Name: voltage-clamp fluorometry in xenopus oocytes using fluorescent unnatural amino acids
Uploaded: 2017-05-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids at JoVE.com

पैनड डॉ। पीटर स्कुल्ज़ (स्क्रिप्स रिसर्च इंस्टीट्यूट) से एक तरह का उपहार था। यह काम कैनेडियन इंस्टिट्यूट फॉर हेल्थ रिसर्च ग्रांट्स एमओपी-1026 9 9 और एमओपी-1368 9 4 (आरबी) और कैनेडियन फाउंडेशन फॉर इनोवेशन ग्रांट 950-225005 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

मेंढक जोड़तोड़ को कनाडा के दिशानिर्देशों के अनुरूप किया गया था और मॉन्ट्रियल विश्वविद्यालय के नैतिक समिति (सीडीईए, प्रोटोकॉल # 15-042) ने उन्हें मंजूरी दे दी है। 1. एफयूएए निगमन के लिए एमआरएनए तैय...

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	<li>Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+physical+measure+of+conformational+rearrangement+underlying+potassium+channel+gating.">Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating.</a> Science. 271 (5246), 213-216 (1996).</li><li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+internal+pore+opening+in+K(V)+channels+probed+by+a+fluorescent+unnatural+amino+acid.">Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (20), 8272-8277 (2013).</li><li>Xiao, H., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+the+Interface+of+Chemical+and+Biological+Synthesis:+An+Expanded+Genetic+Code.">At the Interface of Chemical and Biological Synthesis: An Expanded Genetic Code.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (9), (2016).</li><li>Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+9.">Chapter 9.</a> Handbook of Ion Channels. , 113-133 (2015).</li><li>Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+probe+in+mammalian+cells.">A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells.</a> J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).</li><li>DeBerg, H. A., Brzovic, P. S., Flynn, G. E., Zagotta, W. N., Stoll, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Energetics+of+Allosteric+Regulation+of+HCN2+Ion+Channels+by+Cyclic+Nucleotides.">Structure and Energetics of Allosteric Regulation of HCN2 Ion Channels by Cyclic Nucleotides.</a> J Biol Chem. 291 (1), 371-381 (2016).</li><li>Shen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoding+unnatural+amino+acids+in+neural+stem+cells+and+optically+reporting+voltage-sensitive+domain+changes+in+differentiated+neurons.">Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons.</a> Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).</li><li>Aman, T. K., Gordon, S. E., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+CNGA1+Channel+Gating+by+Interactions+with+the+Membrane.">Regulation of CNGA1 Channel Gating by Interactions with the Membrane.</a> J Biol Chem. 291 (19), 9939-9947 (2016).</li><li>Haddad, G. A., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mode+shift+of+the+voltage+sensors+in+Shaker+K++channels+is+caused+by+energetic+coupling+to+the+pore+domain.">Mode shift of the voltage sensors in Shaker K+ channels is caused by energetic coupling to the pore domain.</a> J Gen Physiol. 137 (5), 455-472 (2011).</li><li>Batulan, Z., Haddad, G. A., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intersubunit+interaction+between+S4-S5+linker+and+S6+is+responsible+for+the+slow+off-gating+component+in+Shaker+K++channels.">An intersubunit interaction between S4-S5 linker and S6 is responsible for the slow off-gating component in Shaker K+ channels.</a> J Biol Chem. 285 (18), 14005-14019 (2010).</li><li>Kusch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+subunits+cooperate+in+cAMP-induced+activation+of+homotetrameric+HCN2+channels.">How subunits cooperate in cAMP-induced activation of homotetrameric HCN2 channels.</a> Nat Chem Biol. 8 (2), 162-169 (2012).</li><li>Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+incorporation+of+a+small,+environmentally+sensitive,+fluorescent+probe+into+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).</li><li>Summerer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+amino+acid.">A genetically encoded fluorescent amino acid.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).</li><li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reinitiation+at+non-canonical+start+codons+leads+to+leak+expression+when+incorporating+unnatural+amino+acids.">Reinitiation at non-canonical start codons leads to leak expression when incorporating unnatural amino acids.</a> Sci Rep. 5, 11866 (2015).</li><li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+one-step+site-directed+deletion,+insertion,+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol.">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC Biotechnol. 8, 91 (2008).</li><li>Beckert, B., Masquida, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+RNA+by+in+vitro+transcription.">Synthesis of RNA by in vitro transcription.</a> Methods Mol Biol. 703, 29-41 (2011).</li><li>Goldin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+Xenopus+laevis+and+oocyte+injection.">Maintenance of Xenopus laevis and oocyte injection.</a> Methods Enzymol. 207, 266-279 (1992).</li><li>Rudokas, M. W., Varga, Z., Schubert, A. R., Asaro, A. B., Silva, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+oocyte+cut-open+vaseline+gap+voltage-clamp+technique+with+fluorometry.">The Xenopus oocyte cut-open vaseline gap voltage-clamp technique with fluorometry.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li><li>Zhao, J., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolated+voltage+sensing+domain+of+the+Shaker+potassium+channel+forms+a+voltage-gated+cation+channel.">The isolated voltage sensing domain of the Shaker potassium channel forms a voltage-gated cation channel.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Posson, D. J., Ge, P., Miller, C., Bezanilla, F., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+vertical+movement+of+a+K++channel+voltage+sensor+measured+with+luminescence+energy+transfer.">Small vertical movement of a K+ channel voltage sensor measured with luminescence energy transfer.</a> Nature. 436 (7052), 848-851 (2005).</li><li>Chanda, B., Asamoah, O. K., Blunck, R., Roux, B., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+charge+displacement+in+voltage-gated+ion+channels+involves+limited+transmembrane+movement.">Gating charge displacement in voltage-gated ion channels involves limited transmembrane movement.</a> Nature. 436 (7052), 852-856 (2005).</li><li>Taraska, J. W., Puljung, M. C., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-distance+probes+for+protein+backbone+structure+based+on+energy+transfer+between+bimane+and+transition+metal+ions.">Short-distance probes for protein backbone structure based on energy transfer between bimane and transition metal ions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16227-16232 (2009).</li><li>Baker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+sensors+of+membrane+potential.">Genetically encoded fluorescent sensors of membrane potential.</a> Brain Cell Biol. 36 (1-4), 53-67 (2008).</li><li>Miranda, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-dependent+FRET+reports+calcium-+and+voltage-dependent+gating-ring+motions+in+BK+channels.">State-dependent FRET reports calcium- and voltage-dependent gating-ring motions in BK channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).</li><li>Sisido, M., Ninomiya, K., Ohtsuki, T., Hohsaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-base+codon/anticodon+strategy+and+non-enzymatic+aminoacylation+for+protein+engineering+with+non-natural+amino+acids.">Four-base codon/anticodon strategy and non-enzymatic aminoacylation for protein engineering with non-natural amino acids.</a> Methods. 36 (3), 270-278 (2005).</li><li>Hohsaka, T., Ashizuka, Y., Murakami, H., Sisido, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five-base+codons+for+incorporation+of+nonnatural+amino+acids+into+proteins.">Five-base codons for incorporation of nonnatural amino acids into proteins.</a> Nucleic Acids Res. 29 (17), 3646-3651 (2001).</li></ol>

टीआरएनए के सतत अमीनोसेलेशन में, जो सतत टीआरएनए-सिंथेटेस के साथ मिलकर लिखे जा रहे हैं, प्रतिदीप्ति माप के लिए उच्च अभिव्यक्ति के स्तर को प्राप्त करना संभव बनाता है। कुशल एफयूएए निगमन के लिए, यह महत्वपूर...

विभिन्न रासायनिक और भौतिक गुणों के 200 से अधिक अप्राकृतिक अमीनो एसिड आनुवंशिक रूप से ई। कोलाई , खमीर और स्तनधारी कोशिकाओं में प्रोटीन में शामिल किया गया है। ऑर्थोगोनल इंजीनियर टीआरएनए / सिन्थेटेस जोड़ी के माध्यम से एक विशिष्ट स्टॉप कोडन के जवाब में अप्राकृतिक अमीनो एसिड को शामिल किया गया है। प्रोटीन को संशोधित करने के लिए आनुवंशिक दृष्टिकोण ने प्रोटीन संरचना और फ़ंक्शन में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान की है। यहां, हम एक फ्लोरोसेंट UAA के साथ संयोजन में वोल्टेज क्लैंप फ्लोरामिट्री (वीसीएफ) का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। वीसीएफ में, कार्यात्मक डेटा के एक साथ अवलोकन और फ्लोरोसेंट जांच (~ 5 Å) के आसपास स्थानीयकृत संरचनात्मक पुनर्गठन हमें मिलीसेकंड संकल्प 1 के साथ गतिशील सूचना प्राप्त करने की अनुमति देता है। फ्लोरोसेंट जांचें प्रोटीन के स्थानीय आंदोलन पर अपनी शमन स्थिति को बदलती हैं प्रतिदीप्ति में महत्वपूर्ण परिवर्तन के लिए केवल 1-2 Å का एक आंदोलन पर्याप्त होता हैतीव्रता 4 लक्ष्य प्रोटीन में ब्याज की साइट की पहचान के बाद, साइट बिन्दु उत्परिवर्तन द्वारा उत्परिवर्तित हो जाती है। शास्त्रीय रूप से, शेष अवशेष सिस्टीन को बदल दिया गया था, जबकि अब, एम्बर स्टॉप कोडॉन (TAG) आनुवांशिक एफयूएए को शामिल करने के लिए पेश किया गया है। प्रोटीन तब इन विट्रो में लिखित है। जबकि अन्य अभिव्यक्ति प्रणाली ( जैसे, स्तनधारी कोशिकाओं) 5 , 6 , 7 का इस्तेमाल किया जा सकता है, Xenopus oocytes उनके बड़े आकार की वजह से संरचना-समारोह के अध्ययन के लिए बेहतर है, जिससे आसान हेरफेर और उच्च प्रतिदीप्ति तीव्रता (अधिक फ्लोरोफोर्स) और, से-शोर अनुपात इसके अलावा, Xenopus oocytes 2 , 8 , और endogenous प्रोटीन से पृष्ठभूमि कम है पृष्ठभूमि पोल ढाल पर पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के खिलाफ काले रंग pigmentationवह साइटोसोल Xenopus oocytes को शल्यचिकित्सा हटा दिया जाता है और डीएनए एन्कोडिंग ऑर्थोगोनल टीआरएनए / टीआरएनए-सिंथेटेस जोड़ी एफयूएए के लिए विशिष्ट ओकसाइट्स के न्यूक्लियस में इंजेक्शन होता है। 6-24 एच ऊष्मायन समय के बाद, प्रोटीन आरएनए को एफयूएए के साथ सह-इंजेक्ट किया जाता है जो ओओसीइट्स के साइटोसोल में होता है, इसके बाद 2-3 दिनों की ऊष्मायन अवधि होती है। एफयूएएए (फोटोबलीचिंग) को किसी भी क्षति को रोकने के लिए, फ्लोरोफोरे उत्तेजना से बचने के लिए एनाप सहित प्रक्रियाओं को लाल बत्ती के नीचे ले जाना पड़ता है। ओक्साइट्स एक कट-ओकटाइट वोल्टेज-क्लैंप सेटअप पर अध्ययन किया जाता है, जो ईमानदार प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर मुहिम लगाई जाती है, और इलेक्ट्रिकल वर्तमान और प्रतिदीप्ति परिवर्तन एक साथ 9 , 10 दर्ज किए जाते हैं। वैकल्पिक रूप से, दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना 1 या पैच-क्लैम्प कॉन्फ़िगरेशन 11 का उपयोग किया जा सकता है। कम आरएमएस शोर के साथ उपयुक्त तरंग दैर्ध्य द्वारा प्रतिदीप्ति उत्साहित है और<html> उत्सर्जन उच्च प्रवर्धन के साथ एक एम्पलीफायर से जुड़े photodiode का उपयोग कर दर्ज की गई। वोल्टेज क्लैंप फ्लोरोमेट्री में फ्लोरोसेंट अप्राकृतिक अमीनो एसिड (एफयूएए) का उपयोग करने के कई फायदे हैं। एक झिल्ली प्रोटीन के साइटोसोलिक पक्ष तक पहुंच है; कई नियामक प्रक्रियाएं यहां स्थित हैं ( जैसे, सीए 2 + - या न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी साइटें, वोल्टेज-गेट वाले आयन चैनलों के तेज और बंद-राज्य निष्क्रियता, ताकना खोलने, मॉड्यूल युग्मन)। इन सभी प्रक्रियाएं अब फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए सुलभ हैं एक अन्य लाभ प्रोटीन की कम गड़बड़ी के कारण जांच के छोटे आकार का है। अब तक, दो ओर्थोगोनल टीआरएनए / टीआरएनए सिंथेटेस युग्ज के लिए एफयूएएएस का इंजिनियरिंग 12 , 13 है , जहां 3- (6-एसिलीनफथलेन-2-य्लमिनो) -2-एमिनोप्रोप्रोनोइक एसिड (एनाप) एकमात्र एफयूएएए है जिसका उपयोग एक्सनोपस ओक्साइट्स में किया गया है 2 ,&quot;Xref&quot;&gt; 8 एनाप एक पर्यावरणीय रूप से संवेदनशील फ्लोराफोरे है, जिसमें 272.3 ग्राम / एमओएल के आणविक वजन हैं और यह ट्रिप्टोफैन 12 ( आंकड़े 1 ए, 1 बी ) से थोड़ी ही बड़ी है। अपने छोटे आकार के कारण, लिंकर (आमतौर पर 500 ग्राम / मॉल से अधिक) के माध्यम से जुड़ा हुआ पारंपरिक फ्लोरोफोर्स की तुलना में फ्लोरोफोरे द्वारा कम कार्बनिक प्रभाव लाया जा सकता है। इसके अलावा, अनप के मामले में, फ्लोरायोफोरे सिस्टीन से जुड़े लोगों की तुलना में प्रोटीन रीबोन के करीब स्थित है, और इसके परिणामस्वरूप, अनप अधिक स्थानीयकृत पुनर्व्यवस्था की जांच कर रहा है। अंत में, परंपरागत वीसीएफ में अंतर्जात cysteines को हटाने के लिए साइट-विशिष्ट लेबलिंग सुनिश्चित करने के लिए अब UAA-VCF में एक आवश्यकता नहीं है और इसलिए (i) प्रोटीन को छोड़कर (लगभग) अपने मूल राज्य में छोड़ देता है और (ii) वीसीएफ को लागू करने की अनुमति देता है एक व्यापक श्रेणी के प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए जिसमें फ़ंक्शन सिस्टीन प्रतिस्थापन द्वारा बदल सकता है <img alt="आकृति 1" srC = &quot;/ files / ftp_upload / 55598 / 55598fig1.jpg&quot; /&gt; चित्रा 1 : Anap और प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा ( ए ) अनाप के रासायनिक संरचना ( बी ) 1 एनएम अनाप के लिए सामान्य अवशोषण स्पेक्ट्रम और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा, एनाप प्रतिदीप्ति की संवेदनशीलता को विलायक हाइड्रोफॉबिसिटी के लिए प्रदर्शित करते हुए। उत्सर्जन स्पेक्ट्रा 350 एनएम पर रोमांचक द्वारा प्राप्त किए गए थे। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55598/55598fig1large.jpg" target="_blank">इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें</a> फ्लोरोसेंट UAA का उपयोग करने के एक नुकसान यह है कि प्रोटीन की एक विषम जनसंख्या रोक codon readthrough, translational reinitiation, सी टर्मिनल truncated प्रोटीन या endogenous aminoacylation के साथ crosstalk से हो सकता है अगर aminoacedlated tRNAs की मात्रा दुर्लभ है इस तरह के रिसाव की अभिव्यक्ति की जांच हमेशा के लिए की जानी चाहिए क्योंकि एफयूएए और टीआरएनए / टीआरएनए सिंथेटेस जोड़ी के अभाव में। हमने ट्रांस के मुद्दे को संबोधित कियालैंसल रिनीनीशन और एन-टर्मिनल सम्मिलन साइटों के लिए पहले से 14 के लिए इसे कैसे निरोधक करना हालांकि, जब एफयूएए, टीआरएनए और टीआरएनए सिंथेटेस संतृप्त मात्रा में मौजूद हैं, तो केवल रिसाव अभिव्यक्ति की कम संभावना बनी हुई है। एफयूएए-वीसीएफ और परंपरागत वीसीएफ के बीच प्रमुख प्रक्रियात्मक अंतर ओक्साइट्स का इंजेक्शन और हैंडलिंग है; डीएनए एन्कोडिंग डीएनए एन्कोडिंग टीआरएनए और टीआरएनए सिन्थेटेस (पीएएनएपी) को एनाप की शुरूआत के बाद किया जाता है, जो प्रोटीन एमआरएनए के साथ सह-इंजेक्ट होता है या वैकल्पिक रूप से एटेटोक्सीमाइथाइल (एएम) एस्टर के रूप में ऊष्मायन समाधान में जोड़ा जाता है।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="567">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Solutions</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:96px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barth&#39;s solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>90mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td>3mM</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-9397</td>
			<td>0.82mM</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-7902</td>
			<td>0.41mM</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Ca(NO3)2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-1396</td>
			<td>0.33mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>5mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaOH hydrate</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH7225-4</td>
			<td>pH 7.6</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicilin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100U/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100&#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15160054</td>
			<td>10mg/100mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Horse serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16050122</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SOS Standard Oocyte Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>102 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436</td>
			<td>3 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">External recording solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-methyl-D-glucamine (NMDG)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L14282</td>
			<td>115mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239232</td>
			<td>2mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td>pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Internal recording solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-methyl-D-glucamine (NMDG)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L14282</td>
			<td>115mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E478-500</td>
			<td>2mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td>pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Labeling solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250-1</td>
			<td>115mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239232</td>
			<td>2mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td>pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TMR stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMR)</td>
			<td>Molcular Probes by Life Technologies</td>
			<td>T6027</td>
			<td>5mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anap stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">Anap</td>
			<td>ABZENA (TCRS)</td>
			<td>Custom synthesis TCRS-170</td>
			<td style="width:96px;">1mM in nuclease-free water and 1% NaOH 1N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pAnap</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>48696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Performance Oocyte Clamp</td>
			<td>Dagan Corporation</td>
			<td>CA-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gpatch Acquisition software</td>
			<td colspan="3">Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Analysis software</td>
			<td colspan="3">Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Recording Chamber</td>
			<td colspan="2">Custom machined</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Photo diode detection system</td>
			<td>Dagan Corporation</td>
			<td>PhotoMax-200/PIN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electrical shutter driver</td>
			<td>UNIBLITZ</td>
			<td>VCM-D1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

voltage-clamp fluorometry in xenopus oocytes using fluorescent unnatural amino acids

वोल्टेज क्लैंप फ्लोरोमेट्री (वीसीएफ) electrogenic झिल्ली प्रोटीन की संरचना और कार्य की जांच करने के लिए पसंद की तकनीक है, जहां प्रतिदीप्ति और धाराओं की वास्तविक समय माप क्रमशः स्थानीय पुनर्संयोजन और वैश्विक समारोह पर रिपोर्ट करता है। जबकि क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी या एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफ़ी जैसे उच्च-रिज़ॉल्यूशन की संरचनात्मक तकनीकें, ब्याज की प्रोटीन की स्थिर छवि प्रदान करती हैं, वीसीएफ गतिशील संरचनात्मक डेटा प्रदान करती है जो हमें संरचनात्मक पुनर्गठन (प्रतिदीप्ति) को गतिशील कार्यात्मक डेटा (इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी) से जोड़ने की अनुमति देता है। अभी तक तक, प्रोटीनों की साइट-निर्देशित फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले थियोल-रिएक्टिव केमिस्ट्री ने दृष्टिकोण के दायरे को प्रतिबंधित कर दिया क्योंकि अंतर्जात लोगों सहित सभी सुलभ सिस्टीन को लेबल किया जाएगा। इस प्रकार प्रोटीन अंतर्जात cysteines से मुक्त बनाने के लिए आवश्यक था लेबलिंग को बाह्य से जुड़े स्थलों तक भी प्रतिबंधित किया गया थापक्ष। यह ऑर्थोगोनल टीआरएनए और टीआरएनए सिंथेटेस जोड़ी 2 का उपयोग कर कोडन दमन रोकने के लिए विशेष रूप से एक छोटे फ्लोरोसेंट जांच को शामिल करने के लिए फ्लोरोसेंट अनैसर्गिक एमिनो एसिड (एफयूएए) के प्रयोग से बदल गया। वीसीएफ सुधार में डीएनए इंजेक्शन (टीआरएनए / सिंटेटसे जोड़ी) की दो-चरणीय इंजेक्शन प्रक्रिया की आवश्यकता होती है, जिसके बाद आरएनए / एफयूएए सह-इंजेक्शन होता है। अब, दोनों intracellular और दफन साइटों लेबलिंग संभव है, और वीसीएफ के उपयोग में काफी विस्तार किया गया है वीसीएफ तकनीक इस प्रकार प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए आकर्षक हो जाती है और अधिक महत्वपूर्ण बात - कई साइटोस्लिक नियामक तंत्र की जांच करने की अनुमति देता है।

चित्रा 4 चित्रा 4 में पीएनेप और अनाप की उपस्थिति में तेजी से निष्क्रियता हटाए गए (आईआर), एल -382 स्टेप-डब्लू 434 एफ के साथ एक ओओसीटा व्यक्त शकर चैनलों से प्राप्त वीसीएफ रिकॉर्डिंग का एक उदाह?...

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Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

यह आलेख पारंपरिक वोल्ट क्लैंप फ्लोरेट्रेट्री (वीसीएफ) की वृद्धि का वर्णन करता है जहां आयन चैनलों में संरचनात्मक पुनर्गठन की जांच के लिए फ्लोरोसेंट अप्राकृतिक एमिनो एसिड (एफयूएए) का प्रयोग नरमीइड रंगों के बजाय किया जाता है। इस प्रक्रिया में Xenopus oocyte डीएनए इंजेक्शन, आरएनए / एफयूएए सिक्का, और एक साथ वर्तमान और प्रतिदीप्ति माप शामिल हैं।

वोल्टेज क्लैंप फ्लोराइट्री में<em&gt; Xenopus</em&gt; फ्लोरोसेंट अस्वास्थ्यकर एमिनो एसिड का प्रयोग करने वाले ओक्साइट्स

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

A Polyaniline-based Sensor of Nucleic Acids

न्यूक्लिक एसिड की एक polyaniline आधारित सेंसर

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies ...

An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Electrophoretic गतिशीलता शिफ्ट परख इन्फ्रारेड फ्लोरोसेंट रंजक लेबल oligonucleotides उपयोग करने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

में फैटी एसिड की पहचान<em&gt; बेसिलस cereus</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

डीएनए पोलीमरेज़ गतिविधि परख का उपयोग कर के पास अवरक्त फ्लोरोसेंट लेबल डीएनए visualized द्वारा Acrylamide जेल ट्रो

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

सेल-प्रकोष्ठ के Microemulsions में चक्र दोलनों का पुनर्गठन-मुक्त Xenopus Egg अर्क

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

MeshAndCollect का उपयोग कर फ्लोरोसेंट प्रोटीन सेरुलियन की संरचना समाधान

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Polyacrylamide जैल में फ्लोरोसेंट चांदी के प्रोटीन के धुंधला

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

इलेक्ट्रोकैमिस्ट्री और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्रोटॉन-पंप झिल्ली एंजाइमों के अध्ययन के लिए एकल liposome मापन

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

दुर्लभ-कोडोन-रिच मार्करों का उपयोग कर एमिनो एसिड ओवरप्रोड्यूसर की पहचान करना

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

सुमो का स्थानीयकरण-संशोधित फ्लोरोसेंट सूमो-फँसाने प्रोटीन का उपयोग कर प्रोटीन

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...