Name: structure-function studies in mouse embryonic stem cells using recombinase-mediated cassette exchange
Uploaded: 2017-04-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange at JoVE.com

Мы благодарим Jinke D&#39;Гонт, Frederique Van Rockeghem, Натали Фарла, Келли Лемейр и Рит De Rycke за отличную техническую поддержку. Мы также благодарим Eef Parthoens, Evelien Ван Hamme и Аманда Гонсалвес из биоимиджинга ядра фонда научно-исследовательского центра Воспаление за помощь экспертов. Мы признаем член нашей исследовательской группы за ценное обсуждение. Эта работа была поддержана научной политики Бельгии (Belspo Межвузовский Аттракцион Столбы - Премия IAP VII-07 DevRepair; https://devrepair.be), Королева Элизабет Медицинский фонд, Бельгия (GSKE 2008-2010 годы; HTTP: // WWW .fmre-gske.be), так и действиями Согласованное исследований (ГОА 01G01908) из университета Гента, Бельгия (http://www.ugent.be/en/ghentuniv). СГ постдокторант из Фландрии научных фондов (FWO-V).

Были проведены все эксперименты на мышах по институциональным, национальным и европейским нормам животных. 1. Выделение RMCE-совместимых mESCs KO <ol><li> Порода гетерозиготных мышей KO с RMCE-совместимых мышей, таких как ROSALUC мышей 10 или ROSA26-иПСК мышей 21. Оба RMCE-совме?...

<ol>
	<li>Gul, I. S., Hulpiau, P., Saeys, Y., van Roy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metazoan+evolution+of+the+armadillo+repeat+superfamily.">Metazoan evolution of the armadillo repeat superfamily.</a> Cell Mol Life Sci. , (2016).</li><li>Valenta, T., Hausmann, G., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+and+functions+of+beta-catenin.">The many faces and functions of beta-catenin.</a> EMBO J. 31, 2714-2736 (2012).</li><li>Pieters, T., van Hengel, J., van Roy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+p120ctn+in+development+and+disease.">Functions of p120ctn in development and disease.</a> Front Biosci. 17, 760-783 (2012).</li><li>Keirsebilck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+the+human+p120ctn+catenin+gene+(CTNND1):+Expression+of+multiple+alternatively+spliced+isoforms.">Molecular cloning of the human p120ctn catenin gene (CTNND1): Expression of multiple alternatively spliced isoforms.</a> Genomics. 50, 129-146 (1998).</li><li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+in+mice:+functional+analysis+of+the+mammalian+genome+for+the+twenty-first+century.">Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century.</a> Nat Rev Genet. 6, 507-512 (2005).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153, 910-918 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154, 1370-1379 (2013).</li><li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+off-target+mutagenesis+induced+by+CRISPR-Cas+nucleases+in+human+cells.">High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.</a> Nat Biotechnol. 31, 822-826 (2013).</li><li>Branda, C. S., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Talking+about+a+revolution:+The+impact+of+site-specific+recombinases+on+genetic+analyses+in+mice.">Talking about a revolution: The impact of site-specific recombinases on genetic analyses in mice.</a> Dev Cell. 6, 7-28 (2004).</li><li>Sandhu, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strict+control+of+transgene+expression+in+a+mouse+model+for+sensitive+biological+applications+based+on+RMCE+compatible+ES+cells.">Strict control of transgene expression in a mouse model for sensitive biological applications based on RMCE compatible ES cells.</a> Nucleic Acids Res. 39, 1 (2010).</li><li>Haenebalcke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+ROSA26-based+conditional+and/or+inducible+transgenesis+using+RMCE-compatible+F1+hybrid+mouse+embryonic+stem+cells.">Efficient ROSA26-based conditional and/or inducible transgenesis using RMCE-compatible F1 hybrid mouse embryonic stem cells.</a> Stem Cell Rev. 9, 774-785 (2013).</li><li>Pieters, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p120+Catenin-Mediated+Stabilization+of+E-Cadherin+Is+Essential+for+Primitive+Endoderm+Specification.">p120 Catenin-Mediated Stabilization of E-Cadherin Is Essential for Primitive Endoderm Specification.</a> PLoS Genet. 12, e1006243 (2016).</li><li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos.">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154-156 (1981).</li><li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells.">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 7634-7638 (1981).</li><li>Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+generation+of+C57BL/6J+mouse+embryonic+stem+cells+in+a+defined+serum-free+media.">Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media.</a> Genesis. 39, 100-104 (2004).</li><li>Bryja, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+the+derivation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">An efficient method for the derivation of mouse embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 24, 844-849 (2006).</li><li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal.">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453, 519-523 (2008).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+embryonic+stem+cells+by+a+small+molecule.">Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17266-17271 (2006).</li><li>Pieters, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+User-Friendly+Pluripotin-based+Derivation+of+Mouse+Embryonic+Stem+Cells.">Efficient and User-Friendly Pluripotin-based Derivation of Mouse Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cell Rev. 8, (2012).</li><li>Yang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotin+combined+with+leukemia+inhibitory+factor+greatly+promotes+the+derivation+of+embryonic+stem+cell+lines+from+refractory+strains.">Pluripotin combined with leukemia inhibitory factor greatly promotes the derivation of embryonic stem cell lines from refractory strains.</a> Stem Cells. 27, 383-389 (2009).</li><li>Haenebalcke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ROSA26-iPSC+Mouse:+A+Conditional,+Inducible,+and+Exchangeable+Resource+for+Studying+Cellular+(De)Differentiation.">The ROSA26-iPSC Mouse: A Conditional, Inducible, and Exchangeable Resource for Studying Cellular (De)Differentiation.</a> Cell Rep. 3, (2013).</li><li>Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+mouse+strain+expressing+four+drug-selectable+marker+genes.">A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes.</a> Nucleic Acids Res. 25, 3745-3746 (1997).</li><li>Nyabi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+mouse+transgenesis+using+Gateway-compatible+ROSA26+locus+targeting+vectors+and+F1+hybrid+ES+cells.">Efficient mouse transgenesis using Gateway-compatible ROSA26 locus targeting vectors and F1 hybrid ES cells.</a> Nucleic Acids Res. 37, 55 (2009).</li><li>Katzen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gateway((R))+recombinational+cloning:+a+biological+operating+system.">Gateway((R)) recombinational cloning: a biological operating system.</a> Expert Opin Drug Discov. 2, 571-589 (2007).</li><li>Schaft, J., Ashery-Padan, R., vander Hoeven, F., Gruss, P., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+FLP+recombination+in+mouse+ES+cells+and+oocytes.">Efficient FLP recombination in mouse ES cells and oocytes.</a> Genesis. 31, 6-10 (2001).</li><li>Spencer, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+inhibits+cell+surface+localization+of+the+pro-migratory+5T4+oncofetal+antigen+in+mouse+embryonic+stem+cells.">E-cadherin inhibits cell surface localization of the pro-migratory 5T4 oncofetal antigen in mouse embryonic stem cells.</a> Mol Biol Cell. 18, 2838-2851 (2007).</li><li>Stryjewska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zeb2+Regulates+Cell+Fate+at+the+Exit+from+Epiblast+State+in+Mouse+Embryonic+Stem+Cells.">Zeb2 Regulates Cell Fate at the Exit from Epiblast State in Mouse Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. , (2016).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , (2003).</li><li>van den Berghe, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+migration+of+cortical+interneurons+depends+on+the+cell-autonomous+action+of+Sip1.">Directed migration of cortical interneurons depends on the cell-autonomous action of Sip1.</a> Neuron. 77, 70-82 (2013).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EMT+transcription+factor+Zeb2+controls+adult+murine+hematopoietic+differentiation+by+regulating+cytokine+signaling.">The EMT transcription factor Zeb2 controls adult murine hematopoietic differentiation by regulating cytokine signaling.</a> Blood. , (2016).</li></ol>

Наш метод изоляции мЭСК является удобным и не требует особых навыков или оборудования, таких как микрохирургии бластоцисты. Таким образом, эта технология доступна для значительной части научного сообщества. Любой человек, имеющий базовый опыт культивирования клеток могут распростра?...

Предполагается, что геномы млекопитающих содержат около 20000 белок-кодирующих генов. Альтернативный сплайсинг и посттрансляционные модификации дальнейшего увеличения белка репертуара. Белки имеют модульную конструкцию 1 и часто содержат несколько доменов взаимодействия, которые позволяют их набор в различные белковых комплексы и их участие в многочисленных клеточных процессах 2. Одним из примеров является многофункциональный белок под названием p120ctn. p120ctn кодируется геном Ctnnd1 и состоит из большого центрального домена армадилл повтора в окружении N-концевой области и С-концевой. Домен армадилла из p120ctn связывается с высоко консервативным доменом околомембранного классических кадхеринов, которые участвуют в межклеточной адгезии, но она также связывается с репрессором транскрипции Kaiso. N-концевой домен p120ctn взаимодействует с различными киназ, фосфатаз, небольшие RhoGTPases, и ассоциированный с микротрубочками рroteins 3. Интересно отметить , что в результате альтернативного сплайсинга, p120ctn изоформы могут быть получены из четырех альтернативных стартовых кодонов 4. p120ctn изоформы 1A является самым длинным, как это переводится с большей-5&#39; старт-кодоном и содержит полноразмерный N-концевой сегмент. В p120ctn изоформ 3 и 4, это N-концевой сегмент удаляется частично и полностью, соответственно. Понимание точной роли белков (или белкового изоформ) и их доменов в различных клеточных функциях остается проблемой. Ген ориентации в mESCs позволяет исследовать функции белка через генетической делеции соответствующего гена и широко способствовал выявлению онтогенетически важных и болезненных значимых генов и путей. Этот прорыв в обратной генетики явилась результатом достижений в области изоляции MESC и гена ориентации за счет гомологичной рекомбинации 5 </sвверх&gt;. Гомологичная рекомбинация представляет собой процесс, в котором происходят обмен ДНК-фрагменты между двумя аналогичными или идентичными нуклеиновыми остатками после того, как двухцепочечный (DS) разрывами ДНК. Как правило, HR является неэффективным, поскольку дц перерывы являются нечастыми. В последнее время , эффективность гомологического-направленный ген ориентации может быть увеличена с помощью сайта-специфических нуклеаз 6, 7, но , к сожалению, они склонны к вне целевых эффектов 8. Более надежный метод для того, чтобы ген таргетирование RMCE, который основан на конкретных участках систем рекомбинации, таких как Cre / LoxP или FLPe / Frt. LoxP и последовательность Frt найдены в бактериофаге Р1 и Saccharomyces CEREVISIAE, соответственно, и состоит из 34 пар оснований , в том числе последовательности асимметричных 8 пар оснований, которая определяет ориентацию сайта. С другой стороны, ориентация, например, два LoxP сайтов в участке ДНК будет определять, является ли становится вырезала floxed ДНК или яnversed при Cre-опосредованной рекомбинации 9. Кроме того, Cre может также индуцировать транслокацию, если два участка расположены на разных хромосомах. RMCE воспользовался преимуществом неспецифических сайтов рекомбинации, которые не вступают в перекрестную реакцию и внедренных в геномной локуса. В присутствии донора плазмиды, содержащая фрагмент ДНК , фланкированной один и та же неспецифических сайтами, то рекомбиназа будет вставить этот фрагмент ДНК в RMCE-совместимый геномный локус из - за двойное одновременное транслокации (рисунок 1). Здесь только правильно RMCE-ориентированные клоны могут оказать лекарственную устойчивость благодаря промотору на входящем векторе , который восстанавливает «ловушка» промотор-менее ген резистентности к неомицину (Neo R) присутствует в R26 геноме дока - клетках (фигура 1) 10, 11. Это приводит к очень высокой эффективности таргетинга, часто близкой к 100%, 11 &lt;/ SUP&gt; 12. В заключении, на основе RMCE нацеливание имеет высокую эффективность и может быть использовано для структуры-функции исследований; Однако, это требует предварительно спроектированных геномного локуса. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/55575/55575fig1.jpg" /> Рисунок 1. Схематическое изображение RMCE-опосредованной нацеливание. RMCE позволяет для обмена сегментов ДНК из входящего вектора направленного к определенной геномной локуса, если оба питают два неспецифических сайтов FRT (изображенные белыми и красными треугольниками). Кроме того, разработано геномный локус содержит ген без промотора и усеченной неомицин-сопротивление (Neo R). Предоставляя промотор и стартовый кодон во фрагменте ДНК входящего, только правильные события рекомбинации восстановить устойчивость к неомицину, что приводит к высокой эффективности таргетинга. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55575/55575fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55575/55575fig1large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55575/55575fig1large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию т</a>его фигура. Геном инжиниринг в mESCs позволяет для генерации RMCE-совместимых мышей. В 1981 году две группы удалось захватить плюрипотентных клеток из внутренней клеточной массы (ICM) бластоцист и в поддержании их в культуре 13, 14. mESCs способны к самообновлению и дифференцировке во все типы эмбриональных и взрослых клеток, в том числе зародышевых клеток линии. Таким образом, ген ориентации в mESCs дает обратное генетические исследования путем разработки конститутивного или условного (с использованием системы / LoxP Cre) мышей KO. Тем не менее, классический способ выделения клеток мыши ES очень неэффективно. Несколько основных улучшений значительно увеличили вероятность успеха для получения линий MESC, в том числе использование определенного сывороточного замещения (SR) среды 15, чередуя MESC среде , содержащей SR и фетальной бычьей сыворотки (FBS) 16, а также использование фармакоЛогические соединения , такие как pluripotin или 2i 17. Pluripotin, небольшая синтетическая молекула, позволяет для распространения mESCs в недифференцированном состоянии в отсутствии фактора ингибировани лейкоза (LIF) и эмбриональных фибробласты мышей (MEFs) 18. Наконец, было показано , что mESCs может быть выделен с очень высокой эффективностью (близкой к 100%) , когда / ФБС протокола SR среднего чередование сочетается с LIF и pluripotin 19, 20. Эти протоколы позволяют эффективно изолировать RMCE-совместимый KO mESCs, которые впоследствии могут быть использованы для исследований структурно-функциональных. В этой статье описан способ, который дает возможность определить ключевые домены или остатки в пределах белка, которые отвечают за специфических клеточных процессов. С этой целью трубопровод передовых технологий, позволяющих эффективно изоляции мЭСК, ориентации вектора сборки и мЭСК нацеливания было создатьд. Как таковые, большие панели с изоформы белка, мутанты доменов и вниз по течению эффекторов могут быть введены в KO mESCs и могут быть оценены по их способности , чтобы спасти в пробирке KO фенотип.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="766">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">ROSALUC Mice</td>
			<td style="width:143px;">made in house</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:245px;">frozen sperm available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">R26-iPSC mice</td>
			<td style="width:143px;">made in house</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:245px;">frozen sperm available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Vessel probe</td>
			<td style="width:143px;">Fine Science Tools</td>
			<td>10160-13</td>
			<td style="width:245px;">to check for copulation plugs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">M2 medium</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">M7167</td>
			<td style="width:245px;">make aliquots and store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">Fine forceps (Dumont #5 Standard tip Student forceps)</td>
			<td style="width:143px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:107px;">11251-10</td>
			<td style="width:245px;">spray with 70% EtOH before use (do not autoclave)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">23G needles</td>
			<td style="width:143px;">Fine-ject</td>
			<td style="width:107px;">8697</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">1-ml syringes</td>
			<td style="width:143px;">Soft-ject</td>
			<td style="width:107px;">6680</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">60-mm bacterial grade plates (for flushing)&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Gosselin</td>
			<td style="width:107px;">BB60-01</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Mouth pipette</td>
			<td style="width:143px;">made in house</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:245px;">see discussion</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">Mouse embryonic fibroblasts (MEFs, TgN (DR4)1 Jae strain)</td>
			<td style="width:143px;">ATTC</td>
			<td style="width:107px;">SCRC-1045</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">TgN (DR4)1 Jae mice</td>
			<td style="width:143px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:107px;">3208</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Mitomycin C&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">M0503</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">Phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">14190-094</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:272px;">Tg(DR4)1Jae/J mice</td>
			<td style="width:143px;">JAX</td>
			<td style="width:107px;">3208</td>
			<td style="width:245px;">mice that contain four drug-selectable genes and DR4 MEFS confers resistance to neomycin, puromycin, hygromycin and 6-thioguanine</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">0.1% Gelatin</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">G1393</td>
			<td style="width:245px;">Dissolve 0.5 g in 500 ml distilled water, autoclave and store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Trypsin (0.25%)&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">25200-056</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">2 &#956;M pluripotin</td>
			<td style="width:143px;">Cayman Chemical</td>
			<td style="width:107px;">10009557</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:272px;">pRMCE-DV1</td>
			<td style="width:143px;">BCCM/LMBP collection&#160;</td>
			<td style="width:107px;">LMBP 08870</td>
			<td style="width:245px;">public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:272px;">cre-excised pRMCE-DV1</td>
			<td style="width:143px;">BCCM/LMBP collection&#160;</td>
			<td style="width:107px;">LMBP 08195</td>
			<td style="width:245px;">public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">pCAG-FlpE-IRES-Puro-pA&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Addgene</td>
			<td style="width:107px;">20733</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">heat-shock competent DH5&#945; bacteria&#160;</td>
			<td style="width:143px;">made in house</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">Gateway pDONR221 vector</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:107px;">12536-017</td>
			<td style="width:245px;">contains kanamycin-resistance gene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">BP clonase II mix</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:107px;">11789-020</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">LR clonase II mix</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:107px;">11791-020&#160;</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Luria Broth (LB)&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Ampicillin&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Applied Biosystems 3730XL DNA Analyzer</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:107px;">3730XL</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">G418</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:107px;">11811-023</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">Lipofectamine 2000 transfection reagent</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:107px;">11668027</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Lipofectamine LTX transfection reagent</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:107px;">15338100</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Effectene transfection reagent</td>
			<td style="width:143px;">Qiagen</td>
			<td style="width:107px;">301425</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">GATEWAY pENTR 1A vector</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:107px;">A10462</td>
			<td>recombination-compatible vector</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">mouse monoclonal anti-p120ctn antibody</td>
			<td style="width:143px;">BD Transduction Laboratories</td>
			<td style="width:107px;">610134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">mouse monoclonal anti-Ecadherin antibody</td>
			<td style="width:143px;">BD Transduction Laboratories</td>
			<td style="width:107px;">610181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">General equipment:</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">Sterile dissection tools</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:245px;">fine scissors and forceps for dissecting the uterus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Sterile pipettes: 5 ml, 10 ml and 25 ml</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">15-ml and 50-ml conical centrifuge tubes</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:272px;">96-well culture plates V-shaped bottom and flat bottom)&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">Culture dishes: 24 wells, 12 wells and 6 wells</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">Multichannel pipettes (to pipette 30, 50, 100 and 200 &#956;l)&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Sterile multichannel reservoirs</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Access to a laminar air flow</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:272px;">Access to an incubator at 37&#176;C with 5% CO2</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Access to an inverted microscope</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Access to a bench-top centrifuge</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">Access to a stereo microscope with transmitted-light&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Culture media:</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">MEF Medium:</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:245px;">stored at 4&#176;C; warm 30 min at 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">&#160;Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">41965-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">10% fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">F-7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">L-glutamine (2 mM)</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">25030-024&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Sodium pyruvate&#160; (0.4 mM)</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">11360-039&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">penicillin (100 U/ml)</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">15140-122&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">streptomycin (100 &#181;g/ml)</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">15140-122&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">SR-based mESC medium:</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:245px;">stored at 4&#176;C; warm 30 min at 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">31330-038</td>
			<td style="width:245px;">mixed in a 1:1 ratio</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">15% knock-out serum replacement (SR )</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">10828&#8211;028</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">L-glutamine (2 mM)</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">25030-024&#160;</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">0.1 mM non-essential amino acids&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">11140-050</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">penicillin (100 U/ml)</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">15140-122&#160;</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">streptomycin (100 &#181;g/ml)</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">15140-122&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">&#946;-mercaptoethanol (0.1 mM)&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">M 3148&#160;</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">2,000 U/ml recombinant mouse LIF&#160;</td>
			<td style="width:143px;">(IRC/VIB Protein Service facility)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">FBS-based mESC medium (similar to SR-based mESC medium):</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:245px;">stored at 4&#176;C; warm 30 min at 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Knockout DMEM</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">10829-018&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">15% FBS</td>
			<td style="width:143px;">Hyclone</td>
			<td style="width:107px;">SH30070.03E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Differention Medium</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:245px;">stored at 4&#176;C; warm 30 min at 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">21980-032&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">15% FBS</td>
			<td style="width:143px;">Hyclone</td>
			<td style="width:107px;">SH30070.03E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">5% CD Hybridoma Medium(1x) liquid&#160;&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">11279-023&#160;</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">&#160;2 mM L-glutamine</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">25030-024&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">0.4 mM 1-thioglycerol</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">M-6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">50 &#956;g/ml ascorbic acid</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">A-4544&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">penicillin (100 U/ml)</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">15140-122&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">streptomycin (100 &#181;g/ml)</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">15140-122&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2i</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">1 &#956;M Erk inhibitor PD0325901&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Axon Medchem</td>
			<td style="width:107px;">Axon 1408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">3 &#956;M Gsk3 inhibitor CHIR99021</td>
			<td style="width:143px;">Axon Medchem</td>
			<td style="width:107px;">Axon 1386</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

structure-function studies in mouse embryonic stem cells using recombinase-mediated cassette exchange

Генная инженерия в мышиных эмбрионов или эмбриональных стволовых клеток (mESCs) позволяет для изучения функции данного белка. Белки являются лошадками клетки и часто состоят из нескольких функциональных доменов, которые могут быть под влиянием посттрансляционных модификаций. Истощение всего белка в условном или конститутивном цепных из (KO) мышей не принимать во внимание это функциональное разнообразия и регулирование. Линии MESC и производная модель мыши, в котором стыковочный участок для FLPe рекомбинации опосредованного обмена кассеты (RMCE) был вставлен в ROSA26 (R26) локуса, ранее сообщались. Здесь мы сообщаем о структурно-функциональном подходе, который позволяет молекулярное рассечение различных функциональных многодоменного белка. С этой целью, RMCE-совместимыми мыши должны быть скрещены с мышами KO, а затем RMCE-совместимый mESCs KO должен быть изолирован. Далее, группа предполагаемых спасательных конструкций может быть введена в локус R26 через RMCE targetiнг. Спасательный кДНК-кандидатов может быть легко вставлен между RMCE участками ориентации вектора с использованием рекомбинации клонированию. Далее, KO mESCs трансфицируют с адресным переносчиком в сочетании с выражением рекомбиназы плазмиды FLPe. RMCE задействуется ген неомицин-сопротивления промотор-менее в док-сайтов ROSA26 и позволяет для выбора правильного события таргетинга. Таким образом, эффективность высокой таргетинга, близкие к 100%, получают, что позволяет для вставки множества предполагаемых спасательных конструкций в полу-высокой пропускной способности способом. Наконец, множество R26-управляемых спасательных конструктов могут быть проверены на предмет их способности, чтобы спасти фенотип, который наблюдался в родительских mESCs КО. Мы представляем структурно-функциональные исследования корректуры из-принципа в p120 катениной (p120ctn) KO mESCs с использованием энтодермы дифференциации эмбрионального телец (ЭТ) в качестве фенотипического считывания. Такой подход позволяет выявить важные области, предполагаемые пути вниз по течению, и болезни релевантной точкимутации, которые лежат в основе KO фенотипов для данного белка.

Процедура , чтобы изолировать RMCE-совместимой КО MESC линий изображена на рисунке 2. Два последовательных вязки должны получить RMCE-совместимый KO бластоцисты. Во-первых, гетерозиготные мыши KO скрещены с RMCE-совместимых мышей, чтобы получить RMCE-совместимый, гетероз...

Watch this Scientific Journal Video about Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange at JoVE.com

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Белки часто содержат несколько доменов, которые могут вызывать различные клеточные функции. Генные выбивки (KO) не считают это функциональное разнообразие. Здесь мы сообщаем о рекомбинации опосредованного обмена кассетного (RMCE) основа структурно-функциональный подходе в нокауте эмбриональных стволовых клеток, что позволяет для молекулярного рассечения различных функциональных доменов или вариантов белка.

Структурно-функциональные исследования в мышиных эмбриональных стволовых клеток Использование Рекомбиназа-опосредованного кассетный Обмен

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

The overall goal of this structure-function method is to dissect at the molecular level the role of different protein domains, or disease-relevance mutations, in naive or differentiated mouse embryonic stem cells. This method can help to reveal how different residues or domains of a protein can contribute to its function in a given cellular context. The main advantage of this technique is that it allows very efficient targeting of rescue constructs to the genome of knock out embryonic stem cells, or ES cells, and the investigation of their role in different cell types.To achieve this, we combine three highly efficient technologies. These include improved mouse embryonic stem cell isolation, recombination-based targeting factor assembly, and ES cell targeting via recombination-mediated cassette exchange, or RMC. Demonstrating some of the procedures will be Jinke D'Hont, a technician from my laboratory.Recombination-mediated cassette exchange, or RMCE, allows the interchange of DNA fragments between a vector and a genomic locus. RMCE takes advantage of hetero-specific recombination sites that do not cross-react and that are embedded in a genomic locus. In the presence of a donor plasmid that contains a DNA fragment flanked by the same hetero-specific sites, the recombinase will insert this DNA fragment into the RMCE-compatible genomic locus because of double simultaneous translocation.Only upon correct recombination, the trapped promoterless Neomycin-resistance gene in the Rosa 26 docking site, will be restored via a PGK promoter in the incoming targeting vector, which renders drug-resistance. This Neomycin resistance trap system results in a very high targeting efficiency, often close to 100%The day before blastocyst isolation, add 0.1%gelatin, to 12 well-cultured plates. And incubate them at 37 degrees Celsius for five minutes.Aspirate the gelatin solution. Then seed one quarter of a vial of P2 Mouse Embryonic Fibroblasts, or MEFs, into MEF medium, and divide over the 12-well plate. Incubate the 12-well plates of MEFs in two milliliters of MEF medium at 37 degrees Celsius.And grow the cells to a confluent monolayer. Then add 10 micrograms per milliliter of Mitomycin seed to the wells. And incubate the cultures for three hours at 37 degrees Celsius, to inactivate the cells.After selecting heterozygous knock out mice containing an RMCE cassette in the Rosa 26 locus according to the text protocol, set up matings to breed RMCE-compatible heterozygous knock out mice, with heterozygous knock out mice. The following morning, check for copulation plugs by lifting the female by the base of the tale, and examine the vaginal opening for a whitish mass. If the plug is difficult to see, with an angled probe, slightly spread the lips of the vulva, then separate the plugged females from their males.To collect blastocysts at 3.5 days post-coitus, or DPC. After euthanizing the pregnant females, make a mid-ventral incision, and use fine scissors and forceps to dissect the uterus and oviduct. Next, bend a 26-gauge needle into a 45-degree angle attached to a 1 milliliter syringe filled with M2 medium.And insert the needle into the end of the uterus that is closest to the oviduct. Use fine forceps to hold the needle in place while pushing the plunger to flush the blastocysts from the uterus into the lid of a 10 centimeter dish. The uterus will swell, if the flushing is successful.Use a mouth pipette to collect all the embryos in a drop of M2 medium, and wash the embryos twice in a drop of M2 medium. Immediately after washing the embryos, use PBS, to wash the mitomycin-C inactivated cells twice. Then using a mouth pipette, plate each blastocyst onto a separate well of the mitomycin-C treated MEFs, in SRES cell medium, supplemented with pluripotent or 2I.Incubate the cultures at 37 degrees Celsius, and 5%carbon dioxide. Refresh the SREF cell medium every two to three days. Examine each blastocyst under a stereo microscope at 4X magnification, and check for hatching and detachment to the MEF layer.After 10 to 12 days of culture, under a stereo microscope, use a P10 pipette with disposable tips, to pick individual icium outgrowths. Transfer each outgrowth into approximately 10 microliters of medium to a V-shaped 96-well plate, containing 30 microliters per well of PBS. Using a multi-channel pipette, add 50 microliters of 0.25%trypsin to each well.And incubate the plate at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide for three minutes. Add 100 microliters of pre-incubated FPS-containing ES cell medium, and dissociate the icium outgrowths into single cells by pipetting 10 to 15 times. Then transfer the dissociated cells to mitomycin-C treated 96 well MEF plates.The following day, change the SR-based medium. Expand the ES cells in a similar fashion from 24 to 6-well plates. After identifying rescued CDNA vectors according to the text protocol, prepare a 10 microliter LR reaction using 100 nanograms of rescue CDNA vector, 150 nanograms of pre-excised RMCEDV1 vector, and two microliters of recombinase mix, containing a phage-encoded integrase, an excisionase, and a bacterial integration host factor.Incubate the reaction at 25 degrees Celsius for two hours. To transform the recombined vectors, add 5 microliters of each mixture, to 40 microliters of heat shock competent E.Coli bacteria, in a 2 milliliter skirted screw cap tube. And incubate the sample on ice for 20 minutes.Then incubate the cells at 37 degrees Celsius for five minutes. Add one milliliter of LB medium to the tube, and incubate the cells at 37 degrees Celsius for one hour. Plate 50 microliters on agar plates with ampicillin.And grow at 37 degrees Celsius overnight. Identify colonies with the correct targeting vector by using a P200 tip to randomly pick five colonies. Transfer the tip to a glass test tube containing two to five milliliters of LB medium, and grow overnight at 37 degrees Celsius.After extracting the DNA from each colony, validate the samples by digesting 0.5 to two micrograms of DNA, and separate the samples on a 1%agarose gel. Start a culture of RMCE compatible knock out ES cells, and passage them at least twice on MEFs, in FBS-based ES cell medium. Then split the ES cells on a gelatinized six-well plate.The following day, use 1.5 milliliters of FBS-based ES cell medium to refresh the ES cells that are about 50%confluent. Combine one microgram of pre-excised RMCEDV1 targeting vector, containing rescue CDNA, and one microgram of FLIPe expression plasmid, in 250 microliters of pure DMEM medium. Add seven microliters of lipofectin-based transvection reagent to 250 microliters of pure DMEM medium.And incubate the solution for five minutes at room temperature. Combine the DNA and lipofectin solutions. And incubate the mixture at room temperature for 20 minutes.Then pipette the transvection mixture onto the refreshed ES cells, and gently swirl. One day after transvection, split all ES cells from the tube to a 10-centimeter culture dish, with a confluent layer of DR4 MEFS, and 10 milliliters of FPS-based ES cell medium. Two days after transvection, select ES cell clones with the correct FLIP-e mediated cassette exchange, by adding G418 to the medium.As shown here, massive killing of non-targeted colonies should be visible after three to five days. Colonies should appear after seven to 10 days. Pick these colonies, then expand them, and verify the clones as demonstrated earlier in this video.To differentiate ES cells into embryoid bodies, or EBs, after culturing knock out ES cells with Rosa 26-driven rescue constructs according to the text protocol, allow EBs to form in the non-adherent dishes for 30 days. Refresh the medium every two to three days by transferring the EB suspension to a 50 milliliter tube. And let the EBs settle by gravity.Remove the supernatant, add fresh medium, and transfer the EB suspension to a bacterial-grade dish. Analyze the ES cells and EBs by immunofluorescence and TEM, according to the text protocol. Using the structure function method, five pre-excised RMCEDV1 targeting vectors were generated with an efficiency of 100%and these rescue constructs were targeted via RMCE, to P120 catenin knock out ES cells, with an efficiency of 97%Cystic EB morphology can be used as a phenotypic readout to screen different rescue constructs.As proof of concept, R26-driven P120 catenin isoform 1A rescued the p120 catenin knock out phenotype. To test whether E-cadherin independent membrane anchoring of P120 catenin enabled csytic EB formation, the k-ras membrane targeting motif, CAAX, was fused to the carboxy terminus of P120 catenin, and introduced via RMCE, to P120 catenin knock out ES cells, before EBs were made from them. However, this construct serves a dominant negative that does not allow binding and stabilization of E-cadherin.And as a consequence, does not rescue the p120 catenin knock out phenotype. Epithelial-mesenchymal transition, or EMT, is an essential developmental process that also occurs during ES cell differentiation. When expressed in p120 catenin knock out ES cells, the EMT inducers, ZEB1, ZEB2, or snail that can directly repress various epithelial marker genes like E-cadherin, failed to restore cystic EB formation.Once mastered, RMCE compatible ES cells can be isolated within one month. RMCE compatible targeting vectors can be generated within one week, and targeted rescue of ES cells can be achieved within one month using this technique, if it is performed properly. After watching this video, you should have a good understanding of how to use RMCE to perform structure function studies in naive or differentiated embryonic stem cells.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Developmental Biology

Cellular Processes

Cell Structure and Function

SCIENTISTS IN ACTION

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Вывод сердца клеток-предшественников из эмбриональных стволовых клеток

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Дифференциация нейронных эмбриональных стволовых клеток мыши в бессывороточной монослоя культуры

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Создание CRISPR / cas9 опосредованного моноаллельной Пропуски для изучения Enhancer Функция в эмбриональных стволовых клетках мышей

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Производство плюрипотентных стволовых клеток из амниотической жидкости для мыши клеток с использованием транспозона системы

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Photoconversion одноклеточных в живых нетронутыми данио рерио

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Вычислительный анализ микрофлорой Caenorhabditis elegans для изучения распределения ядер, белки и Цитоскелет

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

В Vitro поколения Сомит производных от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Оценка окислительного повреждения в первичной мыши глазной поверхностных клеток / стволовых клеток в ответ на ультрафиолет-C (UV-C) Ущерб

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Трехмерная система ассеаа ассеа ангиогенеза с использованием сокультурных сфероидов, сформированных эндотелиальными колоний формирования клеток и мезенхимальных стволовых клеток

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Эффективная нейронная дифференциация с использованием одноклеточной культуры эмбриональных стволовых клеток человека

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...