Name: voltage-clamp fluorometry in xenopus oocytes using fluorescent unnatural amino acids
Uploaded: 2017-05-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids at JoVE.com

pAnap은 Peter Schultz 박사 (Scripps Research Institute)의 친절한 선물이었습니다. 이 연구는 보건 연구 보조금 MOP-102689 및 MOP-136894 (RB에 대한) 및 캐나다 재단 혁신 기금 950-225005에 의해 자금 지원되었습니다.

개구리 조작은 캐나다 지침에 따라 수행되었으며 몬트리올 대학의 윤리위원회 (CDEA, 프로토콜 # 15-042)의 승인을 받았습니다. 1. fUAA 설립을위한 mRNA 준비 <ol><li> 구조 변화가 발생할 것으로 예상되는 단백질의 관심 사이트를 선택하십시오. 이 지역의 아미노산을 선택하여 fUAA로 대체하십시오. 참고 : 위치 선택은 예상되는 구조적 재 배열을 기반으로합니다. 고해상도 구?...

<ol>
	<li>Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+physical+measure+of+conformational+rearrangement+underlying+potassium+channel+gating.">Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating.</a> Science. 271 (5246), 213-216 (1996).</li><li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+internal+pore+opening+in+K(V)+channels+probed+by+a+fluorescent+unnatural+amino+acid.">Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (20), 8272-8277 (2013).</li><li>Xiao, H., Schultz, P. 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tRNA 합성 효소와 함께 연속적으로 전사되는 tRNA의 생체 내 aminoacylation은 형광 측정을위한 높은 발현 수준을 얻는 것을 가능하게합니다. 효율적인 fUAA 도입을 위해서는 pAnap이 핵에 정확하게 주입되는 것이 중요합니다. 핵의 정확한 위치에 대한 불확실성 때문에 DNA 주입의 10-40 %가 실패 할 것으로 예상되어 비 - 발현 (또는 누출 - 발현) 난 모세포가 발생합니다. 그러므로 Anap과 pAnap가없는 경우...

다양한 화학적 및 물리적 특성을 지닌 200 개가 넘는 비 천연 아미노산이 대장균 , 효모 및 포유 동물 세포에서 단백질로 유 전적으로 도입되었습니다 3 . 비 천연 아미노산은 직교 조작 된 tRNA / 신테 타제 쌍을 통해 특정 종결 코돈에 반응하여 도입된다. 단백질을 수정하는 유전자 접근법은 단백질 구조와 기능에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 여기서는 형광 UAA와 함께 전압 - 클램프 형광 측정 (VCF)을 사용하기위한 프로토콜을 제시합니다. VCF에서 형광 프로브 주위에 위치하는 기능적 데이터와 구조적 재구성을 동시에 관찰하면 밀리 초 분해능 1의 동적 정보를 얻을 수 있습니다. 형광 프로브는 단백질의 국부적 인 움직임에 따라 급냉 상태를 변경합니다. 단지 1-2Å의 움직임만으로도 형광의 현저한 변화를 유도 할 수 있습니다강도 4 . 표적 단백질에서 관심 부위의 동정 후, 부위는 점 돌연변이에 의해 돌연변이된다. 고전적으로, 잔기는 시스테인으로 돌연변이되었지만, 지금은 황색 정지 코돈 (TAG)이 유전 fUAA 도입을 위해 도입되었다. 그 단백질은 시험 관내에서 전사된다. 다른 발현 시스템 ( 예 : 포유 동물 세포) 5 , 6 , 7 , Xenopus의 난 모세포는 구조 기능 연구에 더 큰 크기 때문에 더 쉽게 조작하고 높은 형광 강도 (더 fluorophores)로 이어질 수 있으므로, 노이즈 비율. 또한, Xenopus 난 모세포는 내인성 단백질 2 , 8 의 배경이 낮고 동물의 극 보호막에 어두운 색소가있어 t그는 세포질이다. Xenopus 난 모세포를 외과 적으로 제거하고 fUAA에 특이적인 직교 tRNA / tRNA 합성 효소 쌍을 암호화하는 DNA를 난 모세포의 핵으로 주입한다. 6-24 시간의 배양 시간 후, 단백질 RNA를 fUAA와 함께 난 모세포의 세포질에 주입하고 2-3 일간 배양한다. fUAA (photobleaching)의 손상을 방지하기 위해 적색광 하에서 형광체 여기를 피하기 위해 Anap을 포함한 절차를 수행해야합니다. 난 모세포는 직립 형광 현미경에 장착 된 컷 오픈 oocyte 전압 클램프 설정에서 연구하고, 전류와 형광 변화는 동시에 9 , 10 기록됩니다. 대안으로, 2- 전극 전압 클램프 ( 1) 또는 패치 - 클램프 구성 (11) 이 사용될 수있다. 형광은 낮은 RMS 잡음을 갖는 적절한 파장에 의해 여기되고<html> 높은 증폭을 갖는 증폭기에 연결된 포토 다이오드를 사용하여 기록 된 방사. 전압 클램프 형광 측정법에 형광 비 천연 아미노산 (fUAAs)을 사용하면 몇 가지 장점이 있습니다. 하나는 막 단백질의 세포질 측에 대한 접근이다. 많은 조절 과정이 여기에 있습니다 ( 예 : Ca 2+ 또는 뉴클레오타이드 결합 부위, 전압 게이 티드 이온 채널의 빠른 및 폐쇄 상태 불 활성화, 기공 개방, 모듈 커플 링). 이 모든 공정에 형광 물질 표시가 가능합니다. 또 다른 이점은 작은 크기의 탐침으로 단백질의 방해가 적다는 것입니다. 지금까지, fUAA를위한 두 개의 직교 tRNA / tRNA 합성 효소 쌍이 조작 된 12 , 13 , 3- (6- 아세틸 나프탈렌 -2- 일 아미노) -2- 아미노 프로판 산 (Anap)은 Xenopus 난 모세포에서 사용 된 유일한 fUAA이다 도 2에 도시 된 바와 같이 ,&quot;xref&quot;&gt; 8. Anap은 272.3 g / mol의 분자량을 지닌 환경 적으로 민감한 형광 단이며 트립토판 12 보다 약간 크다 ( 그림 1A, 1B ). 크기가 작기 때문에 링커 (일반적으로 500 g / mol 이상)를 통해 부착 된 기존 형광체와 비교하여 형광체가 입체 효과를 거의 일으키지 않습니다. 또한, Anap의 경우, 형광체는 시스테인에 연결된 것보다 단백질 백본에 더 가까이 위치하므로 결과적으로 Anap은 더 국부적 인 재배치를 탐색합니다. 마지막으로, UAA-VCF에서 부위 특이 적 표지를 보장하기 위해 기존의 VCF에서 내인성 시스테인을 제거함으로써 (i) 단백질을 (거의) 본래의 상태로두고 (ii) VCF를 적용 할 수있게한다 기능이 시스테인 치환에 의해 변경 될 수있는 더 넓은 범위의 단백질을 연구한다. <img alt="그림 1" src = &quot;/ files / ftp_upload / 55598 / 55598fig1.jpg&quot;/&gt; 그림 1 : Anap and Fluorescence Spectra. ( A ) Anap의 화학 구조. ( B ) 1nM 아나프에 대한 표준화 된 흡수 스펙트럼 및 방출 스펙트럼, 아나 프 형광의 용매 소수성에 대한 민감성을 입증 함. 방출 스펙트럼은 350 nm에서 여기하여 얻은 것이다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55598/55598fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 형광 UAA의 단점은 aminoacylated tRNA의 양이 부족하면 stop codon readthrough, translational reinitiation, C-terminal truncated proteins 또는 내인성 aminoacylation과의 crosstalk로 인해 단백질의 이종 집단이 생길 수 있다는 것입니다. 이러한 누출 발현은 fUAA와 tRNA / tRNA 합성 효소 쌍이없는 경우 항상 검사해야합니다. 우리는 트랜스의 문제를 다루었습니다.이전에 N 말단 삽입 부위에 대해 이성적 재발 및 그것을 막는 방법 14 . 그러나, fUAA, tRNA 및 tRNA 합성 효소가 포화 된 양으로 존재할 때, 누출 발현 가능성은 낮다. fUAA-VCF와 재래식 VCF의 주요 절차상의 차이점은 난 모세포의 주입과 취급이다. tRNA 및 tRNA 합성 효소 (pAnap)를 코딩하는 DNA의 주입 후에 단백질 mRNA와 함께 주입되거나 양자 택일로 아세 톡시 메틸 (AM) 에스테르로서 배양 용액에 첨가되는 아나 (Anap)의 도입이 뒤 따른다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="567">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Solutions</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:96px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barth&#39;s solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>90mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td>3mM</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-9397</td>
			<td>0.82mM</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-7902</td>
			<td>0.41mM</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Ca(NO3)2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-1396</td>
			<td>0.33mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>5mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaOH hydrate</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH7225-4</td>
			<td>pH 7.6</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicilin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100U/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100&#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15160054</td>
			<td>10mg/100mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Horse serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16050122</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SOS Standard Oocyte Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>102 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436</td>
			<td>3 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">External recording solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-methyl-D-glucamine (NMDG)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L14282</td>
			<td>115mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239232</td>
			<td>2mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td>pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Internal recording solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-methyl-D-glucamine (NMDG)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L14282</td>
			<td>115mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E478-500</td>
			<td>2mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td>pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Labeling solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250-1</td>
			<td>115mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239232</td>
			<td>2mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td>pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TMR stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMR)</td>
			<td>Molcular Probes by Life Technologies</td>
			<td>T6027</td>
			<td>5mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anap stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">Anap</td>
			<td>ABZENA (TCRS)</td>
			<td>Custom synthesis TCRS-170</td>
			<td style="width:96px;">1mM in nuclease-free water and 1% NaOH 1N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pAnap</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>48696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Performance Oocyte Clamp</td>
			<td>Dagan Corporation</td>
			<td>CA-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gpatch Acquisition software</td>
			<td colspan="3">Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Analysis software</td>
			<td colspan="3">Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Recording Chamber</td>
			<td colspan="2">Custom machined</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Photo diode detection system</td>
			<td>Dagan Corporation</td>
			<td>PhotoMax-200/PIN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electrical shutter driver</td>
			<td>UNIBLITZ</td>
			<td>VCM-D1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

voltage-clamp fluorometry in xenopus oocytes using fluorescent unnatural amino acids

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF)는 형광 및 전류의 실시간 측정이 국소 재배치 및 전지구 기능에 대해 동시에보고하는 전자 제 멤브레인 단백질의 구조 및 기능을 조사하기위한 기술이었습니다 1 . 저온 전자 현미경 또는 X 선 결정학과 같은 고해상도 구조 기술은 관심있는 단백질의 정적 이미지를 제공하지만 VCF는 구조적 재배치 (형광)를 동적 기능 데이터 (전기 생리학)에 연결할 수있는 동적 구조 데이터를 제공합니다. 최근까지 내재적 인 시스테인을 포함하여 접근 가능한 모든 시스테인이 분류 될 것이기 때문에 단백질의 부위 지시 형광 표지에 사용 된 티올 반응 화학은 접근법의 범위를 제한했다. 따라서 내인성 시스테인이없는 단백질을 만들어야했습니다. 표지는 또한 세포 외로부터 접근 가능한 사이트로 제한되었다측면. 이것은 직각 tRNA 및 tRNA 합성 효소 쌍을 사용하여 정지 코돈 억제에 대한 반응으로 작은 형광성 프로브를 구체적으로 통합하기 위해 형광 비 자연 아미노산 ( Fluorescent Unnatural Amino Acids , fUAA)을 사용하여 변경되었습니다. VCF 개선은 DNA 주입 (tRNA / synthetase 쌍)의 2 단계 주입 절차와 RNA / fUAA 동시 주입을 필요로합니다. 이제 세포 내 및 묻힌 부위 모두에 라벨을 붙일 수 있으며 VCF의 사용이 크게 늘어났습니다. VCF 기술은 광범위한 단백질 연구에 매력적이며, 더 중요한 것은 많은 세포질 조절 메커니즘을 연구 할 수 있다는 것입니다.

그림 4 는 pAnap과 Anap 존재 하에서 빠른 불활 화 제거 (IR), L382stop-W434F가있는 쉐이커 채널을 표현하는 난 모세포에서 얻은 VCF 기록의 예를 보여줍니다. W434F 돌연변이는 일시적인 게이팅 전하 이동 (게이팅 전류)을 측정 할 수있는 이온 칼륨 전류를 차단합니다. 감극시 게이팅 전류 (상부 트레이스)와 Anap 형광 강도 변화 (하부 트레이스)의 동시 기록은 Anap을 L382 ?...

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Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

이 기사에서는 이온 채널에서 구조적 재배치를 조사하기 위해 말레이 미드 염료 대신 형광 비정상적인 아미노산 (fUAA)이 사용되는 기존의 VCF (Voltage-Clamp Fluorometry)의 향상에 대해 설명합니다. 이 절차에는 Xenopus oocyte DNA 주입, RNA / fUAA 동시 주입, 동시 전류 및 형광 측정이 포함됩니다.

전압 클램프 형광 측정법<em&gt; Xenopus</em&gt; 형광성 비 자연 아미노산을 이용한 난 모세포

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

A Polyaniline-based Sensor of Nucleic Acids

핵산 폴리아닐린 계 센서

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies ...

연구

생화학

An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

적외선 형광 염료로 표지 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 전기 영동 이동성 시프트 분석을위한 최적화 된 프로토콜

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

지방산의 확인 시험<em&gt; 바실러스 세레 우스</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

근 적외선 형광 레이블이 DNA 아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법으로 시각을 사용 하 여 DNA 중 합 효소 활동 분석 결과

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Microemulsions 셀 무료 Xenopus 달걀 추출 물에서 세포 주기 진동의 재구성

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

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X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

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Polyacrylamide 젤에 단백질의 형광은 얼룩

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

전기 화학 및 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 양성자 펌프 막 효소의 연구에 대 한 단일 Liposome 측정

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

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희귀 코돈이 풍부한 마커를 사용하여 아미노산 과잉 생산자 식별

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

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스모를 이용한 스모 변성 단백질의 국 소화-단백질 포착

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...