Name: voltage-clamp fluorometry in xenopus oocytes using fluorescent unnatural amino acids
Uploaded: 2017-05-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids at JoVE.com

وكان باناب هدية نوع من الدكتور بيتر شولتز (معهد سكريبس للبحوث). وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الكندية لبحوث الصحة المنح موب-102689 و موب-136894 (إلى رب) والمؤسسة الكندية للابتكار منحة 950-225005.

تم إجراء التلاعب الضفدع وفقا للمبادئ التوجيهية الكندية وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة الأخلاقيات (كديا، بروتوكول رقم 15-042) من جامعة مونتريال. 1. مرنا إعداد ل فوا التأسيس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار مو?...

<ol>
	<li>Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+physical+measure+of+conformational+rearrangement+underlying+potassium+channel+gating.">Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating.</a> Science. 271 (5246), 213-216 (1996).</li><li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+internal+pore+opening+in+K(V)+channels+probed+by+a+fluorescent+unnatural+amino+acid.">Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (20), 8272-8277 (2013).</li><li>Xiao, H., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+the+Interface+of+Chemical+and+Biological+Synthesis:+An+Expanded+Genetic+Code.">At the Interface of Chemical and Biological Synthesis: An Expanded Genetic Code.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (9), (2016).</li><li>Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+9.">Chapter 9.</a> Handbook of Ion Channels. , 113-133 (2015).</li><li>Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+probe+in+mammalian+cells.">A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells.</a> J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).</li><li>DeBerg, H. A., Brzovic, P. S., Flynn, G. E., Zagotta, W. N., Stoll, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Energetics+of+Allosteric+Regulation+of+HCN2+Ion+Channels+by+Cyclic+Nucleotides.">Structure and Energetics of Allosteric Regulation of HCN2 Ion Channels by Cyclic Nucleotides.</a> J Biol Chem. 291 (1), 371-381 (2016).</li><li>Shen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoding+unnatural+amino+acids+in+neural+stem+cells+and+optically+reporting+voltage-sensitive+domain+changes+in+differentiated+neurons.">Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons.</a> Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).</li><li>Aman, T. K., Gordon, S. E., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+CNGA1+Channel+Gating+by+Interactions+with+the+Membrane.">Regulation of CNGA1 Channel Gating by Interactions with the Membrane.</a> J Biol Chem. 291 (19), 9939-9947 (2016).</li><li>Haddad, G. A., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mode+shift+of+the+voltage+sensors+in+Shaker+K++channels+is+caused+by+energetic+coupling+to+the+pore+domain.">Mode shift of the voltage sensors in Shaker K+ channels is caused by energetic coupling to the pore domain.</a> J Gen Physiol. 137 (5), 455-472 (2011).</li><li>Batulan, Z., Haddad, G. A., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intersubunit+interaction+between+S4-S5+linker+and+S6+is+responsible+for+the+slow+off-gating+component+in+Shaker+K++channels.">An intersubunit interaction between S4-S5 linker and S6 is responsible for the slow off-gating component in Shaker K+ channels.</a> J Biol Chem. 285 (18), 14005-14019 (2010).</li><li>Kusch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+subunits+cooperate+in+cAMP-induced+activation+of+homotetrameric+HCN2+channels.">How subunits cooperate in cAMP-induced activation of homotetrameric HCN2 channels.</a> Nat Chem Biol. 8 (2), 162-169 (2012).</li><li>Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+incorporation+of+a+small,+environmentally+sensitive,+fluorescent+probe+into+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).</li><li>Summerer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+amino+acid.">A genetically encoded fluorescent amino acid.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).</li><li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reinitiation+at+non-canonical+start+codons+leads+to+leak+expression+when+incorporating+unnatural+amino+acids.">Reinitiation at non-canonical start codons leads to leak expression when incorporating unnatural amino acids.</a> Sci Rep. 5, 11866 (2015).</li><li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+one-step+site-directed+deletion,+insertion,+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol.">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC Biotechnol. 8, 91 (2008).</li><li>Beckert, B., Masquida, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+RNA+by+in+vitro+transcription.">Synthesis of RNA by in vitro transcription.</a> Methods Mol Biol. 703, 29-41 (2011).</li><li>Goldin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+Xenopus+laevis+and+oocyte+injection.">Maintenance of Xenopus laevis and oocyte injection.</a> Methods Enzymol. 207, 266-279 (1992).</li><li>Rudokas, M. W., Varga, Z., Schubert, A. R., Asaro, A. B., Silva, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+oocyte+cut-open+vaseline+gap+voltage-clamp+technique+with+fluorometry.">The Xenopus oocyte cut-open vaseline gap voltage-clamp technique with fluorometry.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li><li>Zhao, J., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolated+voltage+sensing+domain+of+the+Shaker+potassium+channel+forms+a+voltage-gated+cation+channel.">The isolated voltage sensing domain of the Shaker potassium channel forms a voltage-gated cation channel.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Posson, D. J., Ge, P., Miller, C., Bezanilla, F., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+vertical+movement+of+a+K++channel+voltage+sensor+measured+with+luminescence+energy+transfer.">Small vertical movement of a K+ channel voltage sensor measured with luminescence energy transfer.</a> Nature. 436 (7052), 848-851 (2005).</li><li>Chanda, B., Asamoah, O. K., Blunck, R., Roux, B., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+charge+displacement+in+voltage-gated+ion+channels+involves+limited+transmembrane+movement.">Gating charge displacement in voltage-gated ion channels involves limited transmembrane movement.</a> Nature. 436 (7052), 852-856 (2005).</li><li>Taraska, J. W., Puljung, M. C., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-distance+probes+for+protein+backbone+structure+based+on+energy+transfer+between+bimane+and+transition+metal+ions.">Short-distance probes for protein backbone structure based on energy transfer between bimane and transition metal ions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16227-16232 (2009).</li><li>Baker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+sensors+of+membrane+potential.">Genetically encoded fluorescent sensors of membrane potential.</a> Brain Cell Biol. 36 (1-4), 53-67 (2008).</li><li>Miranda, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-dependent+FRET+reports+calcium-+and+voltage-dependent+gating-ring+motions+in+BK+channels.">State-dependent FRET reports calcium- and voltage-dependent gating-ring motions in BK channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).</li><li>Sisido, M., Ninomiya, K., Ohtsuki, T., Hohsaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-base+codon/anticodon+strategy+and+non-enzymatic+aminoacylation+for+protein+engineering+with+non-natural+amino+acids.">Four-base codon/anticodon strategy and non-enzymatic aminoacylation for protein engineering with non-natural amino acids.</a> Methods. 36 (3), 270-278 (2005).</li><li>Hohsaka, T., Ashizuka, Y., Murakami, H., Sisido, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five-base+codons+for+incorporation+of+nonnatural+amino+acids+into+proteins.">Five-base codons for incorporation of nonnatural amino acids into proteins.</a> Nucleic Acids Res. 29 (17), 3646-3651 (2001).</li></ol>

في أمينواسيلاتيون في الجسم الحي من ترناس التي يجري بشكل مستمر يجري نسخها جنبا إلى جنب مع الحمض الريبي النووي النقال-سينثيتاس، يجعل من الممكن الحصول على مستويات التعبير عالية لقياسات مضان. لدمج فوا كفاءة، فمن الأهمية بمكان أن يتم حقن باناب بشكل صحيح في النو?...

وقد تم دمج أكثر من 200 من الأحماض الأمينية غير الطبيعية من مختلف الخصائص الكيميائية والفيزيائية وراثيا في البروتينات في E. القولونية والخميرة وخلايا الثدييات 3 . يتم تضمين الأحماض الأمينية غير الطبيعية ردا على كودون وقف معين عن طريق زوج متعامد المهندسة الحمض الريبي النووي النقال / سينثيتاس. وقد وفرت النهج الوراثي لتعديل البروتينات رؤى قيمة في هيكل البروتين وظيفة. هنا، نقدم بروتوكول لاستخدام الجهد المشبك فلوروميتري (فف) في تركيبة مع وا الفلورسنت. في فف، ومراقبة في وقت واحد من البيانات الوظيفية وإعادة الهيكلة الهيكلي المترجمة حول مسبار الفلورسنت (~ 5 Å) يسمح لنا للحصول على معلومات ديناميكية مع ميلي ثانية واحدة القرار 1 . تحقيقات الفلورسنت تغير حالة التبريد الخاصة بهم على حركة محلية من البروتين. حركة فقط 1-2 Å كافية تؤدي إلى تغييرات كبيرة في مضانكثافة 4 . بعد تحديد موقع الفائدة في البروتين المستهدف، يتم تحور الموقع عن طريق طفرة نقطة. بشكل كلاسيكي، تم تحوير بقايا إلى السيستين في حين الآن، يتم إدخال كودون وقف العنبر (تاج) لدمج فوا الوراثية. ثم يتم في البروتين المختبر كتب في المختبر . في حين أن أنظمة التعبير الأخرى (على سبيل المثال، خلايا الثدييات) يمكن استخدامها 5 ، 6 ، 7 ، والبويضات القيطم هي الأفضل للدراسات هيكل وظيفة بسبب حجمها أكبر، مما يؤدي إلى التلاعب أسهل وكثافة أعلى مضان (أكثر فلوروفوريس)، وبالتالي، إلى نسبة الضوضاء. وعلاوة على ذلك، البويضات القيطم لها خلفية منخفضة من البروتينات الذاتية 2 ، 8 ، والتصبغ الظلام على الدروع القطب الحيواني ضد مضان الخلفية من رانه سايتوسول. يتم إزالة البويضات القيطم جراحيا ويتم حقن الحمض النووي ترميز الحمض الريبي النووي النقال متعامد / الحمض الريبي النووي النقال-سينثيتاس محددة ل فوا في نواة البويضات. بعد 6-24 ساعة ساعة الحضانة، يتم حقن الحمض النووي الريبي البروتين مع فوا في السيتوسول من البويضات، تليها فترة الحضانة 2-3 أيام. من أجل منع أي ضرر على فوا (فوتوبلاشينغ)، والإجراءات بما في ذلك أناب يجب أن تنفذ تحت الضوء الأحمر لتجنب فلورفور الإثارة. يتم دراسة البويضات على قطع مفتوحة البويضة الجهد المشبك الإعداد، والتي هي التي شنت على المجهر مضان تستقيم، وتسجيل التيار الكهربائي والتغيرات مضان في وقت واحد 9 ، 10 . بدلا من ذلك، اثنين من القطب الكهربائي المشبك الجهد 1 أو التصحيح المشبك تكوينات 11 يمكن استخدامها. مضان هو متحمس من قبل الأطوال الموجية المناسبة مع انخفاض الضوضاء رمز و<html> الانبعاثات المسجلة باستخدام الثنائي الضوئي مرتبطة مكبر للصوت مع التضخيم عالية. هناك العديد من المزايا من استخدام الفلورسنت الأحماض الأمينية غير طبيعية (فواس) في فلوريوميتري الجهد المشبك. واحد هو الوصول إلى الجانب عصاري خلوي من البروتينات الغشاء. وتقع العديد من العمليات التنظيمية هنا (على سبيل المثال، كا 2 + - أو المواقع النوكليوتيدات ملزمة، سريع وإغلاق الدولة تعطيل قنوات أيون الجهد بوابات، افتتاح المسام، اقتران وحدة). كل هذه العمليات يمكن الوصول إليها الآن لوضع العلامات الفلورسنت. ميزة أخرى هي صغر حجم التحقيق مما يؤدي إلى أقل اضطراب في البروتين. حتى الآن، تم تصميم اثنين من أزواج الحمض الريبي النووي النقال / ترنا سينثيتاس متعامد ل فواس 12 ، 13 ، حيث 3- (6-أسيتيلنافثالين 2-يلامينو) -2-أمينوبروبانويك حمض (أناب) هو فوا الوحيد الذي تم استخدامه في البويضات القيطم 2 ،&quot;كريف&quot;&gt; 8. أناب هو فلوروفور حساسة بيئيا مع الوزن الجزيئي من 272.3 ز / مول وهي أكبر قليلا فقط من التربتوفان 12 ( أرقام 1A، 1B ). نظرا لصغر حجمها، من المرجح أن يتم إدخال عدد أقل من التأثيرات المجسمة بواسطة الفلورفور مقارنة مع الفلوروفوريس التقليدي المرفق عبر رابط (عادة أكثر من 500 جم / مول). وعلاوة على ذلك، في حالة أناب، ويقع فلورفور أقرب إلى العمود الفقري البروتين من تلك المرتبطة سيستينس، وبالتالي، أناب هو البحث عن إعادة ترتيب أكثر محلية. وأخيرا، إزالة السيستين الذاتية في فف التقليدية من أجل ضمان وضع العلامات على الموقع لم يعد شرطا في وا-فف وبالتالي (1) يترك البروتينات في (تقريبا) حالتهم الأصلية و (إي) يسمح فف ليتم تطبيقها لدراسة مجموعة واسعة من البروتينات التي يمكن تغيير وظيفة من خلال استبدال السيستين. <img alt="شكل 1" src = &quot;/ فيليز / ftp_upload / 55598 / 55598fig1.jpg&quot; /&gt; الشكل 1 : أناب و مضان الأطياف. ( A ) التركيب الكيميائي لل أناب. ( B ) طيف الامتصاص تطبيع وأطياف الانبعاثات ل 1 نانومتر أناب، مما يدل على حساسية مضان أناب إلى مسعور المائي. تم الحصول على أطياف الانبعاث مثيرة في 350 نانومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55598/55598fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> العيب من استخدام وارس الفلورسنت هو أن السكان غير المتجانسة من البروتينات قد ينتج عن وقف كودون ريدثرو، إعادة التأهيل متعدية، C- محطة اقتطاع البروتينات أو الحديث المتبادل مع أمينواسيلاتيون الذاتية إذا كان كمية ترناس أمينواسيلاتد نادرة. وينبغي دائما التحقق من هذا التعبير تسرب لفي غياب فوا ورنا الحمض الريبي النووي النقال / الحمض الريبي النووي النقال سينثيتاس الزوج. لقد تناولنا مسألة الانتقالوكيفية تكرارها، وكيفية التحايل عليها من أجل مواقع الإدراج N-ترمينال سابقا 14 . ومع ذلك، عندما فوا، ترنا و ترنا سينثيتاس موجودة في كميات مشبعة، لا يزال هناك احتمال ضئيل للتعبير تسرب. الاختلاف الإجرائي الرئيسي بين فوا-فف و فف التقليدي هو الحقن والتعامل مع البويضات. حقن الحمض الريبي النووي النقال ترنا الحمض الريبي النووي النقال و ترنا سينثيتاس (باناب) يليه إدخال أناب، والتي هي إما شارك في حقن مع مرنا البروتين أو بدلا من ذلك إضافة إلى حل الحضانة كما استر أسيتوكسيميثيل (آم).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="567">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Solutions</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:96px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barth&#39;s solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>90mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td>3mM</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-9397</td>
			<td>0.82mM</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-7902</td>
			<td>0.41mM</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Ca(NO3)2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-1396</td>
			<td>0.33mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>5mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaOH hydrate</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH7225-4</td>
			<td>pH 7.6</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicilin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100U/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100&#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15160054</td>
			<td>10mg/100mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Horse serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16050122</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SOS Standard Oocyte Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>102 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436</td>
			<td>3 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">External recording solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-methyl-D-glucamine (NMDG)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L14282</td>
			<td>115mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239232</td>
			<td>2mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td>pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Internal recording solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-methyl-D-glucamine (NMDG)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L14282</td>
			<td>115mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E478-500</td>
			<td>2mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td>pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Labeling solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250-1</td>
			<td>115mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239232</td>
			<td>2mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td>pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TMR stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMR)</td>
			<td>Molcular Probes by Life Technologies</td>
			<td>T6027</td>
			<td>5mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anap stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">Anap</td>
			<td>ABZENA (TCRS)</td>
			<td>Custom synthesis TCRS-170</td>
			<td style="width:96px;">1mM in nuclease-free water and 1% NaOH 1N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pAnap</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>48696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Performance Oocyte Clamp</td>
			<td>Dagan Corporation</td>
			<td>CA-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gpatch Acquisition software</td>
			<td colspan="3">Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Analysis software</td>
			<td colspan="3">Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Recording Chamber</td>
			<td colspan="2">Custom machined</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Photo diode detection system</td>
			<td>Dagan Corporation</td>
			<td>PhotoMax-200/PIN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electrical shutter driver</td>
			<td>UNIBLITZ</td>
			<td>VCM-D1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

voltage-clamp fluorometry in xenopus oocytes using fluorescent unnatural amino acids

وكان الجهد المشبك فلوروميتري (فف) تقنية الاختيار للتحقيق في هيكل ووظيفة البروتينات الغشاء الإلكتروجيني حيث القياسات في الوقت الحقيقي من مضان والتيارات تقرير في وقت واحد على إعادة ترتيب المحلية والوظيفة العالمية، على التوالي 1 . في حين أن تقنيات عالية الدقة الهيكلية مثل المجهر الإلكتروني البرد أو الأشعة السينية البلورات توفر صور ثابتة للبروتينات من الفائدة، فف يوفر البيانات الهيكلية الديناميكية التي تسمح لنا لربط إعادة الهيكلة الهيكلية (مضان) لبيانات وظيفية ديناميكية (الكهربية). حتى وقت قريب، والكيمياء ثيول رد الفعل المستخدمة في وضع العلامات الموجهة فلورزنت الموقع من البروتينات يقيد نطاق النهج لأنه سيتم وصفها جميع سيستينس الوصول إليها، بما في ذلك الذاتية. وبالتالي كان مطلوبا لبناء البروتينات خالية من السيستين الذاتية. كما تم وضع العلامات على المواقع التي يمكن الوصول إليها من خارج الخليةجانب. هذا تغير مع استخدام الفلورسنت الأحماض الأمينية غير طبيعية (فوا) لدمج على وجه التحديد مسبار الفلورسنت الصغيرة ردا على وقف قمع الكودون باستخدام الحمض الريبي النووي النقال متعامد ورنا الحمض الريبي النووي النقال سينثيتاس 2 . تحسين فف يتطلب فقط إجراء حقن من خطوتين من حقن الحمض النووي (الحمض الريبي النووي النقال / زوج سينثيتاس) تليها الحمض النووي الريبي / فوا شارك في الحقن. الآن، وضع العلامات على كل من الخلايا والمواقع المدفونة ممكن، واستخدام فف توسعت بشكل كبير. وبالتالي فإن تقنية فف تصبح جذابة لدراسة مجموعة واسعة من البروتينات، والأهم من ذلك - يسمح التحقيق في العديد من الآليات التنظيمية عصاري خلوي.

ويبين الشكل 4 مثالا على تسجيلات فف التي تم الحصول عليها من البويضة معربا عن قنوات شاكر مع تعطيل سريع إزالتها (إر)، L382stop-W434F في وجود باناب و أناب. يحول الطفرة W434F تيارات البوتاسيوم الأيونية، مما يجعل من الممكن قياس تشريد تهمة النابضة العابرة (ت...

Watch this Scientific Journal Video about Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids at JoVE.com

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

توضح هذه المقالة تعزيز التقليدية الجهد المشبك فلوروميتري (فف) حيث يتم استخدام الفلورسنت الأحماض الأمينية غير طبيعية (فوا) بدلا من الأصباغ ماليميد، لتحقيق إعادة ترتيب الهيكلي في القنوات الأيونية. ويشمل الإجراء زينوبوس البويضات حقن الحمض النووي، رنا / فوا سوينجكتيون، والقياسات الحالية والضوضاء في وقت واحد.

الجهد المشبك فلوروميتري في<em&gt; القيطم</em&gt; البويضات باستخدام الفلورسنت الأحماض الأمينية غير طبيعية

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

A Polyaniline-based Sensor of Nucleic Acids

والاستشعار القائم بولي آنلين من الأحماض النووية

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies ...

An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

بروتوكول الأمثل لالكهربي التنقل التحول الفحص عن طريق أليغنوكليوتيد] وصفت صبغ الأشعة تحت الحمراء نيون

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

تحديد الأحماض الدهنية في<em&gt; العصوية الشمعية</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

بوليميراز الدنا نشاط الإنزيم استخدام القريبة من الأشعة تحت الحمراء الحمض النووي المسمى الفلورسنت تصور بالتفريد هلام الاكريلاميد

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

إعادة تشكيل ذبذبات دورة الخلية في ميكرومولسيونس مستخرجات البيض خالية من الخلية النمو

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

بنية حل أزرق نيون البروتين باستخدام ميشاندكوليكت

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

تلوين الفضة الفلورسنت من البروتينات في المواد الهلامية Polyacrylamide

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

قياسات الحويصلية واحد للدراسة لضخ البروتون غشاء الإنزيمات تستخدم كهربية ومجهر فلوري

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

تحديد الإفراط في الأحماض الأمينية باستخدام علامات نادرة Codon الغنية

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

توطين البروتينات المعدلة السومو باستخدام السومو الفلورسنت-البروتينات الملائمة

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...