Name: voltage-clamp fluorometry in xenopus oocytes using fluorescent unnatural amino acids
Uploaded: 2017-05-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids at JoVE.com

PAnap var en god gave fra Dr. Peter Schultz (Scripps Research Institute). Dette arbeidet ble finansiert av de kanadiske instituttene for helseforskningsstipend MOP-102689 og MOP-136894 (til RB) og Canadian Foundation for Innovation Grant 950-225005.

Froskmanipulasjoner ble utført i samsvar med de kanadiske retningslinjene og er godkjent av etikkutvalget (CDEA, protokoll # 15-042) ved Universitetet i Montréal. 1. mRNA-fremstilling for fUAA-inkorporering <ol><li> Velg et område av interesse for proteinet der konformasjonsendringer forventes å forekomme. Velg en aminosyre i denne regionen som skal erstattes av fUAA. MERK: Valg av posisjon er basert på de strukturelle omleggingene som forventes. Hvis en høyoppløsningsstruktu...

<ol>
	<li>Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+physical+measure+of+conformational+rearrangement+underlying+potassium+channel+gating.">Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating.</a> Science. 271 (5246), 213-216 (1996).</li><li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+internal+pore+opening+in+K(V)+channels+probed+by+a+fluorescent+unnatural+amino+acid.">Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (20), 8272-8277 (2013).</li><li>Xiao, H., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+the+Interface+of+Chemical+and+Biological+Synthesis:+An+Expanded+Genetic+Code.">At the Interface of Chemical and Biological Synthesis: An Expanded Genetic Code.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (9), (2016).</li><li>Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+9.">Chapter 9.</a> Handbook of Ion Channels. , 113-133 (2015).</li><li>Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+probe+in+mammalian+cells.">A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells.</a> J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).</li><li>DeBerg, H. A., Brzovic, P. S., Flynn, G. E., Zagotta, W. N., Stoll, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Energetics+of+Allosteric+Regulation+of+HCN2+Ion+Channels+by+Cyclic+Nucleotides.">Structure and Energetics of Allosteric Regulation of HCN2 Ion Channels by Cyclic Nucleotides.</a> J Biol Chem. 291 (1), 371-381 (2016).</li><li>Shen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoding+unnatural+amino+acids+in+neural+stem+cells+and+optically+reporting+voltage-sensitive+domain+changes+in+differentiated+neurons.">Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons.</a> Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).</li><li>Aman, T. K., Gordon, S. E., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+CNGA1+Channel+Gating+by+Interactions+with+the+Membrane.">Regulation of CNGA1 Channel Gating by Interactions with the Membrane.</a> J Biol Chem. 291 (19), 9939-9947 (2016).</li><li>Haddad, G. A., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mode+shift+of+the+voltage+sensors+in+Shaker+K++channels+is+caused+by+energetic+coupling+to+the+pore+domain.">Mode shift of the voltage sensors in Shaker K+ channels is caused by energetic coupling to the pore domain.</a> J Gen Physiol. 137 (5), 455-472 (2011).</li><li>Batulan, Z., Haddad, G. A., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intersubunit+interaction+between+S4-S5+linker+and+S6+is+responsible+for+the+slow+off-gating+component+in+Shaker+K++channels.">An intersubunit interaction between S4-S5 linker and S6 is responsible for the slow off-gating component in Shaker K+ channels.</a> J Biol Chem. 285 (18), 14005-14019 (2010).</li><li>Kusch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+subunits+cooperate+in+cAMP-induced+activation+of+homotetrameric+HCN2+channels.">How subunits cooperate in cAMP-induced activation of homotetrameric HCN2 channels.</a> Nat Chem Biol. 8 (2), 162-169 (2012).</li><li>Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+incorporation+of+a+small,+environmentally+sensitive,+fluorescent+probe+into+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).</li><li>Summerer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+amino+acid.">A genetically encoded fluorescent amino acid.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).</li><li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reinitiation+at+non-canonical+start+codons+leads+to+leak+expression+when+incorporating+unnatural+amino+acids.">Reinitiation at non-canonical start codons leads to leak expression when incorporating unnatural amino acids.</a> Sci Rep. 5, 11866 (2015).</li><li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+one-step+site-directed+deletion,+insertion,+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol.">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC Biotechnol. 8, 91 (2008).</li><li>Beckert, B., Masquida, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+RNA+by+in+vitro+transcription.">Synthesis of RNA by in vitro transcription.</a> Methods Mol Biol. 703, 29-41 (2011).</li><li>Goldin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+Xenopus+laevis+and+oocyte+injection.">Maintenance of Xenopus laevis and oocyte injection.</a> Methods Enzymol. 207, 266-279 (1992).</li><li>Rudokas, M. W., Varga, Z., Schubert, A. R., Asaro, A. B., Silva, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+oocyte+cut-open+vaseline+gap+voltage-clamp+technique+with+fluorometry.">The Xenopus oocyte cut-open vaseline gap voltage-clamp technique with fluorometry.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li><li>Zhao, J., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolated+voltage+sensing+domain+of+the+Shaker+potassium+channel+forms+a+voltage-gated+cation+channel.">The isolated voltage sensing domain of the Shaker potassium channel forms a voltage-gated cation channel.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Posson, D. J., Ge, P., Miller, C., Bezanilla, F., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+vertical+movement+of+a+K++channel+voltage+sensor+measured+with+luminescence+energy+transfer.">Small vertical movement of a K+ channel voltage sensor measured with luminescence energy transfer.</a> Nature. 436 (7052), 848-851 (2005).</li><li>Chanda, B., Asamoah, O. K., Blunck, R., Roux, B., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+charge+displacement+in+voltage-gated+ion+channels+involves+limited+transmembrane+movement.">Gating charge displacement in voltage-gated ion channels involves limited transmembrane movement.</a> Nature. 436 (7052), 852-856 (2005).</li><li>Taraska, J. W., Puljung, M. C., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-distance+probes+for+protein+backbone+structure+based+on+energy+transfer+between+bimane+and+transition+metal+ions.">Short-distance probes for protein backbone structure based on energy transfer between bimane and transition metal ions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16227-16232 (2009).</li><li>Baker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+sensors+of+membrane+potential.">Genetically encoded fluorescent sensors of membrane potential.</a> Brain Cell Biol. 36 (1-4), 53-67 (2008).</li><li>Miranda, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-dependent+FRET+reports+calcium-+and+voltage-dependent+gating-ring+motions+in+BK+channels.">State-dependent FRET reports calcium- and voltage-dependent gating-ring motions in BK channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).</li><li>Sisido, M., Ninomiya, K., Ohtsuki, T., Hohsaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-base+codon/anticodon+strategy+and+non-enzymatic+aminoacylation+for+protein+engineering+with+non-natural+amino+acids.">Four-base codon/anticodon strategy and non-enzymatic aminoacylation for protein engineering with non-natural amino acids.</a> Methods. 36 (3), 270-278 (2005).</li><li>Hohsaka, T., Ashizuka, Y., Murakami, H., Sisido, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five-base+codons+for+incorporation+of+nonnatural+amino+acids+into+proteins.">Five-base codons for incorporation of nonnatural amino acids into proteins.</a> Nucleic Acids Res. 29 (17), 3646-3651 (2001).</li></ol>

In vivo aminoacyleringen av tRNA som kontinuerlig blir transkribert sammen med tRNA-syntetasen, gjør det mulig å oppnå høye ekspresjonsnivåer for fluorescensmålinger. For effektiv fUAA-inkorporering er det kritisk at pAnap er riktig injisert i kjernen. På grunn av usikkerheten om den nøyaktige plasseringen av kjernen, forventes 10-40% av DNA-injeksjonene å mislykkes, noe som resulterer i ikke-uttrykkende (eller lekkasje-uttrykkende) oocytter. Derfor er det viktig å kontrollere uttrykk i fravær av Ana...

Over 200 unaturlige aminosyrer av forskjellige kjemiske og fysiske egenskaper er blitt genetisk inkorporert i proteiner i E. coli , gjær og pattedyrceller 3 . Den unaturlige aminosyren er inkorporert som respons på et spesifikt stoppkodon via et ortogonalt konstruert tRNA / syntetasepar. Den genetiske tilnærmingen til å modifisere proteiner har gitt verdifull innsikt i proteinstruktur og funksjon. Her presenterer vi en protokoll for bruk av Spenning-Clamp Fluorometry (VCF) i kombinasjon med et fluorescerende UAA. I VCF gir samtidig observasjon av funksjonelle data og strukturelle omarrangementer lokalisert rundt den fluorescerende sonden (~ 5 Å) oss mulighet til å oppnå dynamisk informasjon med millisekundoppløsning 1 . De fluorescerende prober endrer deres slokkingstilstand ved lokalisert bevegelse av proteinet. En bevegelse på kun 1-2 Å er tilstrekkelig til å føre til signifikante endringer i fluorescensenIntensitet 4 . Etter identifisering av stedet av interesse i målproteinet, blir stedet mutert ved punktmutasjon. Klassisk hadde resten blitt mutert til et cystein, mens nå er det innført en ravstoppkodon (TAG) for genetisk fUAA-inkorporering. Proteinet blir deretter in vitro transkribert. Mens andre ekspresjonssystemer ( f.eks. Pattedyrceller) kan brukes 5 , 6 , 7 , foretrekkes Xenopus- oocytter for strukturfunksjonsstudier på grunn av deres større størrelse, hvilket fører til enklere manipulasjon og høyere fluorescensintensitet (mer fluoroforer) Støyforhold. Videre har Xenopus- oocytter lav bakgrunn fra endogene proteiner 2 , 8 og den mørke pigmenteringen på dyrepolskjermene mot bakgrunnsfluorescens fra tHan cytosol. Xenopus- oocytene fjernes kirurgisk, og DNA som koder for det ortogonale tRNA / tRNA-syntetaseparet som er spesifikt for fUAA, injiseres i kjernen til oocytene. Etter en 6-24 h inkubasjonstid, injiseres protein RNA med fUAA i cytosol av oocytene, etterfulgt av en inkubasjonsperiode på 2-3 dager. For å forhindre skade på fUAA (fotoblekking), må prosedyrene inkludert Anap utføres under rødt lys for å unngå fluoroforspenning. Oocytter studeres på et åpent oocyt spenningsklemmeoppsett, som er montert på et oppreist fluorescensmikroskop, og elektriske strøm- og fluorescensendringer registreres samtidig 9 , 10 . Alternativt kan toelektrodspenningsklemme 1 eller patch-clamp konfigurasjoner 11 brukes. Fluorescens er begeistret av passende bølgelengder med lav RMS-støy og<html> Utslipp innspilt ved bruk av en fotodiode koblet til en forsterker med høy amplifikasjon. Det er flere fordeler med å bruke fluorescerende unaturlige aminosyrer (fUAAer) i spenningsklemmefluorometri. Den ene er tilgang til den cytosoliske siden av membranproteinene; Mange regulatoriske prosesser er plassert her ( f.eks. Ca 2+ - eller nukleotidbindingssteder, hurtig og lukket tilstandsinaktivering av spenningsgatede ionkanaler, poreåpning, modulkobling). Alle disse prosessene er nå tilgjengelige for fluorescensmerking. En annen fordel er den lille størrelsen på sonden som fører til mindre forstyrrelse av proteinet. Så langt har to ortogonale tRNA / tRNA syntetasepar for fUAAer blitt konstruert 12 , 13 , hvor 3- (6-acetylnaftalen-2-ylamino) -2-aminopropansyre (Anap) er den eneste fUAA som har blitt brukt i Xenopus oocytter 2 ,&quot;Xref&quot;&gt; 8. Anap er en miljøfølsom fluorofor med en molekylvekt på 272,3 g / mol og er bare litt større enn tryptofan 12 ( figur 1A, 1B ). På grunn av sin lille størrelse er det mindre sannsynlig at færre steriske effekter vil bli introdusert av fluoroforen sammenlignet med konvensjonelle fluorforer festet via en linker (typisk over 500 g / mol). Videre, når det gjelder Anap, ligger fluoroforen nærmere proteinprotein enn de som er koblet til cystein, og følgelig søker Anap flere lokaliserte omlegginger. Til slutt, fjerning av endogene cysteiner i konvensjonell VCF for å sikre områdespesifikke merking er ikke lenger et krav i UAA-VCF og derfor (i) etterlater proteiene i (nesten) deres opprinnelige tilstand og (ii) tillater VCF å bli anvendt Å studere et bredere spekter av proteiner hvor funksjonen kan endres ved cysteinsubstitusjon. <img alt="Figur 1" srC = &quot;/ files / ftp_upload / 55598 / 55598fig1.jpg&quot; /&gt; Figur 1 : Anap og fluorescensspektra. ( A ) Kjemisk struktur av Anap. ( B ) Normalisert absorpsjonsspektrum og utslippspektra for 1 nM Anap, som demonstrerer følsomheten av Anap fluorescens til løsningsmiddelhydrofobiciteten. Utslippsspektra ble oppnådd ved spennende ved 350 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55598/55598fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a> En ulempe ved bruk av fluorescerende UAAer er at en heterogen populasjon av proteiner kan skyldes stoppkodon-gjennombrudd, translasjonsinitiering, C-terminale avkortede proteiner eller crosstalk med endogen aminoacylering dersom mengden av aminoacylerte tRNAer er knappe. Et slikt lekkasjeuttrykk bør alltid kontrolleres i fravær av fUAA og tRNA / tRNA syntetaseparet. Vi tok opp spørsmålet om transLational reinitiation og hvordan å omgå den for N-terminale innføringssteder tidligere 14 . Men når fUAA, tRNA og tRNA syntetase er tilstede i mettede mengder, forblir det bare en liten sannsynlighet for lekkasjeekspresjon. Den sentrale prosessuelle forskjellen mellom fUAA-VCF og konvensjonell VCF er injeksjon og håndtering av oocytene; Injeksjonen av DNA som koder for tRNA og tRNA-syntetase (pAnap) følges av introduksjonen av Anap, som enten er co-injisert med protein-mRNA eller alternativt tilsatt til inkubasjonsoppløsningen som en acetoksymetyl (AM) ester.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="567">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Solutions</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:96px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barth&#39;s solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>90mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td>3mM</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-9397</td>
			<td>0.82mM</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-7902</td>
			<td>0.41mM</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Ca(NO3)2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-1396</td>
			<td>0.33mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>5mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaOH hydrate</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH7225-4</td>
			<td>pH 7.6</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicilin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100U/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100&#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15160054</td>
			<td>10mg/100mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Horse serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16050122</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SOS Standard Oocyte Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>102 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436</td>
			<td>3 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">External recording solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-methyl-D-glucamine (NMDG)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L14282</td>
			<td>115mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239232</td>
			<td>2mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td>pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Internal recording solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-methyl-D-glucamine (NMDG)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L14282</td>
			<td>115mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E478-500</td>
			<td>2mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td>pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Labeling solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250-1</td>
			<td>115mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239232</td>
			<td>2mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td>pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TMR stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMR)</td>
			<td>Molcular Probes by Life Technologies</td>
			<td>T6027</td>
			<td>5mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anap stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">Anap</td>
			<td>ABZENA (TCRS)</td>
			<td>Custom synthesis TCRS-170</td>
			<td style="width:96px;">1mM in nuclease-free water and 1% NaOH 1N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pAnap</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>48696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Performance Oocyte Clamp</td>
			<td>Dagan Corporation</td>
			<td>CA-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gpatch Acquisition software</td>
			<td colspan="3">Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Analysis software</td>
			<td colspan="3">Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Recording Chamber</td>
			<td colspan="2">Custom machined</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Photo diode detection system</td>
			<td>Dagan Corporation</td>
			<td>PhotoMax-200/PIN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electrical shutter driver</td>
			<td>UNIBLITZ</td>
			<td>VCM-D1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

voltage-clamp fluorometry in xenopus oocytes using fluorescent unnatural amino acids

Spenningsklemme Fluorometri (VCF) har vært den valgte teknikken for å undersøke strukturen og funksjonen til elektrogenmembranproteiner der sanntidsmålinger av fluorescens og strømmer samtidig rapporterer om lokale omarrangementer og global funksjon, henholdsvis 1 . Mens høyoppløselige strukturteknikker som kryo-elektronmikroskopi eller røntgenkrystallografi gir statiske bilder av proteiner av interesse, gir VCF dynamiske strukturelle data som gjør at vi kan knytte strukturelle omarrangementer (fluorescens) til dynamiske funksjonsdata (elektrofysiologi). Inntil nylig ble den tiol-reaktive kjemi som ble brukt til stedstyrt fluorescerende merking av proteiner, begrenset omfanget av tilnærmingen fordi alle tilgjengelige cysteiner, inkludert endogene, vil bli merket. Det ble således pålagt å konstruere proteiner fri for endogene cysteiner. Merking ble også begrenset til steder som er tilgjengelige fra det ekstracellulæreside. Dette endret seg ved bruk av fluorescerende unaturlige aminosyrer (fUAA) for spesifikt å inkorporere en liten fluorescerende probe som svar på stoppkodonundertrykkelse ved bruk av et ortogonalt tRNA og tRNA syntetasepar 2 . VCF-forbedringen krever bare en to-trinns injeksjonsprosedyre av DNA-injeksjon (tRNA / syntetasepar) etterfulgt av RNA / fUAA co-injeksjon. Nå er det mulig å merke både intracellulære og begravede steder, og bruken av VCF har utvidet seg betydelig. VCF-teknikken blir dermed attraktiv for å studere et bredt spekter av proteiner og - enda viktigere - tillater det å undersøke mange cytosoliske regulatoriske mekanismer.

Figur 4 viser et eksempel på VCF-opptak hentet fra en oocyt-uttrykkende Shaker-kanal med hurtig inaktivering fjernet (IR), L382stop-W434F i nærvær av pAnap og Anap. W434F-mutasjonen blokkerer ioniske kaliumstrømmer, noe som gjør det mulig å måle transientgassladningsforskyvningene (gatingstrømmene). Samtidige opptak av gatingstrømmer (øvre spor) og Anap fluorescensintensitetsendringer (lavere spor) ved depolarisering demonstrerer vellykket innlemmelse av Anap i...

Watch this Scientific Journal Video about Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids at JoVE.com

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Denne artikkelen beskriver en forbedring av konvensjonell spenningsklemme-fluorometri (VCF) der fluorescerende unaturlige aminosyrer (fUAA) brukes i stedet for maleimidfarger, for å undersøke strukturelle omarrangementer i ionkanaler. Prosedyren inkluderer Xenopus oocyt DNA-injeksjon, RNA / fUAA myntutjaging, og samtidige strøm- og fluorescensmålinger.

Spenningsklemme Fluorometri i<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocytter ved hjelp av fluorescerende unaturlige aminosyrer

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

A Polyaniline-based Sensor of Nucleic Acids

En Polyanilin-baserte sensor av nukleinsyrer

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies ...

An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

En optimalisert protokoll for Elektro Mobility Skift Assay bruker infrarød Fluorescent Dye-merkede oligonukleotider

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identifisering av fettsyrer i<em&gt; Bacillus cereus</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

DNA Polymerase aktivitet analysen med nær-infrarøde fluorescerende merket DNA visualisert ved akrylamid Gel geleelektroforese

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Rekonstituering i cellen syklus svingninger i mikroemulsjoner Cell-free Xenopus egg ekstrakter

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Strukturen løsning av fluorescerende Protein Cerulean bruker MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluorescerende sølv farging av proteiner i polyakrylamid Gels

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enkelt Liposome mål for studiet av Proton pumpe membran enzymer elektrokjemi og fluorescerende mikroskopi

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

Identifisere amino acid Overproducers bruke rare-Codon-Rich markører

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Lokalisering av SUMO-modifisert proteiner bruke fluorescerende Sumo-fangst proteiner

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...