per sample. When the centrifugation is complete, discard the supernatant and blot the tube. To each high speed centrifuge tube, add 300 microliters of STE buffer and resuspend the pellet using a soft paint brush.Place the paint brush in the previously prepared 1.5 milliliter tube containing 200 microliters of DNA's 1 solution and swirl the paint brush to remove any residual pellet stuck in the brush. Pipette the DNA's 1 solution into the high speed centrifuge tube and gently swirl to mix. Wrap paraffin film around the top of each tube and incubate at 37 degrees celsius in a water bath for 30 minutes.During the incubation, gently mix by swirling. Using a pipette tip with a wide orifice, gently pipette the pellet mixture out of the tube and place it in a 1.5 milliliter low binding tube. Add 500 microliters of 400 millimolar EDTA, pH 8.0 to the high speed centrifuge tube.Gently pipette to completely remove the residual pellet and transfer the EDTA to the low binding tube containing the pellet mixture. Gently mix by inversion. Centrifuge at 18, 000 x G, at four degree celsius for 20 minutes.Subsequently, discard the supernatant, blot each tube and use the pellet immediately for DNA isolation. In this method, organellar DNA is enriched from total genomic DNA that was extracted using commercial DNA extraction columns. Prepare the required amount of MBD2 FC protein bound magnetic beads, per the manufacturer's instructions and scale the reactions to use between one and two micrograms of total input DNA.In this demonstration, 160 microliters of beads is required for one microgram of total input DNA. To capture methylated nuclear DNA, add one microgram of input DNA to a tube containing 160 microliters of MBD2 bound magnetic beads for each individual sample and gently pipette up and down with a wide bore tip. Add the appropriate volume of 5x bind wash buffer for a final concentration of 1x and pipette the sample up and down with a wide bore tip, a few times to mix.Rotate the tubes at room temperature for 15 minutes. For the success of the pull down, it is critical to thoroughly mix the beads during the incubation, particularly, if there is significant bead clumping. To prevent bead clumping and to ensure pull down of the methylated DNA, gently pipette the samples with a wide bore pipette tip and flick the samples two to three times throughout the incubation.Briefly spin the tubes containing the DNA and magnetic bead mixture. Place the tubes on a magnetic rack for at least five minutes to collect the beads to the side of the tubes. The solution should appear clear, it contains un-methylated organellar enriched DNA.Using wide bore tips, carefully remove the cleared supernatant without disturbing the beads and transfer the supernatant to a clean, low binding two milliliter microcentrifuge tube. Store the samples at 20 or 80 degrees celsius. Acute PCR assay was employed to assess the relative abundances of three organelle specific implicons in total genomic DNA and the organellar DNA fraction obtained from both methods.Overall, the data indicate that the differential centrifugation method, preferentially enriches for mitochondria. The unmethylated fraction of the methylfractionated total genomic DNA, shows substantial enrichment of both organellar implicons. Percentages of reads mapped to the mitochondria or chloroplast chinese spring and chris cultivated wheat reference genomes are consistent with the QPCR results.Differential centrifugation yield DNA that is more enriched in mitochondria DNA and methylfractionation yields DNA that likely reflects the native abundance of the two organellar genomes. Sample labels including E, designate idyllated samples and NE designate non-idyllated samples. Interestingly, idyllation did not change organellar abundances.In both methods, the theoretical coverage of the mitochondria or chloroplast referenced genomes, exceeds 100x coverage, even when 12 libraries atremultiplexed. The total genomic DNA migrates as a diffused smear in post field gel electrophoresis and exceeds 50 kilobases. The nuclear fraction after methylfractionation decreases in size, but remains centered around 50 kilobases, suggesting that methylfractioanted DNA is most suitable for long read sequencing.Once mastered, both organellar DNA extraction techniques can be done in one to two days, from sample collection to assessment of final product, if performed properly. The methylfractionation technique has the potential to greatly expand the range of organellar DNA studies to rare and difficult samples, since tissue inputs are extremely low. However, differential centrifugation may still be preferable when solely mitochondria DNA is required for downstream studies.Likewise, centrifugation steps maybe adjusted to preferentially extract plastid DNA if desired. Both organellar DNA extraction methods yield DNA that is suitable for next generation sequencing but methylfractionation yields high molecular rate DNA that is ideal for long read sequencing.

Research

JoVE Journal

Genetics

Leveraging CyVerse Resources for De Novo Comparative Transcriptomics of Underserved (Non-model) Organisms

Leveraging CyVerse Resources for De Novo Comparative Transcriptomics of Underserved Non-model Organisms

الاستفادة من سيفيرز الموارد ل<em&gt; دي نوفو</em&gt; ترانسكريبتوميكس المقارنة من الكائنات المحرومة (غير نموذجية)

This workflow allows novice researchers to leverage advanced computational resources such as cloud computing to carry out pairwise comparative ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

تقييم التلوث الحمض النووي في عينات الحمض النووي الريبي استناداً إلى ريبوسومال الحمض النووي

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

تنقية عالية الوزن الجزيئي الحمض النووي الجينوم من البياض الدقيقي لونغ-مقروءة التسلسل

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

عزل الحمض النووي قوية وبناء مكتبة التسلسل الفائق للعينات دار النباتات

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

استهدفت تسلسل الجيل القادم وأنابيب المعلوماتية الحيوية لتقييم المحددات الوراثية للمرض الدستورية

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

الكشف عن حالة نادرة باستخدام الحمض النووي لتصحيح الخطأ وتسلسل الحمض النووي الريبي

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

التضخيم من القرب من كامل طول فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس للجيل التالي التسلسل

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

تحديد تسلسل الجينات التنظيمية استخدام تسلسل الجيل المقبل من تكيف كروموسوم دائرية الفائق التقاط (ج 4-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level

الجيش النيبالي الجديد الجيل التالي التسلسل وخط أنابيب المعلوماتية الحيوية لتحديد خط التعبير-1s في مستوي محدد الموضع

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and ...