Name: structure-function studies in mouse embryonic stem cells using recombinase-mediated cassette exchange
Uploaded: 2017-04-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange at JoVE.com

نشكر Jinke وD&#39;هونت، فريدريك فان Rockeghem، ناتالي Farla، كيلي ليمير، وRIET دي Rycke حصول على الدعم الفني الممتاز. كما نشكر EEF Parthoens، Evelien فان HAMME، وأماندا جونكالفيس من مرفق Bioimaging الأساسية لمركز أبحاث التهاب للحصول على مساعدة الخبراء التابعة لها. ونحن نعترف أعضاء مجموعتنا البحثية لإجراء مناقشات قيمة. وأيد هذا العمل من قبل سياسة البلجيكي العلوم (Belspo بين الجامعات الجذب البولنديين - جائزة IAP VII-07 DevRepair، https://devrepair.be)، من قبل مؤسسة الملكة إليزابيث الطبي، بلجيكا (GSKE 2008-2010، HTTP: // شبكة الاتصالات العالمية .fmre-gske.be)، ومن قبل تطبيقات البحوث المنسقة (GOA 01G01908) من جامعة غنت، بلجيكا (http://www.ugent.be/en/ghentuniv). SG هو زميل ما بعد الدكتوراه من صناديق البحوث فلاندرز (FWO-V).

أجريت جميع التجارب على الفئران وفقا للوائح الحيوان المؤسسية والوطنية والأوروبية. 1. عزل mESCs KO RMCE متوافق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتكاثر الفئران KO متخالف مع الفئران RMCE متوافق، مثل الفئران ROSALUC 10 أو ROSA26-IPSC ?...

<ol>
	<li>Gul, I. S., Hulpiau, P., Saeys, Y., van Roy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metazoan+evolution+of+the+armadillo+repeat+superfamily.">Metazoan evolution of the armadillo repeat superfamily.</a> Cell Mol Life Sci. , (2016).</li><li>Valenta, T., Hausmann, G., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+and+functions+of+beta-catenin.">The many faces and functions of beta-catenin.</a> EMBO J. 31, 2714-2736 (2012).</li><li>Pieters, T., van Hengel, J., van Roy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+p120ctn+in+development+and+disease.">Functions of p120ctn in development and disease.</a> Front Biosci. 17, 760-783 (2012).</li><li>Keirsebilck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+the+human+p120ctn+catenin+gene+(CTNND1):+Expression+of+multiple+alternatively+spliced+isoforms.">Molecular cloning of the human p120ctn catenin gene (CTNND1): Expression of multiple alternatively spliced isoforms.</a> Genomics. 50, 129-146 (1998).</li><li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+in+mice:+functional+analysis+of+the+mammalian+genome+for+the+twenty-first+century.">Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century.</a> Nat Rev Genet. 6, 507-512 (2005).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153, 910-918 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154, 1370-1379 (2013).</li><li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+off-target+mutagenesis+induced+by+CRISPR-Cas+nucleases+in+human+cells.">High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.</a> Nat Biotechnol. 31, 822-826 (2013).</li><li>Branda, C. S., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Talking+about+a+revolution:+The+impact+of+site-specific+recombinases+on+genetic+analyses+in+mice.">Talking about a revolution: The impact of site-specific recombinases on genetic analyses in mice.</a> Dev Cell. 6, 7-28 (2004).</li><li>Sandhu, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strict+control+of+transgene+expression+in+a+mouse+model+for+sensitive+biological+applications+based+on+RMCE+compatible+ES+cells.">Strict control of transgene expression in a mouse model for sensitive biological applications based on RMCE compatible ES cells.</a> Nucleic Acids Res. 39, 1 (2010).</li><li>Haenebalcke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+ROSA26-based+conditional+and/or+inducible+transgenesis+using+RMCE-compatible+F1+hybrid+mouse+embryonic+stem+cells.">Efficient ROSA26-based conditional and/or inducible transgenesis using RMCE-compatible F1 hybrid mouse embryonic stem cells.</a> Stem Cell Rev. 9, 774-785 (2013).</li><li>Pieters, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p120+Catenin-Mediated+Stabilization+of+E-Cadherin+Is+Essential+for+Primitive+Endoderm+Specification.">p120 Catenin-Mediated Stabilization of E-Cadherin Is Essential for Primitive Endoderm Specification.</a> PLoS Genet. 12, e1006243 (2016).</li><li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos.">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154-156 (1981).</li><li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells.">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 7634-7638 (1981).</li><li>Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+generation+of+C57BL/6J+mouse+embryonic+stem+cells+in+a+defined+serum-free+media.">Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media.</a> Genesis. 39, 100-104 (2004).</li><li>Bryja, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+the+derivation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">An efficient method for the derivation of mouse embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 24, 844-849 (2006).</li><li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal.">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453, 519-523 (2008).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+embryonic+stem+cells+by+a+small+molecule.">Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17266-17271 (2006).</li><li>Pieters, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+User-Friendly+Pluripotin-based+Derivation+of+Mouse+Embryonic+Stem+Cells.">Efficient and User-Friendly Pluripotin-based Derivation of Mouse Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cell Rev. 8, (2012).</li><li>Yang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotin+combined+with+leukemia+inhibitory+factor+greatly+promotes+the+derivation+of+embryonic+stem+cell+lines+from+refractory+strains.">Pluripotin combined with leukemia inhibitory factor greatly promotes the derivation of embryonic stem cell lines from refractory strains.</a> Stem Cells. 27, 383-389 (2009).</li><li>Haenebalcke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ROSA26-iPSC+Mouse:+A+Conditional,+Inducible,+and+Exchangeable+Resource+for+Studying+Cellular+(De)Differentiation.">The ROSA26-iPSC Mouse: A Conditional, Inducible, and Exchangeable Resource for Studying Cellular (De)Differentiation.</a> Cell Rep. 3, (2013).</li><li>Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+mouse+strain+expressing+four+drug-selectable+marker+genes.">A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes.</a> Nucleic Acids Res. 25, 3745-3746 (1997).</li><li>Nyabi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+mouse+transgenesis+using+Gateway-compatible+ROSA26+locus+targeting+vectors+and+F1+hybrid+ES+cells.">Efficient mouse transgenesis using Gateway-compatible ROSA26 locus targeting vectors and F1 hybrid ES cells.</a> Nucleic Acids Res. 37, 55 (2009).</li><li>Katzen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gateway((R))+recombinational+cloning:+a+biological+operating+system.">Gateway((R)) recombinational cloning: a biological operating system.</a> Expert Opin Drug Discov. 2, 571-589 (2007).</li><li>Schaft, J., Ashery-Padan, R., vander Hoeven, F., Gruss, P., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+FLP+recombination+in+mouse+ES+cells+and+oocytes.">Efficient FLP recombination in mouse ES cells and oocytes.</a> Genesis. 31, 6-10 (2001).</li><li>Spencer, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+inhibits+cell+surface+localization+of+the+pro-migratory+5T4+oncofetal+antigen+in+mouse+embryonic+stem+cells.">E-cadherin inhibits cell surface localization of the pro-migratory 5T4 oncofetal antigen in mouse embryonic stem cells.</a> Mol Biol Cell. 18, 2838-2851 (2007).</li><li>Stryjewska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zeb2+Regulates+Cell+Fate+at+the+Exit+from+Epiblast+State+in+Mouse+Embryonic+Stem+Cells.">Zeb2 Regulates Cell Fate at the Exit from Epiblast State in Mouse Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. , (2016).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , (2003).</li><li>van den Berghe, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+migration+of+cortical+interneurons+depends+on+the+cell-autonomous+action+of+Sip1.">Directed migration of cortical interneurons depends on the cell-autonomous action of Sip1.</a> Neuron. 77, 70-82 (2013).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EMT+transcription+factor+Zeb2+controls+adult+murine+hematopoietic+differentiation+by+regulating+cytokine+signaling.">The EMT transcription factor Zeb2 controls adult murine hematopoietic differentiation by regulating cytokine signaling.</a> Blood. , (2016).</li></ol>

لدينا طريقة مسك العزلة هو سهل الاستعمال ولا يتطلب مهارات متقدمة أو المعدات، مثل المجهرية من الكيسات الأريمية. وهكذا، وهذه التكنولوجيا يمكن الوصول إلى نسبة كبيرة من المجتمع العلمي. يمكن لأي شخص من ذوي الخبرة الأساسية ثقافة الخلية نشر الامتداد ICM وإنشاء خطوط mESCs. ومع ذ?...

ويقدر أن جينومات الثدييات تحتوي على حوالي 20000 جينات تشفير البروتين. الربط البديل والتعديلات posttranslational يزيد من ذخيرة البروتين. البروتينات لديها بنية وحدات (1) وغالبا ما تحتوي على مجالات التفاعل متعددة، والتي تسمح تجنيدهم في المجمعات بروتين مختلفة، ومشاركتهم في العمليات الخلوية متعددة 2. ومن الأمثلة على ذلك البروتين متعدد الوظائف وتسمى p120ctn. يتم ترميز p120ctn بواسطة الجينات Ctnnd1 ويتكون من مجال أرماديلو تكرار مركزي كبير محاط من قبل N-المحطة ومنطقة C-المحطة. المجال أرماديلو من p120ctn بربط مجال juxtamembrane الحفظ جدا من cadherins الكلاسيكية، التي تشارك في التصاق خلية خلية، ولكنه يربط أيضا إلى قامع النسخي كايسو. المجال-N من محطة p120ctn يتفاعل مع تحركات مختلفة، فوسفاتاز، RhoGTPases صغيرة، والمرتبطة أنيبيب صroteins 3. ومن المثير للاهتمام، نتيجة الربط البديلة، الإسوية p120ctn يمكن أن تتولد من أربعة الكودونات بداية بديلة 4. p120ctn شكل الإسوي 1A هو أطول، كما ترجم من أكثر 5 &quot;تبدأ كودون ويحتوي على شريحة-N محطة بالطول. في p120ctn الإسوية 3 و 4، يتم حذف هذه الشريحة N-المحطة جزئيا وكليا، على التوالي. فهم الدور الدقيق من البروتينات (أو الأشكال الإسوية البروتين)، والمجالات الخاصة بهم في الوظائف الخلوية المختلفة لا يزال يشكل تحديا. الجينات التي تستهدف في mESCs يمكن دراسة وظيفة البروتين من خلال حذف الوراثي للجينات المقابلة وساهم على نطاق واسع لتحديد الجينات والممرات الهامة والأمراض ذات الصلة تنمويا. كان هذا الاختراق في علم الوراثة العكسية نتيجة التقدم في مجالات العزلة مسك والجينات التي تستهدف بسبب إعادة التركيب مثلي 5 </sتصل&gt;. إعادة التركيب مثلي هو العملية التي يتم تبادلها شظايا الحمض النووي بين اثنين من الأنصاف النووية متشابهة أو متطابقة بعد المزدوج تقطعت بهم السبل (س) فواصل DNA. عادة، HR غير فعالة بسبب فواصل dsDNA نادرة. في الآونة الأخيرة، وكفاءة الجينات الموجهة تناظر تستهدف يمكن زيادة استخدام nucleases الخاصة بالموقع 6، 7، ولكن للأسف، هذه هي عرضة لتأثيرات بعيدا عن الهدف 8. وهناك تقنية أكثر موثوقية لتمكين الجينات الاستهداف RMCE، والتي تقوم على أنظمة إعادة التركيب في مواقع محددة مثل لجنة المساواة العرقية / loxP أو FLPe / FRT. تم العثور على LoxP وتسلسل FRT في P1 عاثية وخميرة الخباز، على التوالي، وتتكون من 34 شركة بريتيش بتروليوم، بما في ذلك شركة بريتيش بتروليوم تسلسل غير المتماثلة 8 التي تحدد التوجه للموقع. من ناحية أخرى، توجه، على سبيل المثال، موقعين loxP ضمن تمتد DNA ستحدد ما إذا كان DNA floxed يصبح رفعه أو طnversed على إعادة التركيب بوساطة لجنة المساواة العرقية-9. وعلاوة على ذلك، يمكن للجنة المساواة العرقية أيضا لحث على النبات إذا كانت موجودة موقعين على الكروموسومات المختلفة. RMCE يستفيد من مواقع إعادة التركيب مغاير نوعي التي لا عبر التفاعل والمضمنة في موضع الجيني. في ظل وجود البلازميد المانحة التي تحتوي على جزء DNA يحيط بها مواقع مغاير نوعي نفسها، فإن recombinase إدراج هذا جزء الحمض النووي في موضع-RMCE متوافق الجيني بسبب النبات المزدوج في وقت واحد (الشكل 1). هنا، يمكن استنساخ فقط بشكل صحيح RMCE المستهدفة تجعل بفضل المقاومة للأدوية إلى المروج على ناقلات الوارد أن يعيد &quot;المحاصرين&quot;، المروج أقل مقاومة نيومايسين الجين (النيو R) موجودة في الجينوم R26 من الخلايا لرسو السفن (الشكل 1) 10، 11. وهذا يؤدي إلى كفاءة استهداف عالية جدا، وغالبا ما يقرب من 100٪ 11 &lt;/ سوب&gt; 12. وفي الختام، واستهداف القائم على RMCE ذو كفاءة عالية ويمكن استخدامها للدراسات وظائف الهيكل. ومع ذلك، فإنه يتطلب موضع الجيني سابقة الهندسة. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/55575/55575fig1.jpg" /> الشكل 1. التمثيل التخطيطي لاستهداف بوساطة RMCE. RMCE يسمح لتبادل شرائح DNA من ناقلات تستهدف الواردة إلى مكان الجيني يعرف إذا كان كل من الميناء موقعين FRT مغاير نوعي (يصور مثلثات بيضاء وحمراء). وبالإضافة إلى ذلك، موضع الجيني المهندسة يحتوي على promoterless والجينات اقتطاع النيوميسين المقاومة (النيو R). من خلال توفير مروج والبدء في كودون في جزء DNA واردة، أحداث إعادة التركيب فقط الصحيحة استعادة المقاومة النيوميسين، مما أدى إلى الكفاءة استهداف عالية. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55575/55575fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من ر</a>شخصية له. هندسة الجينوم في mESCs تسمح للجيل من الفئران RMCE متوافق. وفي عام 1981، نجحت مجموعتين في التقاط الخلايا المحفزة من الكتلة الخلوية الداخلية (ICM) من الكيسات الأريمية والحفاظ عليها في الثقافة 13، 14. mESCs قادرة على تجديد الذات والتمايز إلى جميع أنواع الخلايا الجنينية والكبار، بما في ذلك النسب الجرثومية الخلية. ولذلك، الجينات التي تستهدف في mESCs تمكن الدراسات عكس الوراثية من خلال تطوير الفئران KO التأسيسية أو المشروط (باستخدام نظام / LoxP لجنة المساواة العرقية). ومع ذلك، فإن الطريقة الكلاسيكية لعزل خلايا فأر ES غير فعالة للغاية. وزادت العديد من التحسينات الرئيسية إلى حد كبير نسبة النجاح لاشتقاق خطوط مسك، بما في ذلك استخدام تعريف مصل استبدال (SR) المتوسطة 15، بالتناوب بين مسك المتوسط تحتوي ريال والجنين مصل بقري (FBS) 16، واستخدام الصيدلانيةمركبات منطقية مثل pluripotin أو 2I 17. Pluripotin، وهو جزيء اصطناعي صغير، يسمح لنشر mESCs في حالة غير متمايزة في غياب عامل اللوكيميا المثبطة (LIF) والخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFS) 18. وأخيرا، فقد تبين أن mESCs يمكن عزل بكفاءة عالية جدا (قريبة من 100٪) عندما يتم الجمع بين و/ FBS بروتوكول التناوب المتوسط ريال مع LIF وpluripotin 19 و 20. وتمكن هذه البروتوكولات العزلة كفاءة mESCs KO-RMCE متوافق التي يمكن بعد ذلك أن تستخدم للدراسات هيكل الوظائف. توضح هذه الورقة الطريقة التي تمكن واحد لتحديد المجالات الرئيسية أو المخلفات داخل البروتين المسؤولة عن العمليات الخلوية محددة. تحقيقا لهذه الغاية، وكان خط أنابيب من التقنيات المتطورة التي تمكن كفاءة العزل مسك، وتستهدف الجمعية ناقلات، واستهداف مسك خلقد. على هذا النحو، لوحات كبيرة مع الإسوية البروتين، والمسوخ نطاق والمؤثرات المصب يمكن إدخالها في mESCs KO ويمكن تقييمها لقدرتها على إنقاذ في المختبر KO النمط الظاهري.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="766">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">ROSALUC Mice</td>
			<td style="width:143px;">made in house</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:245px;">frozen sperm available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">R26-iPSC mice</td>
			<td style="width:143px;">made in house</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:245px;">frozen sperm available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Vessel probe</td>
			<td style="width:143px;">Fine Science Tools</td>
			<td>10160-13</td>
			<td style="width:245px;">to check for copulation plugs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">M2 medium</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">M7167</td>
			<td style="width:245px;">make aliquots and store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">Fine forceps (Dumont #5 Standard tip Student forceps)</td>
			<td style="width:143px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:107px;">11251-10</td>
			<td style="width:245px;">spray with 70% EtOH before use (do not autoclave)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">23G needles</td>
			<td style="width:143px;">Fine-ject</td>
			<td style="width:107px;">8697</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">1-ml syringes</td>
			<td style="width:143px;">Soft-ject</td>
			<td style="width:107px;">6680</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">60-mm bacterial grade plates (for flushing)&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Gosselin</td>
			<td style="width:107px;">BB60-01</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Mouth pipette</td>
			<td style="width:143px;">made in house</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:245px;">see discussion</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">Mouse embryonic fibroblasts (MEFs, TgN (DR4)1 Jae strain)</td>
			<td style="width:143px;">ATTC</td>
			<td style="width:107px;">SCRC-1045</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">TgN (DR4)1 Jae mice</td>
			<td style="width:143px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:107px;">3208</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Mitomycin C&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">M0503</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">Phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">14190-094</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:272px;">Tg(DR4)1Jae/J mice</td>
			<td style="width:143px;">JAX</td>
			<td style="width:107px;">3208</td>
			<td style="width:245px;">mice that contain four drug-selectable genes and DR4 MEFS confers resistance to neomycin, puromycin, hygromycin and 6-thioguanine</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">0.1% Gelatin</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">G1393</td>
			<td style="width:245px;">Dissolve 0.5 g in 500 ml distilled water, autoclave and store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Trypsin (0.25%)&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">25200-056</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">2 &#956;M pluripotin</td>
			<td style="width:143px;">Cayman Chemical</td>
			<td style="width:107px;">10009557</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:272px;">pRMCE-DV1</td>
			<td style="width:143px;">BCCM/LMBP collection&#160;</td>
			<td style="width:107px;">LMBP 08870</td>
			<td style="width:245px;">public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:272px;">cre-excised pRMCE-DV1</td>
			<td style="width:143px;">BCCM/LMBP collection&#160;</td>
			<td style="width:107px;">LMBP 08195</td>
			<td style="width:245px;">public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">pCAG-FlpE-IRES-Puro-pA&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Addgene</td>
			<td style="width:107px;">20733</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">heat-shock competent DH5&#945; bacteria&#160;</td>
			<td style="width:143px;">made in house</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">Gateway pDONR221 vector</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:107px;">12536-017</td>
			<td style="width:245px;">contains kanamycin-resistance gene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">BP clonase II mix</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:107px;">11789-020</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">LR clonase II mix</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:107px;">11791-020&#160;</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Luria Broth (LB)&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Ampicillin&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Applied Biosystems 3730XL DNA Analyzer</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:107px;">3730XL</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">G418</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:107px;">11811-023</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">Lipofectamine 2000 transfection reagent</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:107px;">11668027</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Lipofectamine LTX transfection reagent</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:107px;">15338100</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Effectene transfection reagent</td>
			<td style="width:143px;">Qiagen</td>
			<td style="width:107px;">301425</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">GATEWAY pENTR 1A vector</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:107px;">A10462</td>
			<td>recombination-compatible vector</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">mouse monoclonal anti-p120ctn antibody</td>
			<td style="width:143px;">BD Transduction Laboratories</td>
			<td style="width:107px;">610134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">mouse monoclonal anti-Ecadherin antibody</td>
			<td style="width:143px;">BD Transduction Laboratories</td>
			<td style="width:107px;">610181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">General equipment:</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">Sterile dissection tools</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:245px;">fine scissors and forceps for dissecting the uterus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Sterile pipettes: 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">15-ml and 50-ml conical centrifuge tubes</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:272px;">96-well culture plates V-shaped bottom and flat bottom)&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">Culture dishes: 24 wells, 12 wells and 6 wells</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">Multichannel pipettes (to pipette 30, 50, 100 and 200 &#956;l)&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Sterile multichannel reservoirs</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Access to a laminar air flow</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:272px;">Access to an incubator at 37&#176;C with 5% CO2</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Access to an inverted microscope</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Access to a bench-top centrifuge</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">Access to a stereo microscope with transmitted-light&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Culture media:</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">MEF Medium:</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:245px;">stored at 4&#176;C; warm 30 min at 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">&#160;Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">41965-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">10% fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">F-7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">L-glutamine (2 mM)</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">25030-024&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Sodium pyruvate&#160; (0.4 mM)</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">11360-039&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">penicillin (100 U/ml)</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">15140-122&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">streptomycin (100 &#181;g/ml)</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">15140-122&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">SR-based mESC medium:</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:245px;">stored at 4&#176;C; warm 30 min at 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">31330-038</td>
			<td style="width:245px;">mixed in a 1:1 ratio</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">15% knock-out serum replacement (SR )</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">10828&#8211;028</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">L-glutamine (2 mM)</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">25030-024&#160;</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">0.1 mM non-essential amino acids&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">11140-050</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">penicillin (100 U/ml)</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">15140-122&#160;</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">streptomycin (100 &#181;g/ml)</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">15140-122&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">&#946;-mercaptoethanol (0.1 mM)&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">M 3148&#160;</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">2,000 U/ml recombinant mouse LIF&#160;</td>
			<td style="width:143px;">(IRC/VIB Protein Service facility)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">FBS-based mESC medium (similar to SR-based mESC medium):</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:245px;">stored at 4&#176;C; warm 30 min at 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Knockout DMEM</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">10829-018&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">15% FBS</td>
			<td style="width:143px;">Hyclone</td>
			<td style="width:107px;">SH30070.03E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Differention Medium</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:245px;">stored at 4&#176;C; warm 30 min at 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">21980-032&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">15% FBS</td>
			<td style="width:143px;">Hyclone</td>
			<td style="width:107px;">SH30070.03E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">5% CD Hybridoma Medium(1x) liquid&#160;&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">11279-023&#160;</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">&#160;2 mM L-glutamine</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">25030-024&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">0.4 mM 1-thioglycerol</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">M-6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">50 &#956;g/ml ascorbic acid</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">A-4544&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">penicillin (100 U/ml)</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">15140-122&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">streptomycin (100 &#181;g/ml)</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">15140-122&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2i</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">1 &#956;M Erk inhibitor PD0325901&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Axon Medchem</td>
			<td style="width:107px;">Axon 1408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">3 &#956;M Gsk3 inhibitor CHIR99021</td>
			<td style="width:143px;">Axon Medchem</td>
			<td style="width:107px;">Axon 1386</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

structure-function studies in mouse embryonic stem cells using recombinase-mediated cassette exchange

الهندسة الوراثية في الأجنة الماوس أو الخلايا الجذعية الجنينية (mESCs) تسمح لدراسة وظيفة بروتين معين. البروتينات هي حقوله المنتجة من الخلية وتتكون غالبا من المجالات الوظيفية متعددة، والتي يمكن أن تتأثر التعديلات posttranslational. استنزاف البروتين بأكمله في مشروط أو التأسيسي الضربة القاضية من أصل (KO) الفئران لا يأخذ بعين الاعتبار هذا التنوع الوظيفي والتنظيم. وقد ذكرت سابقا خط مسك ونموذج الفأر المشتقة، التي تم إدراج موقع رسو السفن لFLPe الصرف كاسيت بوساطة إعادة التركيب (RMCE) في موضع ROSA26 (R26). هنا، ونحن التقرير على نهج هيكل الوظائف التي تسمح للتشريح الجزيئي للوظائف مختلفة من البروتين متعددة المجالات. وتحقيقا لهذه الغاية، يجب أن عبرت الفئران RMCE متوافق مع الفئران KO، ويجب أن تكون معزولة mESCs KO ثم RMCE متوافق. بعد ذلك، يمكن إدخال لجنة من ثوابت الإنقاذ المفترضة في موضع R26 عبر RMCE targetiنانوغرام. وcDNAs الإنقاذ مرشح يمكن إدراجها بسهولة بين المواقع RMCE للناقلات التي تستهدف باستخدام إعادة التركيب الاستنساخ. بعد ذلك، و transfected mESCs KO مع ناقلات تستهدف في تركيبة مع FLPe التعبير recombinase البلازميد. RMCE إعادة تنشيط الجين النيوميسين-مقاومة المروج أقل في مواقع رسو السفن ROSA26 ويسمح لاختيار الحدث الاستهداف الصحيح. وبهذه الطريقة، يتم الحصول على الكفاءات استهداف عالية قريبة من 100٪، والسماح لإدخال عدة ثوابت الإنقاذ المفترضة بطريقة الإنتاجية شبه عالية. وأخيرا، العديد من بنيات الإنقاذ مدفوعة R26-يمكن اختبار لقدرتها على إنقاذ النمط الظاهري الذي لوحظ في mESCs KO الوالدين. نقدم دراسة بنية وظيفة إثبات صحة المبدأ في كاتينين P120 (p120ctn) mESCs KO باستخدام الأديم الباطن التمايز في الهيئات مضغي (EBS)، وقراءات المظهرية. هذا النهج يمكن تحديد المجالات الهامة، مسارات المصب المفترضة، ونقطة من الأمراض ذات الصلةالطفرات التي تكمن وراء الظواهر KO لبروتين معين.

وصفت الإجراء لعزل خطوط KO مسك-RMCE متوافقة في الشكل 2. مطلوبة اثنين من قطعان متتالية للحصول على الكيسات الأريمية KO-RMCE متوافق. أولا، وعبرت الفئران KO متخالف مع الفئران RMCE متوافق للحصول على-RMCE متوافق، الفئران KO متخالف. ثم يتم استخدام هذه الفئران ل?...

Watch this Scientific Journal Video about Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange at JoVE.com

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

غالبا ما تحتوي على البروتينات المجالات المتعددة التي يمكن أن تمارس الوظائف الخلوية المختلفة. الجينات ضرب الرافضة (KO) لا يعتبرون هذا التنوع الوظيفي. هنا، نحن الإبلاغ عن النهج المستندة إلى هيكل الوظائف بوساطة إعادة التركيب الصرف كاسيت (RMCE) في KO الخلايا الجذعية الجنينية التي تسمح للتشريح الجزيئي للمجالات أو أنواع من البروتين وظيفية مختلفة.

الدراسات هيكل الوظائف في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس عن طريق بوساطة Recombinase-كاسيت تبادل

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

The overall goal of this structure-function method is to dissect at the molecular level the role of different protein domains, or disease-relevance mutations, in naive or differentiated mouse embryonic stem cells. This method can help to reveal how different residues or domains of a protein can contribute to its function in a given cellular context. The main advantage of this technique is that it allows very efficient targeting of rescue constructs to the genome of knock out embryonic stem cells, or ES cells, and the investigation of their role in different cell types.To achieve this, we combine three highly efficient technologies. These include improved mouse embryonic stem cell isolation, recombination-based targeting factor assembly, and ES cell targeting via recombination-mediated cassette exchange, or RMC. Demonstrating some of the procedures will be Jinke D'Hont, a technician from my laboratory.Recombination-mediated cassette exchange, or RMCE, allows the interchange of DNA fragments between a vector and a genomic locus. RMCE takes advantage of hetero-specific recombination sites that do not cross-react and that are embedded in a genomic locus. In the presence of a donor plasmid that contains a DNA fragment flanked by the same hetero-specific sites, the recombinase will insert this DNA fragment into the RMCE-compatible genomic locus because of double simultaneous translocation.Only upon correct recombination, the trapped promoterless Neomycin-resistance gene in the Rosa 26 docking site, will be restored via a PGK promoter in the incoming targeting vector, which renders drug-resistance. This Neomycin resistance trap system results in a very high targeting efficiency, often close to 100%The day before blastocyst isolation, add 0.1%gelatin, to 12 well-cultured plates. And incubate them at 37 degrees Celsius for five minutes.Aspirate the gelatin solution. Then seed one quarter of a vial of P2 Mouse Embryonic Fibroblasts, or MEFs, into MEF medium, and divide over the 12-well plate. Incubate the 12-well plates of MEFs in two milliliters of MEF medium at 37 degrees Celsius.And grow the cells to a confluent monolayer. Then add 10 micrograms per milliliter of Mitomycin seed to the wells. And incubate the cultures for three hours at 37 degrees Celsius, to inactivate the cells.After selecting heterozygous knock out mice containing an RMCE cassette in the Rosa 26 locus according to the text protocol, set up matings to breed RMCE-compatible heterozygous knock out mice, with heterozygous knock out mice. The following morning, check for copulation plugs by lifting the female by the base of the tale, and examine the vaginal opening for a whitish mass. If the plug is difficult to see, with an angled probe, slightly spread the lips of the vulva, then separate the plugged females from their males.To collect blastocysts at 3.5 days post-coitus, or DPC. After euthanizing the pregnant females, make a mid-ventral incision, and use fine scissors and forceps to dissect the uterus and oviduct. Next, bend a 26-gauge needle into a 45-degree angle attached to a 1 milliliter syringe filled with M2 medium.And insert the needle into the end of the uterus that is closest to the oviduct. Use fine forceps to hold the needle in place while pushing the plunger to flush the blastocysts from the uterus into the lid of a 10 centimeter dish. The uterus will swell, if the flushing is successful.Use a mouth pipette to collect all the embryos in a drop of M2 medium, and wash the embryos twice in a drop of M2 medium. Immediately after washing the embryos, use PBS, to wash the mitomycin-C inactivated cells twice. Then using a mouth pipette, plate each blastocyst onto a separate well of the mitomycin-C treated MEFs, in SRES cell medium, supplemented with pluripotent or 2I.Incubate the cultures at 37 degrees Celsius, and 5%carbon dioxide. Refresh the SREF cell medium every two to three days. Examine each blastocyst under a stereo microscope at 4X magnification, and check for hatching and detachment to the MEF layer.After 10 to 12 days of culture, under a stereo microscope, use a P10 pipette with disposable tips, to pick individual icium outgrowths. Transfer each outgrowth into approximately 10 microliters of medium to a V-shaped 96-well plate, containing 30 microliters per well of PBS. Using a multi-channel pipette, add 50 microliters of 0.25%trypsin to each well.And incubate the plate at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide for three minutes. Add 100 microliters of pre-incubated FPS-containing ES cell medium, and dissociate the icium outgrowths into single cells by pipetting 10 to 15 times. Then transfer the dissociated cells to mitomycin-C treated 96 well MEF plates.The following day, change the SR-based medium. Expand the ES cells in a similar fashion from 24 to 6-well plates. After identifying rescued CDNA vectors according to the text protocol, prepare a 10 microliter LR reaction using 100 nanograms of rescue CDNA vector, 150 nanograms of pre-excised RMCEDV1 vector, and two microliters of recombinase mix, containing a phage-encoded integrase, an excisionase, and a bacterial integration host factor.Incubate the reaction at 25 degrees Celsius for two hours. To transform the recombined vectors, add 5 microliters of each mixture, to 40 microliters of heat shock competent E.Coli bacteria, in a 2 milliliter skirted screw cap tube. And incubate the sample on ice for 20 minutes.Then incubate the cells at 37 degrees Celsius for five minutes. Add one milliliter of LB medium to the tube, and incubate the cells at 37 degrees Celsius for one hour. Plate 50 microliters on agar plates with ampicillin.And grow at 37 degrees Celsius overnight. Identify colonies with the correct targeting vector by using a P200 tip to randomly pick five colonies. Transfer the tip to a glass test tube containing two to five milliliters of LB medium, and grow overnight at 37 degrees Celsius.After extracting the DNA from each colony, validate the samples by digesting 0.5 to two micrograms of DNA, and separate the samples on a 1%agarose gel. Start a culture of RMCE compatible knock out ES cells, and passage them at least twice on MEFs, in FBS-based ES cell medium. Then split the ES cells on a gelatinized six-well plate.The following day, use 1.5 milliliters of FBS-based ES cell medium to refresh the ES cells that are about 50%confluent. Combine one microgram of pre-excised RMCEDV1 targeting vector, containing rescue CDNA, and one microgram of FLIPe expression plasmid, in 250 microliters of pure DMEM medium. Add seven microliters of lipofectin-based transvection reagent to 250 microliters of pure DMEM medium.And incubate the solution for five minutes at room temperature. Combine the DNA and lipofectin solutions. And incubate the mixture at room temperature for 20 minutes.Then pipette the transvection mixture onto the refreshed ES cells, and gently swirl. One day after transvection, split all ES cells from the tube to a 10-centimeter culture dish, with a confluent layer of DR4 MEFS, and 10 milliliters of FPS-based ES cell medium. Two days after transvection, select ES cell clones with the correct FLIP-e mediated cassette exchange, by adding G418 to the medium.As shown here, massive killing of non-targeted colonies should be visible after three to five days. Colonies should appear after seven to 10 days. Pick these colonies, then expand them, and verify the clones as demonstrated earlier in this video.To differentiate ES cells into embryoid bodies, or EBs, after culturing knock out ES cells with Rosa 26-driven rescue constructs according to the text protocol, allow EBs to form in the non-adherent dishes for 30 days. Refresh the medium every two to three days by transferring the EB suspension to a 50 milliliter tube. And let the EBs settle by gravity.Remove the supernatant, add fresh medium, and transfer the EB suspension to a bacterial-grade dish. Analyze the ES cells and EBs by immunofluorescence and TEM, according to the text protocol. Using the structure function method, five pre-excised RMCEDV1 targeting vectors were generated with an efficiency of 100%and these rescue constructs were targeted via RMCE, to P120 catenin knock out ES cells, with an efficiency of 97%Cystic EB morphology can be used as a phenotypic readout to screen different rescue constructs.As proof of concept, R26-driven P120 catenin isoform 1A rescued the p120 catenin knock out phenotype. To test whether E-cadherin independent membrane anchoring of P120 catenin enabled csytic EB formation, the k-ras membrane targeting motif, CAAX, was fused to the carboxy terminus of P120 catenin, and introduced via RMCE, to P120 catenin knock out ES cells, before EBs were made from them. However, this construct serves a dominant negative that does not allow binding and stabilization of E-cadherin.And as a consequence, does not rescue the p120 catenin knock out phenotype. Epithelial-mesenchymal transition, or EMT, is an essential developmental process that also occurs during ES cell differentiation. When expressed in p120 catenin knock out ES cells, the EMT inducers, ZEB1, ZEB2, or snail that can directly repress various epithelial marker genes like E-cadherin, failed to restore cystic EB formation.Once mastered, RMCE compatible ES cells can be isolated within one month. RMCE compatible targeting vectors can be generated within one week, and targeted rescue of ES cells can be achieved within one month using this technique, if it is performed properly. After watching this video, you should have a good understanding of how to use RMCE to perform structure function studies in naive or differentiated embryonic stem cells.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Developmental Biology

Cellular Processes

Cell Structure and Function

SCIENTISTS IN ACTION

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

اشتقاق خلايا القلب السلف من الخلايا الجذعية الجنينية

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

التمايز العصبي للماوس الخلايا الجذعية الجنينية في المصل خالية أحادي الطبقة الثقافة

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

توليد كريسبر / Cas9 ساطة Monoallelic الحذف لدراسة وظيفة محسن في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

إنتاج الخلايا الجذعية المحفزة من الفأر الأمنيوسي الخلايا السوائل عن طريق نظام ينقول

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

فوتوكونفيرسيون خلية واحدة في معيشة سليمة الزرد

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

التحليل الحسابي ل Germline ايليجانس كاينورهابديتيس دراسة توزيع الأنوية، والبروتينات، وسيتوسكيليتون

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

في المختبر توليد المشتقات سميط من البشرية التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

تقييم الضرر التأكسدي في الخلايا السطحية الرئيسية للفأرة /الخلايا الجذعية استجابة للأضرار فوق البنفسجية-C (UV-C)

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

نظام فحص تكوين الأوعية ثلاثي الأبعاد باستخدام Spheroids الثقافة المشتركة التي شكلتها الخلايا المكونة للمستعمرة البطانية والخلايا الجذعية Mesenchymal

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

كفاءه التمايز العصبي باستخدام ثقافة خليه واحده من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...